專利名稱：一種酸性淀粉酶amya4及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種酸性淀粉酶AMYA4及其基因 和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
α-淀粉酶(α-amylase)是目前最重要的工業(yè)酶制劑之一，廣泛地存在于動(dòng)植物 和微生物中，它是一種內(nèi)切葡萄糖苷酶，按照國(guó)際酶委會(huì)(Enzyme Commission)的標(biāo)準(zhǔn)為 EC3.2. 1. 1。α-淀粉酶作用于淀粉時(shí)，從淀粉分子內(nèi)部任意切開(kāi)α-1，4鍵，使淀粉分子迅 速降解，生成糊精和還原糖。α-淀粉酶作用于淀粉通常使淀粉失去碘的成色反應(yīng)。在水解 直鏈淀粉時(shí)，α-淀粉酶隨機(jī)切開(kāi)α _1，4鍵，使淀粉水解成低聚麥芽糖和寡糖，然后再水解 成麥芽糖和葡萄糖。在以支鏈淀粉為底物時(shí)，α-淀粉酶可以隨機(jī)切開(kāi)α-1，4鍵，但是不 能切開(kāi)α-1，6鍵和緊靠的α _1，4鍵，因此水解產(chǎn)物中除麥芽糖和葡萄糖外，還含有一部分 極限糊精(Penayanez et al.，1963 ；尤新，1997)。α -淀粉酶水解淀粉的產(chǎn)物末端葡萄糖 殘基Cl碳原子的光學(xué)性質(zhì)呈為α _構(gòu)型，故稱α -淀粉酶(尤新，1997)。α -淀粉酶是目 前最重要的工業(yè)酶制劑之一，在味精、飴糖、麥芽糖醇、糊精、葡萄糖、酒精、啤酒、乳酸、檸檬 酸等工業(yè)中發(fā)揮著巨大作用。由于一些細(xì)菌α-淀粉酶具有耐高溫、耐酸、耐堿等特性，更 符合工業(yè)生產(chǎn)中的各種極端條件，因此當(dāng)今廣泛使用的α-淀粉酶多數(shù)是來(lái)源于細(xì)菌(解 淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌)的淀粉酶，尤其是在需高溫的發(fā)酵等工業(yè)中使用最為廣泛 的是細(xì)菌高溫α-淀粉酶。α _淀粉酶是一種十分重要的酶制劑，是食品工業(yè)中用量最大的酶類之一。α _淀 粉酶以其優(yōu)良的性能大量應(yīng)用于糧食加工、食品工業(yè)、釀造、發(fā)酵、造紙、紡織品工業(yè)和醫(yī)藥 行業(yè)等，它曾經(jīng)占了整個(gè)酶制劑市場(chǎng)份額的半壁河山。在傳統(tǒng)的淀粉制糖工藝中，以精制淀粉或大米等為原料，通常應(yīng)用酸水解法制葡 萄糖，由于需要高溫、高壓和酸催化劑，因此在生產(chǎn)葡萄糖的同時(shí)，必定伴有葡萄糖的復(fù)合 分解反應(yīng)，產(chǎn)生一些不可發(fā)酵性糖及其一系列有色物質(zhì)，這不僅降低淀粉轉(zhuǎn)化率，而且由于 生產(chǎn)的糖液質(zhì)量差，對(duì)后續(xù)的精制帶來(lái)不利影響，同時(shí)大量酸的使用也對(duì)環(huán)境帶來(lái)了很大 的污染。利用雙酶法制糖是以作用專一的酶制劑作為催化劑，反應(yīng)條件溫和，復(fù)合分解反應(yīng) 較少，因此采用雙酶法生產(chǎn)葡萄糖，提高了淀粉或大米等原料的轉(zhuǎn)化率及糖液濃度，改善了 糖液質(zhì)量，是目前最為理想的制糖方法。酶液化和酶糖化工藝稱為雙酶法(尤新，1997)。雙酶法制糖淀粉轉(zhuǎn)化率高，噸糖成本低，糖的濃度高，糖液質(zhì)量高，因此，在味精等 發(fā)酵工業(yè)中被廣泛采用。然而目前工業(yè)上應(yīng)用的是高溫淀粉酶和中溫糖化酶。高溫淀粉酶 的最適作用溫度為95°C，而中溫糖化酶的最適作用溫度為60°C，同時(shí)他們的最適ρΗ值也不 相同。高溫淀粉酶的最適PH值通常在6. 0-6. 5，而糖化酶的最適pH值通常在4. 0-4. 5。在 雙酶法制糖工藝中，淀粉溶解后PH通常在4-5左右，因此需要反復(fù)調(diào)整pH值和溫度，造成 了生產(chǎn)的復(fù)雜性和環(huán)境問(wèn)題(Liu and Xu，2008)。α -淀粉酶已經(jīng)成為工業(yè)應(yīng)用中最為重 要的酶之一，但是酶的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)仍然局限于幾種特定的真菌和細(xì)菌中。對(duì)于高效的α-淀粉酶的需求越來(lái)越多。目前來(lái)源于脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus)屬的多個(gè)α-淀粉酶基因已經(jīng) 被純化，克隆和表達(dá)了。比如來(lái)源于Alicyclobacillus acidocaldarius的α -淀粉酶 (Matzke etal.，1997 ；Schwermann et al.，1994 ；Yuan et al. ,2005) 它們的性質(zhì)都屬于 酸性，耐熱α-淀粉酶。目前對(duì)于可以降解生淀粉的淀粉酶的研究也越來(lái)越多，已經(jīng)分離和純化了多個(gè)降 解生淀粉的淀粉酶。Hayashida等(1986)從Aspergillus f icum中純了得到一個(gè)生淀粉淀 粉酶；Hayashida等(1988)隨后又從Bacillus subtilis中純了得到一個(gè)生淀粉淀粉酶， 后來(lái)陸續(xù)的生淀粉水解淀粉酶被分離，純化或克隆出來(lái)(Gangadharan et al.，2009 Jeang et al. ,2002 ；Jeang et al. ,1995 ；Kim et al. ,1990 ；Kim et al. ,1989 ；Saha et al., 1988)。然而報(bào)導(dǎo)的來(lái)源于脂環(huán)酸芽孢桿菌屬的淀粉酶并沒(méi)有降解生淀粉的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能高效應(yīng)用的酸性淀粉酶。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述酸性淀粉酶的基因。本發(fā)明的另一目的提供上述酸性淀粉酶的應(yīng)用。本發(fā)明從CN200910235943. 1 (
公開(kāi)日2010. 05. 05)所公開(kāi)的脂環(huán)酸芽孢桿 菌Alicyclobacillus hesperidum A4，(保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號(hào)為 CGMCCNo. 3147，保藏日期2009年6月29號(hào))中分離得到一種新的酸性淀粉酶AMYA4。根據(jù)本發(fā)明的酸性淀粉酶AMYA4，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。SEQ ID NO. 1 MNDAMFICLSQLCKRLHRQTTLFTPLHTRIDACGKTTQRGIFVGQIKKTTIAALIALSAALPTAGSVKPVLADANDSTPSIQITSGNDAKAGVASDTLTVAVSGMDIVGTTPDVTLAGADGSTRNLTTDTTVADNSTLHVELPMGDSGLGAGTYTLTVSAGGASASATLTIEPYTSASTIQffDGIYTDDSATYVSIPNPSPGQNVTIRLRAYSGNLTKVVLKAYDTAQSKSFDVEMAPTSTFGPYQLWSATVPASNGGTIYYRFDLYDDNDFACLSGDGLHTSDDTNQNFPLPVGAVTLSTTDANP⑶TVTASDPVGDFSGSGQSQTTVNFLDQSGNVVATTTGSNASWSSVDFTVPKDVPNGLYTVDLDTTAKDADGVTNVSLDRQVP
LLVGPEPAWMQSFYHDSYSSFYRSPFGAVATGTPVILRLRGPVDLKSALLRLWGANGNGSELDLPMQPLAMSATEIEQATGTPDATQYSWWTVTIPASDVTTAGTMWYQFAGQLASGQTVYYDDNGNQLEGPGQPSFSAGGPSYQLSVYNQGFTTPDWLKHAVIYEIMPDRFYNGDIANDENPKTQKGIYTDAVGQETLGPIQFHQDWNSQPYDPNIPASSDPAIQALRGNGQWNIDFFG⑶LKGIQDKLDYLKSLGVNTLYLMPVFEAESNHKYDTADYMKIDPGFGTAQDWLNLAKAAHADGFHILLDGVFEDTGSDSVYFNKFS匪GSLGAWQAYMQNQPNLSPYYSWYEffTNNPANPYNGffffNNDTLPQTDTNNPSFQQFIYGGKDAVAKHWLALGADGWRLDSADNSNYNVTWWSNFRNAVKSIDPNAAIVGEIWNTATNDNGTDWLTGSTFDSVMNYSFRNAVIDFFRGTYNDGSVQHHAVDAAGFNQELMRLYSEYPLQSFYAMMNLVDSQDTMRILTVLENAPEPGSMSALQQATY
QPTATDQQLGIKRLELVSDLQFGFPGDPTIWY⑶EAGVSGYSDPLSRDTYPWGHENEALLNHYRLLGAIRAANPVLQTGTFTPVYAQGEVYAFARTIQGGQDVFGKPAADASAIVALNNQNQTQTVNLPVAGVIANGTKLLDELNDQWYTVENGAVQLTLAPYEGAILVTPTANPVAYLQTINGQTSIAWTPVAGANGYLLLRHQ⑶VWVPVGRPLSANTLSSPVTQGATAVDYAIAALPPVAPGVGLSSGQPLQAVTVPAASLGQPQVQVDVQHSGVSLHITPVPNATQYVVYLQQPDGSYQAVATVAAHGDVHLRLPVAPGTQSISVRVAAQNEDGQAVTDPMVITVNPSAKAQR該酶包括1290個(gè)氨基酸，因此淀粉酶AMYA4的理論分子量為138kDa。本發(fā)明的淀粉酶AMYA4在酸性范圍內(nèi)均具有較高活性，純化后其最適pH值為4. 2， 在pH 2. 8 4. 2的范圍內(nèi)維持80%以上的酶活性；在pHl. 2 7. 8的范圍內(nèi)37°C保溫60 分鐘，能夠保持80%以上的酶活性。最適溫度為75°C，在55°C -80°C間均具有50%以上的 酶活力；在75°C保溫60分鐘，剩余酶活達(dá)到80%以上。另外，該酶還具有水解生淀粉的能 力。這種性質(zhì)的淀粉酶還未曾有過(guò)報(bào)道。本發(fā)明提供了編碼上述酸性淀粉酶AMYA4的基因。具體地，該基因的基因序列如 SEQ IDNO. 2 所示SEQ ID NO. 2 ATGAATGATGCAATGTTCATATGCCTCAGTCAGTTGTGCAAACGATTGCACAGACAAACCACTCTCTTCACACCATTGCACACCCGCATCGACGCTTGTGGCAAAACAACACAAAGGGGGATTTTTGTGGGCCAAATCAAGAAAACGACCATCGCAGCACTCATCGCCCTGTCCGCGGCTCTGCCAACAGCCGGTTCCGTAAAGCCAGTGCTCGCGGATGCAAACGATTCGACACCATCCATCCAAATTACGTCGGGAAACGACGCTAAGGCTGGCGTGGCGAGTGACACCCTCACCGTCGCCGTGAGTGGTATGGACATTGTCGGAACCACCCCAGACGTCACCTTGGCAGGCGCAGACGGCTCGACGCGCAATCTCACGACCGACACGACCGTCGCGGACAATTCGACACTGCATGTCGAATTGCCCATGGGGGACAGTGGTTTAGGGGCGGGCACGTATACCCTGACGGTCTCT
GCTGGTGGCGCCAGCGCATCCGCGACGCTCACCATTGAGCCGTACACCAGCGCAAGCACCATTCAGTGGGACGGTATCTACACGGACGATTCTGCAACCTACGTTTCGATCCCCAATCCAAGCCCGGGGCAAAACGTCACCATTCGCCTTCGCGCCTACAGCGGCAATTTGACCAAAGTCGTGCTGAAGGCGTACGACACTGCACAGAGCAAATCGTTTGACGTCGAAATGGCGCCGACGTCGACGTTTGGCCCTTATCAGTTGTGGTCGGCGACTGTGCCGGCGTCGAATGGAGGTACCATCTATTATCGGTTTGACCTGTATGATGACAATGACTTCGCTTGTCTTTCCGGCGATGGTCTGCACACAAGCGACGACACGAATCAAAACTTCCCCCTCCCTGTAGGCGCTGTGACGCTGTCCACAACCGACGCAAATCCAGGAGACACGGTGACGGCCTCCGATCCCGTAGGGGATTTCTCGGGCAGCGGCCAGAGCCAAACGACCGTCAACTTCCTTGACCAAAGCGGGAACGTCGTCGCAACGACGACCGGATCAAACGCAAGCTGGTCGAGTGTCGATTTCACAGTGCCAAAAGATGTACCCAACGGACTCTACACGGTCGATCTCGATACCACCGCGAAAGACGCGGATGGTGTGACAAACGTCTCGCTGGATCGGCAGGTGCCACTTTTGGTCGGTCCGGAACCAGCCTGGATGCAGAGCTTTTACCACGACTCGTACA
GTTCGTTTTATCGCAGTCCGTTTGGTGCTGTGGCCACCGGCACACCCGTGATCCTGCGCCTGCGTGGACCTGTAGATTTAAAATCGGCGCTCCTTCGGCTATGGGGTGCAAACGGAAACGGGTCTGAACTCGACTTGCCGATGCAGCCACTCGCGATGTCCGCTACGGAGATCGAACAGGCAACAGGCACGCCCGATGCTACACAATACAGTTGGTGGACCGTGACCATCCCCGCCTCCGATGTGACCACTGCGGGAACCATGTGGTATCAGTTCGCAGGACAACTGGCAAGCGGCCAAACCGTGTACTACGACGACAACGGAAACCAGCTGGAGGGCCCTGGCCAACCGAGCTTTTCTGCCGGCGGGCCCAGCTATCAGTTATCTGTCTATAACCAAGGATTTACGACACCCGACTGGTTGAAACATGCGGTCATCTACGAGATTATGCCGGATCGATTCTACAACGGCGACATAGCGAACGACGAAAATCCAAAGACGCAAAAGGGTATCTACACCGATGCCGTTGGTCAGGAAACGCTGGGTCCTATTCAATTTCATCAGGATTGGAATAGTCAACCATATGATCCAAACATCCCAGCTTCCAGCGATCCAGCCATCCAGGCCCTGCGTGGCAACGGTCAATGGAACATCGACTTTTTCGGTGGCGACCTGAAGGGAATTCAGGATAAGCTCGATTACCTAAAAAGCCTTGGCGTCAATACCCTTTATCTCATGCCTGTGTTTGAGGCCGAGTCCAATCATAAATACGACACGGCCGATTACATGAAGATCGATCCGGGGTTTGGCACCGCCCAGGACTGGCTGAACCTCGCAAAGGCTGCCCATGCAGACGG
ATTTCACATCCTCCTGGACGGCGTGTTTGAAGACACCGGATCGGACAGCGTGTATTTCAACAAATTCAGCAACATGGGTAGCCTTGGCGCCTGGCAGGCCTATATGCAGAATCAACCGAATCTCTCGCCCTACTATAGCTGGTACGAGTGGACCAACAACCCAGCGAATCCGTACAACGGCTGGTGGAACAACGACACGTTGCCGCAGACAGATACGAATAACCCGTCATTTCAGCAATTTATTTACGGCGGCAAAGACGCCGTCGCGAAACACTGGTTGGCGCTTGGCGCCGATGGCTGGCGCCTCGATTCGGCGGACAACAGCAACTATAACGTCACTTGGTGGAGCAATTTCCGCAACGCCGTAAAATCTATTGAT0C CTAACGCAGCAATCGTCGGGGAAATATGGAACACTGCGACAAACGACAACGGCACGGACTGGCTCACCGGATCGACCTTCGACAGCGTCATGAATTACTCATTTCGCAACGCCGTGATCGACTTTTTCCGTGGAACGTACAACGACGGAAGCGTCCAACATCACGCGGTCGACGCGGCGGGATTCAACCAGGAACTGATGCGCCTGTACAGCGAGTATCCTTTGCAGTCGTTCTACGCGATGATGAACCTCGTCGACTCCCAAGATACGATGCGGATTTTGACGGTTCTCGAAAACGCGCCCGAGCCAGGCTCCATGAGCGCCTTGCAACAGGCCACCTACCAGCCCACGGCAACCGATCAACAACTGGGTATCAAGCGCTTAGAGCTCGTGTCTGACCTGCAGTTTGGCTTCCCGGGCGACCCGACCATCTGGTATGGTGACGAAGCGGGCGTTTCGGGTTACAGTGATCCGTTGTCCCGTGACACGTACCCATGGGGCCATGAAAATGAGGCCCTGCTCAACCACTATCGCTTGCTTGGCGCGATTCGCGCGGCCAACCCCGTGCTGCAAACCGGCACGTTTACGCCCGTTTACGCCCAAGGCGAGGTCTATGCGTTCGCACGCACCATCCAAGGTGGCCAGGACGTATTTGGCAAACCCGCAGCCGATGCGTCGGCGATTGTGGCATTGAACAACCAAAACCAAACGCAAACCGTGAACCTTCCGGTTGCGGGCGTGATCGCCAATGGAACGAAGCTTCTGGACGAACTCAACGACCAATGGTACACCGTGGAGAACGGGGCTGTGCAGTTGACGCTGGCGCCATACGAAGGTGCTATTCTGGTCA
CGCCCACAGCGAATCCTGTCGCATACCTGCAGACAATCAATGGGCAAACCTCGATTGCCTGGACGCCGGTTGCTGGGGCGAACGGATACTTGTTGCTGCGACACCAAGGCGATGTATGGGTACCCGTAGGCCGCCCGCTTTCGGCGAACACGCTGTCTTCGCCGGTAACCCAAGGTGCAACCGCCGTCGACTATGCGATTGCGGCCCTGCCACCCGTGGCACCAGGCGTCGGCCTTAGCTCGGGCCAACCGCTACAGGCGGTTACGGTGCCGGCCGCATCCCTCGGTCAGCCCCAAGTGCAAGTGGATGTACAGCATAGCGGGGTCAGTCTGCACATCACACCGGTGCCAAACGCGACACAATATGTCGTCTATCTACAACAGCCCGATGGATCTTATCAGGCCGTCGCAACCGTGGCGGCACATGGCGATGTCCACCTCAGGTTGCCTGTGGCGCCTGGAACACAGTCCATATCCGTCCGCGTGGCGGCGCAAAATGAAGACGGCCAGGCTGTGACCGATCCGATGGTGATTACGGTAAATCCATCCGCCAAAGCACAGCGCTAA本發(fā)明通過(guò)PCR的方法分離克隆了淀粉酶基因AMYA4，DNA全序列分析結(jié)果表明， 淀粉酶AMYA4結(jié)構(gòu)基因AMYA4全長(zhǎng)3873bp，含有一個(gè)終止子TAA。淀粉酶AMYA4的成熟蛋 白理論分子量為138kDa。將淀粉酶基因AMYA4序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列在GenBank中進(jìn) 行 BLAST 比對(duì)。該基因與來(lái)源于 Alicyclobacillusacidocaldarius 的淀粉酶(CAA44638 |) 氨基酸序列最高一致性為63%，說(shuō)明AMYA4是一種新的淀粉酶。本發(fā)明還提供了上述酸性淀粉酶AMYA4的應(yīng)用。本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、 適合于在食品，特別是雙酶法制糖工藝中應(yīng)用的新淀粉酶。本發(fā)明的淀粉酶最適PH為4. 2， 在PH2.8 4.2的范圍內(nèi)都有較高的酶活性(80%以上)；酸性條件下pH穩(wěn)定性好，具有 很強(qiáng)的生淀粉降解能力。最適pH為4. 2與目前工業(yè)上應(yīng)用的中溫糖化酶相近，因此可以不 用反復(fù)調(diào)整淀粉醪的PH，降低糖化過(guò)程中酸堿的使用量，其最適作用溫度為75°C，與中溫 糖化酶的最適作用溫度相近，可以不用反復(fù)調(diào)整淀粉醪的的糖化溫度，因此可以降低能耗， 其在55-75°C范圍內(nèi)都具有很高的活性，同時(shí)具有很強(qiáng)的生淀粉降解能力，可以使淀粉醪不 用經(jīng)過(guò)前期的糊化和液化過(guò)程，使工藝流程更簡(jiǎn)單，能耗消耗更低。在模擬雙酶法制糖工藝 中，無(wú)論是以糊化淀粉為底物還是以生淀粉為底物，在配合商業(yè)化糖化酶的作用下，都可以 達(dá)到很好的水解率，這預(yù)示著AmyA4巨大的應(yīng)用潛力。


圖1原酶純化的淀粉酶的SDS-PAGE分析，其中，1 低分子量蛋白質(zhì)Marker ；2:純化的重組淀粉酶。圖2純化淀粉酶的最適pH。圖3純化淀粉酶的pH穩(wěn)定性。圖4純化淀粉酶的最適溫度。圖5純化淀粉酶的熱穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式試驗(yàn)材料和試劑1、菌株及載體脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus hesperidum A4，保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研 究所，100101)，其保藏號(hào)為CGMCCNo. 3147。2、酶類及其它生化試劑內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司，連接酶購(gòu)自Invitrogen公司。 可溶性淀粉購(gòu)自Sigma公司，其它都為國(guó)產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購(gòu)買(mǎi)得到)。3、培養(yǎng)基脂環(huán)酸芽孢桿菌AlicyclobacillushesperidumA4CGMCC3147產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為0. 2%蛋白胨、0. 酵母提取物、0. 5%可溶性淀粉，pH3. 0.說(shuō)明以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書(shū)中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 進(jìn)行。實(shí)施例1 脂環(huán)酸芽孢桿菌 AlicyclobacillushesperidumA4(CGMCCNo. 3147)淀粉 酶編碼基因AMYA4的克隆基因序列的獲得根據(jù)脂環(huán)酸芽孢桿菌屬已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的淀粉酶基因序列，參照上述純化淀粉酶的質(zhì)譜 序列(GNGQWNIDFFGGDLK，HWLALGADGW)，直接設(shè)計(jì)特異性引物AF和AR，以脂環(huán)酸芽孢桿菌 Alicyclobacillus hesperidum A4 (CGMCC No. 3147)總 DNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反 應(yīng)參數(shù)為94°C變性5min，60°C退火30sec，72°C延伸1. 5min。最后72°C保溫lOmin。得到 一約480bp片段，將該片段回收后與PEASY-T3載體相連送三博生物技術(shù)有限公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序得到的核甘酸序列，設(shè)計(jì)上游和下游各三條TAIL-PCR特異性嵌套引物 設(shè)計(jì)方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域方向，并將它們分別命名為uspl，usp2, usp3(上游特異性 引物)，dspl，dsp2, dsp3(下游特異性引物)見(jiàn)表1。表1.淀粉酶AMYA4TAIL-PCR特異性引物 通過(guò)TAIL-PCR得到已知基因序列的側(cè)翼序列，擴(kuò)增得到產(chǎn)物回收后測(cè)序。通過(guò)比較淀粉酶的基因組序列后發(fā)現(xiàn)該基因全長(zhǎng)3873bp，編碼1290個(gè)氨基酸和 一個(gè)終止密碼子。所推測(cè)出的基因AMYA4的氨基酸序列與GeneBank上的淀粉酶基因序列 進(jìn)行同源比較，最高一致性為63%，說(shuō)明AMYA4是一種新的淀粉酶，表明從Alicyclobacill ushesperidumA4(CGMCCNo. 3147)中分離克隆得到的編碼淀粉酶的基因?yàn)樾禄?。提取脂環(huán)酸芽孢桿菌AlicyclobacillushesperidumA4(CGMCCNo. 3147)基因組 DNA 將液體培養(yǎng)2天的菌液離心取菌體，加入ImL溶菌酶，37°C處理60min，再加入裂 解液，65°C水浴鍋裂解30min，每隔IOmin混勻一次，在4°C下IOOOOrpm離心5min。取上 清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后，4°C下 IOOOOrpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解， 置于-20°C備用。實(shí)施例2純化淀粉酶的活性分析從Alicyclobacillus hesperidum A4中分離純化酸性淀粉酶AMYA4的方法，包括 以下步驟1)在種子培養(yǎng)基55°C搖振培養(yǎng)48小時(shí)后，的接種量至產(chǎn)酶培養(yǎng)基，55°C、 200rpm振培養(yǎng)48小時(shí)后，將菌液離心，取上清用于純化；2)培養(yǎng)物離心取上清大約101，然后冰浴下通過(guò)6K的中空纖維超濾膜到大約 600ml，再用5K的超濾膜包進(jìn)一步濃縮至200ml ；3)去上述濃縮液IOml在緩沖液A (20mmol/L檸檬酸_Na2HP04pH 3. 5)中過(guò)夜透 析，陽(yáng)離子交換層析取2. OmL濃縮液上預(yù)先用緩沖液A平衡的HiTrap SP XL陽(yáng)離子柱， 然后用含有1. Omol/L NaCl緩沖液B和緩沖液A進(jìn)行梯度洗脫，洗脫條件為8個(gè)柱長(zhǎng)體積
9(0-100% )，流速2. OmL/min。每管1. OmL進(jìn)行分部收集。DNS法具體方法如下在pH 4. 2 (0. IM磷酸二氫鈉-檸檬酸)，75 °C條件下， ImL的反應(yīng)體系包括100 μ L適當(dāng)?shù)南♂屆敢汉?00 μ L(1 %，w/v)底物，反應(yīng)lOmin，加入 1.5mLDNS終止反應(yīng)，沸水煮5min。冷卻后540nm測(cè)定OD值。1個(gè)酶活單位(U)定義為在給 定的條件下每分鐘釋放出Iymol還原糖的酶量。純化后的淀粉酶進(jìn)行了胰蛋白酶的酶解 反應(yīng)，通過(guò)MALDI-TOF-MS分析，獲得了 3段內(nèi)肽的氨基酸序列，序列分別為=NH2-G-N-G-Q-W -N-1-D-F-F-G-G-D-L-K, NH2-H-W-L-A-L-G-A-D-G-W 和 NH2-N-A-V-I-D-F_F-R。利用軟件查 詢AlicyclobacillushesperidumAA基因組序列、蛋白質(zhì)庫(kù)獲得了基因序列，證明純化后的 淀粉酶為本發(fā)明酸性淀粉酶AMYA4。實(shí)施例3純化淀粉酶AMYA4的性質(zhì)測(cè)定1、純化淀粉酶AMYA4的最適pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定方法如下將實(shí)施例2純化的淀粉酶在不同的pH下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測(cè)定其最適pH。底物可 溶性淀粉用不同PH的緩沖液(0. lmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉pH 3. 0-7. 4 ；0. IMTris-HCl PH 7. 8-8. 6 ;0. IM甘氨酸-氫氧化鈉pH 9. 0-11. O ；)、在75°C下進(jìn)行淀粉酶活力測(cè)定。結(jié) 果(圖2)表明其最適作用pH為4.2，在pH 3. 8 5. 8保持70%以上的相對(duì)酶活性。該酶 最穩(wěn)定的pH范圍為3. O 10. 0，37°C作用2h，酶活力保持在85%以上。淀粉酶的最適作用 溫度及熱穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。2、淀粉酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定方法如下淀粉酶的最適溫度的測(cè)定為在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH4. 2)緩沖液體系及 不同溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)。耐溫性測(cè)定為淀粉酶在不同溫度下處理不同時(shí)間，再在75°C下 進(jìn)行酶活性測(cè)定。酶反應(yīng)最適溫度測(cè)定結(jié)果(圖4)淀粉酶的最適作用溫度為75°C。該酶 能在75°C保持很好的穩(wěn)定性，在75°C下作用Ih后有90%以上的剩余活性，該酶在80°C下 作用lOmin，酶活性還能保留50%以上。3、不同金屬離子化學(xué)試劑對(duì)AmyA4酶活的影響測(cè)定如下在酶促反應(yīng)體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對(duì)酶活性 的影響，各種物質(zhì)終濃度為1和lOmmol/L。在75°C、pH4. 2條件下測(cè)定酶活性。結(jié)果(表 1)表明，大多數(shù)的金屬離子對(duì)淀粉酶的活性影響較小，Hg2+、Fe2+、Cu2+和SDS對(duì)該酶活性抑 制較嚴(yán)重。值得注意的是，與已報(bào)道的淀粉酶的活性都有Ca2+依賴性不同，Ca2+對(duì)AmyA4并 沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用。甚至在IOmM濃度時(shí)還有一定的抑制作用。表1各種化學(xué)試劑對(duì)淀粉酶AMYA4活力的影響
實(shí)施例4純化淀粉酶在模擬雙酶法制糖工藝中的水解實(shí)驗(yàn)對(duì)以AmyA4和商業(yè)化淀粉酶，糖化酶為研究對(duì)象，測(cè)試了熟化淀粉和生淀粉的轉(zhuǎn)化 率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2.表2模擬雙酶法制糖工藝結(jié)果
樣品1 先添加商業(yè)a-amylase在90°C，pH 6. 0作用2個(gè)小時(shí)，然后調(diào)節(jié)pH值至Ij
4. 2后然后添加入商業(yè)化糖化酶在60°C作用不同的時(shí)間；樣品2 首先添加AmyA4在60°C作用2個(gè)小時(shí)，然后添加入商業(yè)化糖化酶在60°C作用不同的時(shí)間；樣品3 同時(shí)添加AmyA4和 商業(yè)化糖化酶在一起，PH 4. 2，60°C作用不同的時(shí)間；樣品4 同時(shí)添加AmyA4和商業(yè)化糖化 酶在一起，PH 4. 2，60°C作用不同的時(shí)間。 結(jié)果表明，以AmyA4配合商業(yè)化糖化酶，以生淀粉為底物，可以達(dá)到96 %的轉(zhuǎn)化率。
權(quán)利要求
一種酸性淀粉酶AMYA4，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.—種酸性淀粉酶基因AMYA4，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的酸性淀粉酶AMYA4。
3.如權(quán)利要求2所述的酸性淀粉酶基因AMYA4，其特征在于，其堿基序列如SEQIDNO. 2 所示。
4.包含權(quán)利要求2所述的酸性淀粉酶基因AMYA4的重組載體。
5.包含權(quán)利要求2所述的酸性淀粉酶基因AMYA4的重組菌株。
6.如權(quán)利要求5所述的重組菌株，其特征在于，所述菌株為酵母菌、大腸桿菌、曲霉、芽 孢桿菌或乳酸桿菌。
7.權(quán)利要求1所述酸性淀粉酶AMYA4的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種酸性淀粉酶AMYA4及其基因和應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的酸性淀粉酶AMYA4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。AmyA4其最適pH值為4.2，最適溫度為75℃，在55-75℃范圍內(nèi)都具有很高的活性，同時(shí)具有很強(qiáng)的生淀粉降解能力。這些酶學(xué)性質(zhì)非常符合雙酶法制糖的工藝要求，因此具有很大的應(yīng)用潛力。在模擬雙酶法制糖工藝中，無(wú)論是以糊化淀粉為底物還是以生淀粉為底物，在配合商業(yè)化糖化酶的作用下，都可以達(dá)到很好的水解率，這預(yù)示著AmyA4巨大的應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)C12P19/14GK101886064SQ201010219720
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月28日
發(fā)明者姚斌, 孟昆, 楊培龍, 柏映國(guó), 王亞茹, 石鵬君, 羅會(huì)穎, 袁鐵錚, 黃火清 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所