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應(yīng)答H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>的miRNA-1425及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):584554閱讀:257來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):應(yīng)答H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>的miRNA-1425及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種應(yīng)答H2O2的miRNA-1425及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
過(guò)氧化氫(H2O2)是一種雙功能分子,在植物體內(nèi)起雙重作用,既是一種毒性分子 能導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷,又是一種信號(hào)分子在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用(Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci. ,2002,7 405-410.; Mittler R, Vanderauwera S, Gollery Μ, Breusegem F V. Reactiveoxygen gene network of plants. Trends Plant Sci. ,2004,9 =490-498.) H2O2 的雙功能性決定了植物體內(nèi)必 然存在著H2O2相關(guān)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò),使它的濃度處于相對(duì)穩(wěn)態(tài)。在H2O2引起氧化脅迫的條件 下,網(wǎng)絡(luò)中許多基因或蛋白都會(huì)對(duì)H2O2產(chǎn)生應(yīng)答,自身的表達(dá)發(fā)生變化從而影響植物多種 生理活動(dòng),最終使植物對(duì)H2O2脅迫產(chǎn)生適應(yīng)。目前,轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)已經(jīng)揭示 出植物中相當(dāng)多的應(yīng)答H2O2的基因和蛋白,主要集中在細(xì)胞防御、氧化還原平衡等功能 (Vanderauwera S,Van Der Kelen K,Dat J,Gadjev I,Boonefaes T,Morsa S,Rottiers P,Slooten L,Van Montagu M,ZabeauM. et al. A comprehensive analysis of hydrogen peroxide-regulated geneexpression in tobacco.Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2003,100 16113-16118. ;Wan X Y,Liu J Y. Comparative proteome analysis reveals an intimate proteinnetwork provoked by hydrogen peroxide stress in rice seedling leaves. Mol. CellProteomics,2008,7 1469-1488. )。Wan等通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定出144個(gè) 在H2O2處理的水稻幼苗葉片中差異表達(dá)的蛋白,這些蛋白大多與細(xì)胞防御、氧化還原平衡、 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白合成和降解、光合成和光呼吸以及能量代謝相關(guān),通過(guò)這些差異表達(dá)的蛋白 以及它們的功能和參與的生理過(guò)程,構(gòu)建了水稻幼苗應(yīng)答H2O2的蛋白網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)闡明了 水稻幼苗葉片通過(guò)提高抗氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)和抑制代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)適應(yīng)氧化脅 迫(Wan X Y, Liu J Y. Comparative proteome analysis revealsan intimate protein network provoked by hydrogen peroxide stress in riceseedling leaves. Mol. Cell Proteomics,2008,7 :1469_1488.)。miRNA(microRNA,微小RNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度約為20_24nt的內(nèi)源單鏈非編碼小分子 RNA,在生物體中廣泛存在(Bartel D P. MicroRNAs genomics, biogenesis, mechanisms, and function. Cell, 2004,116 :281_297.)。近年來(lái)大量研究表明,miRNA參與調(diào)控植物生長(zhǎng) 發(fā)育以及應(yīng)答生物和非生物脅迫等許多重要生物學(xué)過(guò)程(Bushati N,Cohen S M. MicroRNA functions. Annu. Rev. Cell Dev. Biol.,2007,23 175-205.;金龍國(guó),王川,劉進(jìn)元.植物 MicroRNA.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2006,22 =609-614.)。因此,有理由相信miRNA — 定在植物應(yīng)答H2O2的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。但是,目前的植物應(yīng)答H2O2的相關(guān)研究主要集 中在基因和蛋白,還很少涉及到植物小分子RNA、特別是miRNA領(lǐng)域。植物中是否存在著應(yīng) 答H2O2的miRNA,這些miRNA的作用是什么,目前還沒(méi)有明確的答案。尋找和鑒定植物體內(nèi) 應(yīng)答H2O2的miRNA,對(duì)于完善植物H2O2相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),全面解析植物應(yīng)答H2O2的分子機(jī)制
3具有重要意義。水稻不僅是世界最重要的糧食作物之一,同時(shí)也是一種重要的模式生物,在植物 研究特別是單子葉植物研究中占有重要地位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)答H2O2的miRNA-1425及其應(yīng)用。本發(fā)明保護(hù)的miRNA-1425的序列如下(5,一 3,)UAGGAUUCAAUCCUUGCUGCU (序列表的序列 1)。本發(fā)明還保護(hù)序列1所示RNA在抑制PI3R蛋白基因(0sl0g0497300)表達(dá)中的應(yīng) 用;所述PI3R蛋白如序列表的序列2所示。所述Pra蛋白基因可如序列表的序列3自5’末 端第107至2491位核苷酸所示。所述PI3R蛋白基因也可如序列表的序列3所示。本發(fā)明還保護(hù)序列1所示RNA在促進(jìn)PI3R蛋白基因(0sl0g0497300)的mRNA降解 中的應(yīng)用;所述PI3R蛋白如序列表的序列2所示。所述Pra蛋白基因可如序列表的序列3 自5’末端第107至2491位核苷酸所示。所述Pra蛋白基因也可如序列表的序列3所示。序列表的序列1所示的RNA可用于水稻種質(zhì)改良。本發(fā)明采用國(guó)際上先進(jìn)的Solexa高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析、 Northern雜交、實(shí)時(shí)定量PCR等多種生物學(xué)手段,首次從基因組水平鑒定到應(yīng)答H2O2的 miRNA-1425,并且證實(shí)該miRNA在植物體內(nèi)調(diào)控的靶基因。H2O2脅迫下,miRNA-1425表 達(dá)上調(diào)抑制了細(xì)胞器形成,實(shí)際上起到了延緩生長(zhǎng)發(fā)育的效果,有利于植株適應(yīng)H2O2脅 迫。本發(fā)明將miRNA-1425的表達(dá)變化、靶基因的表達(dá)變化以及靶基因功能聯(lián)系起來(lái),發(fā)現(xiàn) H2O2脅迫下應(yīng)答H2O2的miRNA-1425主要是通過(guò)延緩生長(zhǎng)發(fā)育來(lái)幫助水稻幼苗適應(yīng)氧化脅 迫。植物應(yīng)對(duì)外界脅迫條件的有效策略之一是延緩生長(zhǎng)發(fā)育,這一措施不僅可以增加能量 儲(chǔ)備以更好地抵御脅迫,還能減少氧化損傷向新生細(xì)胞擴(kuò)散的危險(xiǎn)(May MJ, Vernoux Τ, Leaver C, Montagu M V,InzeD.Glutathione homeostasis in plants amplications for environmental sensing and plant development. J. Exp. Bot.,1998,49 :649_667.)。本發(fā)明揭示了應(yīng)答H2O2的miRNA-1425在植物應(yīng)對(duì)氧化脅迫所起的重要作用。將 miRNA-1425基因轉(zhuǎn)入水稻中過(guò)量表達(dá)或?qū)iRNA-1425基因缺失,就可能獲得在耐受氧化 脅迫能力方面有明顯變化的轉(zhuǎn)基因植株,并有望通過(guò)改造獲得對(duì)氧化脅迫、干旱、高鹽等有 較強(qiáng)耐受性的植株,造福于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。


圖1為Northern雜交檢測(cè)不同濃度H2O2處理的水稻幼苗中miRNA-1425的表達(dá)。圖2為miRNA-1425的的靶基因5’ RACE驗(yàn)證;序列上方的箭頭表示發(fā)生切割的位 點(diǎn),數(shù)值表示該切點(diǎn)處發(fā)生切割的克隆數(shù)與克隆總數(shù)比值。圖3為實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)靶基因的表達(dá);誤差桿表示相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明,但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法,如無(wú)特殊說(shuō)明,均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料,如無(wú)特殊說(shuō)明,均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。下述實(shí)施例中的%,如無(wú)特殊說(shuō)明,均為質(zhì)量百分含量。以下實(shí)施例中所用水稻品種均為秈稻品種93_ll(0ryza sativaL. ssp indica cv. 93-11),水稻種子購(gòu)自國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)保存中心(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所,郵 編100081聯(lián)系電話010-68919715)。該水稻品種已經(jīng)由中國(guó)北京基因組研究所完成基因
組測(cè)序工作。實(shí)施例l、miRNA_1425的發(fā)現(xiàn)一、H2O2 處理水稻種子經(jīng)表面消毒后,37°C浸泡24h,然后催芽萌發(fā)45h。萌發(fā)后將水稻轉(zhuǎn)移 到光照培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)箱條件設(shè)定為溫度28°C /21 V (白天16h/夜晚8h),光照強(qiáng)度 400μ mol/m2 · s,相對(duì)濕度70%,由Hogland營(yíng)養(yǎng)液提供水稻生長(zhǎng)所需的全部營(yíng)養(yǎng),營(yíng)養(yǎng)液 每2天更換一次。12天齡的水稻幼苗采用H2O2處理分別浸泡在0. 6mM、3. OmM和15. OmM H2O2水溶 液中,將浸泡在蒸餾水中的水稻幼苗作為對(duì)照;各種處理的幼苗同時(shí)置于25°C搖床中處理 6h。處理完畢后,將各個(gè)處理的水稻樣品按0. 5g分裝,液氮速凍后保存于-80°C備用。二、miRNA-1425 的發(fā)現(xiàn)1、RNA 提取將水稻樣品在液氮中研磨,用TRIZOL試劑盒(Invitrogen)提取總RNA,操作步驟 按TRIZOL試劑盒自帶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用Ultrospec 3000型紫外分光光度計(jì)(Amersham Biosciences)測(cè)定提取的RNA在260nm(OD26tl)和280nm(OD28tl)波長(zhǎng)的吸光度值以確定RNA 的純度和濃度。質(zhì)量合格的RNA濃度應(yīng)在1 μ g/ μ 1以上,OD260/OD280的比值在1. 8-2. 0之 間,且經(jīng)電泳檢測(cè)條帶清晰,無(wú)明顯降解和DNA污染。2、小RNA文庫(kù)的構(gòu)建將質(zhì)量檢驗(yàn)合格的水稻幼苗總RNA用于構(gòu)建小RNA文庫(kù)。3種濃度(0. 6mM、3. OmM 和15. OmDH2O2處理的水稻樣品提取的RNA各取10 μ g等量混合,總共30 μ g用于構(gòu)建水 稻幼苗H2O2處理的小RNA文庫(kù)。對(duì)照樣品提取的RNA取30 μ g,用于構(gòu)建水稻幼苗對(duì)照小 RNA文庫(kù)。小RNA文庫(kù)的構(gòu)建按照Illumina Sample Preparation Protocol文庫(kù)構(gòu)建方 法進(jìn)行,構(gòu)建好的文庫(kù)采用Solexa高通量測(cè)序(北京華大基因研究中心),獲得高質(zhì)量的 18-30nt的小RNA序列(兩個(gè)小RNA文庫(kù)均獲得了五百多萬(wàn)條序列)。3、兩個(gè)小RNA文庫(kù)中應(yīng)答H2O2的miRNA的鑒定參考之前國(guó)外文獻(xiàn)對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析的成功方法(Jones-Rhoades M W, Bartel D P. Computational identification of plant miRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell,2004,14 :787_799.),建立一套計(jì)算機(jī) 分析方法用來(lái)發(fā)現(xiàn)和鑒定測(cè)序數(shù)據(jù)中的水稻miRNA。①將獲得的兩個(gè)小RNA文庫(kù)中的 原始序列通過(guò)計(jì)算機(jī)方法去掉3’接頭,并過(guò)濾掉序列長(zhǎng)度在18nt以下的序列;②通過(guò) SOAP 禾呈序(Li R, Li Y, Kristiansen K, Wang J. SOAP short οIigonucleotidealignment program. Bioinformatics, 2008, 24 :713_714.)將序列與水稻 93-11 基因組(http //rice, genomics, org. cn/rice/)進(jìn)行匹配,保留能與基因組完全匹配的序列,進(jìn)行后續(xù)分析;③ 將與基因組匹配的序列與國(guó)際權(quán)威的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase (http //microrna. sanger. ac. uk/sequences/)中公布的水稻miRNA成熟序列及前體序列進(jìn)行BLAST,從而發(fā)現(xiàn)哪些序列來(lái)自于已知的水稻miRNA。鑒定出近300個(gè)水稻miRNA序列,分屬于100余個(gè)miRNA家族。由于高通量測(cè)序能給出每個(gè)miRNA的測(cè)序次數(shù),通過(guò)比較水稻幼苗H2O2處理小RNA 文庫(kù)和對(duì)照小RNA文庫(kù)中miRNA的測(cè)序數(shù)(測(cè)序數(shù)已經(jīng)根據(jù)小RNA文庫(kù)測(cè)序總數(shù)進(jìn)行了標(biāo) 準(zhǔn)化),可以從中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)庫(kù)中測(cè)序數(shù)相差較大的miRNA,這部分miRNA可能就是應(yīng)答H2O2 的miRNA。基于此方法,比較了兩個(gè)小RNA文庫(kù)中miRNA的測(cè)序數(shù),并采用以下兩個(gè)限制條 件來(lái)提高發(fā)現(xiàn)應(yīng)答H2O2的miRNA的成功率①miRNA在H2O2處理小RNA文庫(kù)或?qū)φ招NA 文庫(kù)中測(cè)序數(shù)要大于100,從而可以保證比較的可靠性;②miRNA在H2O2處理小RNA文庫(kù)和 對(duì)照小RNA文庫(kù)中測(cè)序數(shù)相對(duì)差異要大于30%。發(fā)現(xiàn)有7個(gè)miRNA家族的測(cè)序數(shù)存在顯著 差異,可能是應(yīng)答 H2O2 的 miRNA 家族,其中一個(gè)為 osa_miR1425 (miRNA_1425 ;miR1425)。osa-miR1425 的序列如下(5,— 3,) :UAGGAUUCAAUCCUUGCUGCU (序列 1)。H2O2處理小RNA文庫(kù)的測(cè)序次數(shù)(Qh2q2)為811,對(duì)照小RNA文庫(kù)的測(cè)序次數(shù)(Q對(duì) 照)為396,相對(duì)差異(QH202/Q對(duì)照-I) X 100%為+104. 8%。三、miRNA Northern 雜交為了進(jìn)一步驗(yàn)證osa_miR1425具有應(yīng)答H2O2的表達(dá)模式,采用miRNA Northern雜 交檢測(cè)幾種H2O2處理濃度下(0、0. 6,3. 0,15. 0mM)miRNA的表達(dá)情況。1、制備探針檢測(cè)osa-miR1425 的探針(5,一 3,)的序列AGCAGCAAGGATTGAATCCTA。采用T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs)對(duì)上述序列末端磷酸基團(tuán)進(jìn)行 同位素(Y -32P ATP)標(biāo)記,得到探針,用Microspin G-25柱(GE Healthcare)純化探針,去 除未標(biāo)記的同位素,純化后的探針用于Northern雜交。2、miRNA Northern 雜交Northern雜交中,每個(gè)泳道上樣量為20 μ g低分子量RNA,TO基因作為內(nèi)參,與 miRNA在同一張膜上檢測(cè)。TO基因的探針序列為T(mén)ATGCGTGTCATCCTTGCGCAG。(1)分別提取步驟一制備的各水稻樣品的總RNA。(2)采用 Park 等報(bào)道的 PEG8000/NaCl 沉淀法(Park W, Li J, Song R, MessingJ, Chen X. CARPEL FACTORY,a Dicer homolog, and HENl, a novel protein,act inmicroRNA metabolism in Arabidopsis thaliana. Curr. Biol.,2002,12 :1484_1495.)從總 RNA 中富 集低分子量RNA (有利于提高miRNA的檢測(cè)能力)。(3) miRNA Northern 雜交①富集的低分子量RNA溶于DEPC水,再加入等體積的2 X RNA上樣緩沖液(95%甲 酰胺,18mM EDTA, 0. 1 %溴酚藍(lán)和0. 1 %二甲苯青),混合后95°C變性5min,得到RNA樣品。②RNA樣品用15%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,隨后用電轉(zhuǎn)移裝置 (BIO-RAD)轉(zhuǎn)移到 Hybond N+尼龍膜(Amersham Biosciences)上。③轉(zhuǎn)移有RNA樣品的尼龍膜經(jīng)6XSSC溶液短暫漂洗,紫外交聯(lián) (Stratagene) 5min,再80°C烘烤2h,使RNA完全固定在尼龍膜上。④將轉(zhuǎn)移了 RNA的尼龍膜放入雜交管中,加入5ml ULTRAhyb-Oligo雜交液 (Ambion)在雜交爐中42°C預(yù)雜交2h,然后加入探針,混勻,42°C雜交過(guò)夜。⑤雜交結(jié)束后,小心倒出雜交液,加入含0. 5% SDS的2XSSC溶液,42°C洗滌三次,每次IOmin。⑥洗膜結(jié)束后,將膜用保鮮膜包裹,平整壓于X光片下,附加增感屏,-70°C曝光1 周。⑦曝光結(jié)束后,沖洗X光片,進(jìn)行光密度掃描,以對(duì)照組的雜交信號(hào)為1,計(jì)算各個(gè) 處理組雜交信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度。結(jié)果見(jiàn)圖1。Northern雜交結(jié)果和測(cè)序數(shù)據(jù)很吻合,osa-miR1425受H2O2誘導(dǎo)表 達(dá)。實(shí)施例2、應(yīng)答H2O2的miRNA的靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證由于植物miRNA與靶基因mRNA近乎完全互補(bǔ),因此可以通過(guò)生物信息學(xué)方法 預(yù)測(cè)OSa-miR1425的靶基因。采用Schwab等描述的方法預(yù)測(cè)miRNA的靶基因(Schwab R, Palatnik J F, Riester Μ, Schommer C, Schmid Μ, Weigel D. Specific effects ofmicroRNAs on the plant transcriptome. Dev. Cell, 2005,8 :517_527.)。使用 Patscan 程序在水稻93-11全長(zhǎng)cDNA和基因庫(kù)(http://rice. genomics, org. cn/rice/)中尋找能 與miRNA序列近乎完全互補(bǔ)的cDNA或基因,即為miRNA的靶標(biāo);參數(shù)設(shè)置為=Patscan程序 參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置,允許最大錯(cuò)配數(shù)為3個(gè),miRNA的第10和11位堿基不允許有錯(cuò)配,靶標(biāo) 的功能通過(guò)NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)同源性檢索,以同源性最高的已知功 能基因進(jìn)行注釋。預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。表losa-miR1425的靶基因及功能 注(丨)表示在H2O2處理下表達(dá)量上調(diào);bNB,Northern雜交分析得出的結(jié)果。osa-miR1425 的革巴標(biāo)是 PPR 蛋白(Pentatricopeptide repeat protein)基因 0sl0g0497300(GENBANK ACCESSION NO. 0sl0g0497300,見(jiàn)序列表的序列 3 ;編碼序列表的序 列2所示的蛋白質(zhì))。PI3R基因家族在高等植物中優(yōu)勢(shì)表達(dá),是含有上百個(gè)成員的大基因家 族,參與了許多轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程比如剪切、編輯和翻譯等。大多數(shù)PI3R基因定位在包括線 粒體和葉綠體在內(nèi)的各種細(xì)胞器,在細(xì)胞器基因表達(dá)的各個(gè)階段都起至關(guān)重要的作用,在 某種程度上可以控制細(xì)胞器的形成(0,Toole N, Hattori M,Andres C,Iida K,Lurin C, Schmitz-Linneweber C,Sugita Μ,Small I. On theexpansion of the pentatricopeptide repeat gene family in plants. Mol. Biol. Evol. ,2008,25 1120-1128.) 實(shí)施例3、miRNA對(duì)靶基因mRNA的切割osa-miR1425對(duì)靴基因0sl0g0497300 (見(jiàn)序列表的序列3)mRNA的切割用5,RACE TjfeiHiT^ilH (Jones-Rhoades M W, Bartel D P. Computational identification ofplant miRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell,2004,14 787-799.)。靶基因mRNA被miRNA切割后,其較為穩(wěn)定的3’切割產(chǎn)物5’端核苷酸磷酸集 團(tuán)暴露,用T4RNA連接酶在該切割產(chǎn)物5’端連接上5’ RACE專(zhuān)用接頭;通過(guò)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合 成cDNA ;通過(guò)靶基因特異的巢式外引物和試劑盒所帶的巢式外引物進(jìn)行第一輪PCR,靶基 因特異的巢式內(nèi)引物和試劑盒所帶的巢式內(nèi)引物進(jìn)行第二輪PCR;將5’RACE獲得的PCR產(chǎn) 物連接到pMD 19-T載體(TaKaRa)后測(cè)序,就能知道精確的靶基因mRNA切割位點(diǎn)。1、分別提取實(shí)施例1的步驟一制備的各水稻樣品的總RNA。2、按Firstchoice RLM-RACE試劑盒(Ambion)操作說(shuō)明進(jìn)行5,RACE,靶基因特 異的巢式外弓I物的序列為CCTCCCTTCTTTGCAATGACTGTCA,靶基因特異的巢式內(nèi)引物的序列 為CAGATGCCTCGATCCAACATTTCA。3、PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳,回收250bp左右的特異條帶(圖2中泳道1所示)。4、將回收的PCR產(chǎn)物連接到pMD 19-T載體(TaKaRa),并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α (TaKaRa)。5、挑單克隆測(cè)序,根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定靶基因mRNA的切割位點(diǎn)。測(cè)序結(jié)果顯示的切割位點(diǎn)見(jiàn)圖2。osa-miR1425的靶基因在與其互補(bǔ)的區(qū)域發(fā)生 了切割,這個(gè)結(jié)果強(qiáng)有力的證明了 0sl0g0497300確實(shí)是OSa-miR1425體內(nèi)真正調(diào)控的靶基 因。實(shí)施例4、靶基因的表達(dá)量分析為了進(jìn)一步考察OSa-miR1425的功能,用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)靶基因 0sl0g0497300在幾種H2O2處理濃度下(0、0. 6,3. O、15. OmM)的水稻幼苗中的表達(dá)情況。1、分別提取實(shí)施例1的步驟一制備的各水稻樣品(2g)的總RNA。2、總RNA加入DNase I (TaKaRa),室溫放置30min以除去基因組DNA的污染。3、加入終止緩沖液(50mM EDTA)后,70°C加熱IOmin以變性DNase I和RNA。4、采用TaKaRa RNA PCR Kit,用RNA合成cDNA模板,操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Power SYBR Green PCR Master Mix(Appl ied Biosystems) ^t iCycler iQ5Multicolor實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)儀(Bio-Rad)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),通過(guò)比較Ct值 法(Δ Δ Ct {t ^ )(Schmittgen T D. Real-Time Quantitative PCR. Methods,2001,25 383-385.)計(jì)算靶基因在不同樣品中的相對(duì)表達(dá)量(對(duì)照組基因的表達(dá)量設(shè)定為1)。靶 基因的檢測(cè)設(shè)置3個(gè)重復(fù),結(jié)果取平均值。以水稻β-tubulin基因作為內(nèi)參(Zhao B, Ge L, LiangR, Li W, Ruan K, Lin H, Jin Y. Members of miR-169 family are induced by highsalinity and transiently inhibit the NF-YA transcription factor. BMC Mol. Biol. ,2009,10 :29·)。擴(kuò)增靶基因的引物如下(5,一 3’)上游引物TACGAAACGGTATCCACCCTAATC;下游引物CAGATGCCTCGATCCAACATTTCA。擴(kuò)增β -tubulin基因引物如下(5,— 3,)上游引物CCTCCAAGGATTTCAAGTCTGC;下游引物TTGTAAGGTTCCACCACGGTA。結(jié)果見(jiàn)圖3。靶基因0sl0g0497300在H2O2處理下表達(dá)量發(fā)生了明顯的變化,通過(guò) 和osa-miR1425的表達(dá)(圖1)進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)0sl0g0497300的表達(dá)和osa_miR1425的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān)性,即oSa-miR1425表達(dá)上調(diào)的時(shí)候,0sl0g0497300的表達(dá)就相應(yīng) 下調(diào),這與miRNA對(duì)靶基因的負(fù)調(diào)控作用是完全一致的。osa-miR1425的表達(dá)隨著H2O2處理 濃度從0-3. OmM提高而增加,如果濃度進(jìn)一步增大(3. 0-15. OmM), osa-miR1425的表達(dá)會(huì)下 降;相應(yīng)地,Os 10g0497300的表達(dá)隨著H2O2處理濃度增加而呈現(xiàn)出先下降后上升的表達(dá)模 式,與OSa-miR1425的表達(dá)完全負(fù)相關(guān)。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果進(jìn)一步證明了 0sl0g0497300 確實(shí)是osa-miR1425的靶基因。
權(quán)利要求
序列表的序列1所示的RNA。
2.序列1所示RNA在抑制Pra蛋白基因表達(dá)中的應(yīng)用;所述PI3R蛋白如序列表的序列 2所示。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用,其特征在于所述Pra蛋白基因如序列表的序列3自5’ 末端第107至2491位核苷酸所示。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用,其特征在于所述PI3R蛋白基因如序列表的序列3所示。
5.序列1所示RNA在促進(jìn)PI3R蛋白基因的mRNA降解中的應(yīng)用;所述PI3R蛋白如序列 表的序列2所示。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于所述Pra蛋白基因如序列表的序列3自5’ 末端第107至2491位核苷酸所示。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于所述Pra蛋白基因如序列表的序列3所示。
8.序列表的序列1所示的RNA在水稻種質(zhì)改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種應(yīng)答H2O2的miRNA-1425及其應(yīng)用。本發(fā)明保護(hù)的miRNA-1425是序列表的序列1所示的RNA。本發(fā)明還保護(hù)序列1所示RNA在抑制PPR蛋白基因表達(dá)和/或促進(jìn)PPR蛋白基因的mRNA降解中的應(yīng)用;所述PPR蛋白如序列表的序列2所示。應(yīng)用miRNA-1425有望獲得對(duì)氧化脅迫、干旱、高鹽等有較強(qiáng)耐受性的植株,造福于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101921766SQ20101022144
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者劉進(jìn)元, 李甜 申請(qǐng)人:清華大學(xué)
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