專利名稱：具有蛋白代謝功能的體內(nèi)型人工腎及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有蛋白代謝功能的體內(nèi)型人工腎，其包含作為組成部分的海綿片，其中注射進(jìn)入含促進(jìn)血管生成生長(zhǎng)因子的水凝膠，以及表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞，以及其構(gòu)建的方法。
背景技術(shù)：
在日本，由于腎移植供體較少，終末期腎機(jī)能不全(terminal renalinsufficiency)治療主要采用血液透析。但是，血液透析，并不能完全補(bǔ)償原來(lái)的腎功能，因?yàn)楦鞣N引起的并發(fā)癥損害了生活質(zhì)量(QOL)以及患者的重要愈后。
血液透析的不足在于其不能補(bǔ)償近端曲小管細(xì)胞(proximal tubularcells)具有的腎小管濾過的蛋白的代謝功能。因此，原先由這些細(xì)胞代謝的低分子量蛋白積累在患者體內(nèi)，成為尿毒癥毒蛋白(uremic toxinprotein)，引起各種疾病。典型例子是透析相關(guān)的淀粉樣變性病，其是由于β2微球蛋白(β2-m)的積累，其引起骨關(guān)節(jié)病和器官衰竭。而且，在血液透析患者中，AGE，由于glycation的修飾蛋白也會(huì)積累，導(dǎo)致動(dòng)脈硬化和/或器官損傷。近些年來(lái)，血液透析膜和血液過濾技術(shù)得到不斷改進(jìn)，β2-m吸收柱已經(jīng)投入實(shí)際使用。但是，這些都具有局限性，因此需要能持續(xù)和有效地補(bǔ)償代謝蛋白的人工腎。
為滿足需要，開發(fā)了利用細(xì)胞的系統(tǒng)以補(bǔ)償近端。例如，Humes，HDet al.(Nature Biotech.17，451-453(1999))報(bào)道人工腎，其含有結(jié)合中空纖維組件的血液濾器，具有永生近端曲小管上皮細(xì)胞，引起粘接到中空纖維內(nèi)表面，其中濾過的血液循環(huán)通過含有培養(yǎng)的近端曲小管細(xì)胞的內(nèi)腔，以及Saito，Akira et al.(44thMeeting of the JapaneseSociety for Dialysis Therapy(1999))報(bào)道了類似的人工腎(小管)，其中使用了遠(yuǎn)端曲小管細(xì)胞(distal tubular cell)。但是，這些都是體外裝置，因此無(wú)法克服間斷血液治療的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了體內(nèi)人工腎，其具有代謝蛋白的功能，以及其方法，以解決上述問題。本發(fā)明還提供了具有代謝蛋白的功能的人工腎，其具有利用了整合低分子量蛋白，激素等進(jìn)入細(xì)胞的megalin的功能。
因此，本發(fā)明涉及具有代謝蛋白的功能的體內(nèi)人工腎，其包含，作為組成部分的，具有含注射進(jìn)入的促血管生成生長(zhǎng)因子的水凝膠(hydrogel)的海綿片(sponge sheet)，以及具有megalin的細(xì)胞，其是內(nèi)吞作用受體(endocytosisreceptor)，在近端曲小管細(xì)胞代謝蛋白的功能中具有關(guān)鍵作用，megalin表達(dá)在細(xì)胞表面。
本發(fā)明還涉及具有代謝蛋白的功能的體內(nèi)人工腎的構(gòu)建方法，其包含使用其中注射了含有促血管生成生長(zhǎng)因子的水凝膠，以及表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞的海綿片。
此外，本發(fā)明還涉及構(gòu)建體內(nèi)人工腎的方法，其包含將含有促血管生成生長(zhǎng)因子的水凝膠注射進(jìn)入海綿片的步驟，皮下移植海綿片的步驟，以及將表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞注射到移植的海綿片中。
此外，本發(fā)明還涉及上述的人工腎和其構(gòu)建方法，其中促血管生成生長(zhǎng)因子是堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)；bFGF是基因工程技術(shù)生產(chǎn)的人bFGF；所述水凝膠是明膠凝膠(gelatin gel)；所述明膠凝膠主要由具有4.5-5.5的等電點(diǎn)的明膠種類(species)組成；海綿片由膠原質(zhì)(collagen)制備；表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞是人近端曲小管上皮細(xì)胞(humanproximal tubular epithelial cell)和/或通過基因傳遞(gene transfer)方式高水平表達(dá)megalin人近端曲小管上皮細(xì)胞；和/或megalin的表達(dá)是基因操縱的結(jié)果。
發(fā)明詳述本發(fā)明具有代謝蛋白的功能的體內(nèi)人工腎包含，作為組成部分的，具有含注射進(jìn)入的促血管生成生長(zhǎng)因子的水凝膠以及表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞的海綿片。
作為本發(fā)明所用的促血管生成生長(zhǎng)因子，還可以有，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(TGF-α)，血管上皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，血小板來(lái)源生長(zhǎng)因子-BB(PDGF-BB)，和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
本發(fā)明中，上述促血管生成生長(zhǎng)因子可包含一種或多種的結(jié)合。此外，也可結(jié)合另一生物活性因子。
為具有更強(qiáng)大的生長(zhǎng)活性，優(yōu)選bFGF，PDGF-BB。此外，bFGF作為被廣泛認(rèn)知的促血管生成生長(zhǎng)因子，是最優(yōu)選的。
本發(fā)明中所用bFGF包括提取自器官或組織，如腦下垂體，腦，腎，腎上腺，胎盤，骨基質(zhì)，軟骨，上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞的種類，以及采用基因重組，修飾等基因工程技術(shù)產(chǎn)生的種類，以及其它具有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子作用的種類。其中，基因工程技術(shù)產(chǎn)生的人bFGF種類由于質(zhì)量和供應(yīng)穩(wěn)定性特別優(yōu)選。上述的修飾包括其它，得自通過提取或添加一或多個(gè)氨基酸殘基到bFGF的氨基酸序列中，此序列中一或多個(gè)氨基酸殘基的取代，或此序列中一或多個(gè)氨基酸殘基的缺失而得的基因工程技術(shù)的bFGF種類的衍生。本發(fā)明中，可以單獨(dú)或者混合使用這些bFGF種類。
本發(fā)明方法中的水凝膠的其它原料包括，多糖如纖維素，葡聚糖，瓊脂糖，pullulan，淀粉，透明質(zhì)酸，褐藻酸，幾丁質(zhì)，脫乙酰殼多糖，以及多糖衍生物如羥乙基纖維素；聚氨基酸(polyamino acid)如聚天冬氨酸，聚谷氨酸和聚賴氨酸；多肽如明膠，纖維蛋白，谷蛋白(gluten)；具有親水性側(cè)鏈基團(tuán)的合成聚合物，如聚乙烯醇，聚丙烯酰胺，聚乙烯吡咯烷酮，聚(2-羥乙基丙烯酸脂)，聚乙烯甲基醚(polyvinyl methyl ether)，聚(N-乙烯乙酰胺)(poly(N-vinylacetamide))，聚丙烯酸，聚(異丁烯-順丁烯二酸)(poly(isobutylene-maleic acid))，聚(2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸)，聚丙烯氧丙烷磺酸，聚乙烯磺酸，聚(異丁烯酰基氧乙基-季胺鹽酸鹽)，聚乙烯吡啶，聚(N，N-二甲基-N-(2-異丁烯酰基氧乙基)-N-(3-硫代丙基)內(nèi)胺鹽)(poly(N，N-dimethyl-N-(2-methacryloyloxyethyl)-N-(3-sulfopropyl)ammonium internal salt)，以及主鏈本身是親水性的合成聚合物，如聚乙二醇，二氧戊環(huán)(polydioxolane)和聚乙烯亞胺。
本發(fā)明中，這些材料可以單獨(dú)使用，或適當(dāng)?shù)囟喾N組合使用，或者經(jīng)過另一化合物的進(jìn)一步地修飾后使用。
在上述的水凝膠的原料中，多糖如纖維素，透明質(zhì)酸，褐藻酸，幾丁質(zhì)，脫乙酰殼多糖；聚氨基酸如聚天冬氨酸，聚谷氨酸和聚賴氨酸；多肽如明膠，纖維蛋白，谷蛋白的其它這些原料是可生物吸收的，因此是優(yōu)選的。具體地，從易加工性能，所包含生長(zhǎng)因子的生物活性的保持，以及體內(nèi)的分解速度(生長(zhǎng)因子的逐步釋放)考慮優(yōu)選明膠。
通過使得自活生物體的膠原質(zhì)采用例如酸或堿進(jìn)行適當(dāng)?shù)仡A(yù)處理，然后用溫水熱提取，可以得到明膠。本發(fā)明中，但是，可以使用通?？傻玫娜魏渭?jí)別的明膠，沒有特別的限制。因此，例如可以有堿處理的具有4.5-5.5的等電點(diǎn)的明膠，酸處理的具有8-9的等電點(diǎn)的明膠。在bFGF用作促血管生長(zhǎng)因子的情況下，考慮bFGF截留優(yōu)選具有4.5-5.5的等電點(diǎn)的堿處理明膠，這是因?yàn)閎FGF等電點(diǎn)為約9，在中性水溶液中帶正電。此外，在來(lái)源或物理性質(zhì)，如溶解度，分子量，等電點(diǎn)方面不同的不但單一種類的明膠，而且二或多種類都可混合使用。此外，明膠可以包含添加劑；例如可以加入陰離子化合物以使bFGF逐漸釋放，如Japanese Kokai Publication Hei-08-325160所公開的。當(dāng)bFGF用作促血管生長(zhǎng)因子時(shí)，可以使用除明膠外的其它水凝膠，如上所述，從bFGF截留考慮，優(yōu)選的水凝膠具有低等電點(diǎn)。
促血管生長(zhǎng)效果的持續(xù)可能因生物降解度以及所用水凝膠的水含量不同而不同。
從促血管生成生長(zhǎng)因子逐漸釋放的角度考慮，水凝膠的水含量?jī)?yōu)選在水中溶脹后不低于80％，更優(yōu)選85％到99％，更優(yōu)選90％到98％。
水凝膠的水含量可如下計(jì)算。
當(dāng)水凝膠是顆粒形式時(shí)，水含量計(jì)算為w[％]＝100×(VW-VD)/VW
當(dāng)VD是凍干和叩打(tapping)(將水凝膠放置于量筒中并給量筒以物理刺激使水凝膠堆積緊密)后水凝膠體積，VW是叩打后37℃下水中溶脹24小時(shí)后水凝膠體積。測(cè)量VD和VW例如，從高度5厘米重復(fù)叩打量筒直至讀取體積不再發(fā)生變化。對(duì)于VW，上述叩打的方法重復(fù)10次，在體積保持30分鐘后無(wú)變化時(shí)，讀取刻度上的體積，這是因?yàn)樗z在水中穩(wěn)定需要一些時(shí)間。
當(dāng)水凝膠不是顆粒時(shí)，水含量如下計(jì)算w[％]＝100×(WW-WD)/WW當(dāng)WW是水凝膠在37℃下水中溶脹(swelling)24小時(shí)，然后除去水凝膠粘連的那部分水，通過吸濾，離心等在水凝膠微粒間出現(xiàn)的那部分水后的重量(濕重)，WD是隨后對(duì)水凝膠進(jìn)行干燥直到重量不再改變的重量(干重)。
作為測(cè)定濕重的具體方法，此方法可例如包括將水凝膠放置在玻璃濾器上，采用吸氣器(aspirator)吸入水凝膠，繪制重量減少曲線表示吸入時(shí)間和重量之間的關(guān)系，當(dāng)曲線斜率改變較小時(shí)測(cè)定吸入時(shí)間(suctiontime)間隔后的重量。干燥方法沒有限制，只要可以達(dá)到恒重，但是采用不低于105℃常壓下干燥，不需要任何特別的裝置，可以簡(jiǎn)單容易地進(jìn)行。如果在此溫度下會(huì)引發(fā)分解或其它現(xiàn)象，可以在減壓低溫下進(jìn)行干燥，如凍干。
當(dāng)上述原料溶于水時(shí)，本發(fā)明水凝膠是使上述原料通過交聯(lián)而不溶得到的。根據(jù)材料的來(lái)源，性質(zhì)和/或類似方法，交聯(lián)的方法可以是熱處理，紫外或gamma射線照射，或與固化劑反應(yīng)。
固化劑沒有特別的限制，但當(dāng)水凝膠材料是明膠時(shí)，其包含含有多價(jià)金屬離子如鋁或鐵離子的鹽的無(wú)機(jī)化合物；醛如戊二醛和福爾馬林，碳二酰亞胺(carbodiimide)如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亞胺鹽酸鹽和1-環(huán)己基-3-(2-morpholinoethyl)碳二酰亞胺甲基-p-甲苯磺酸鹽，環(huán)氧樹脂化合物如表氯醇和丁二醇二縮水甘油基醚，異氰酸鹽，典型的如環(huán)己烷二異氰酸鹽，酸酐，和其它有機(jī)化合物。
本發(fā)明所用水凝膠的形式例如可以是柱狀，片狀，盤狀，球形，顆粒或無(wú)定形的。考慮容易注射進(jìn)入海棉片，優(yōu)選球形，顆?；驘o(wú)定形的形式。
水凝膠的大小，其平均微粒大小優(yōu)選10到200μm，更優(yōu)選20到150μm。
本發(fā)明所用海綿片是用于固定化含促血管生成生長(zhǎng)因子水凝膠，以及容納表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞的多孔片。
海綿片的原料包括上述的水凝膠原料以及聚酯如聚乙醇酸，聚乳酸，聚己內(nèi)酯，polydioxanone，聚羥基乙酸，聚羥基戊酸，聚環(huán)丙烷碳酸(polytrimethylene carbonate)，聚(α-氰基丙烯酸酯)以及類似的生物可吸收材料，以及聚氨脂。本發(fā)明中，這些原料可以單獨(dú)或幾種混合使用，也可用其它化合物修飾后使用。
上述海綿片材料中，考慮本領(lǐng)域應(yīng)用中的生物相容性，優(yōu)選膠原質(zhì)，聚乙醇酸，聚乳酸等。具體地，由于活細(xì)胞粘連較好特別優(yōu)選膠原質(zhì)海綿片。
本發(fā)明所用海綿片具有多孔結(jié)構(gòu)?？紤]新血管的穿透，以及對(duì)注射的細(xì)胞的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物的供應(yīng)，其優(yōu)選具有完全開放的孔結(jié)構(gòu)，其中孔之間是相互連通的。
其平均孔大小優(yōu)選是60到4000μm，更優(yōu)選70到150μm。
megalin是內(nèi)吞作用受體，其在近端曲小管細(xì)胞的蛋白代謝中起到關(guān)鍵作用，其cDNA克隆在大鼠上成功制得，Saito等，其為發(fā)明人，分析了全長(zhǎng)初級(jí)結(jié)構(gòu)(Proc. Nattl. Acad. Sci. USA 91，pp9725-9729(1994))。此后，HjalmG等克隆了人megalin/gp330(Eur.J.Biochem.239，pp.132-137(1996))。人megalin估計(jì)包含4655aa(分子量519636)。已知，其由N末端(25aa)，胞外區(qū)(4398aa)，跨膜區(qū)(23aa)和C末端胞外區(qū)(209aa)組成。所述胞外區(qū)具有三種類型的富半胱氨酸(cystein)區(qū)，megalin基因?qū)儆贚DL受體基因家族。
Megalin是多功能內(nèi)吞作用受體，據(jù)報(bào)道其結(jié)合的酶和酶抑制劑有PAI-1，PAI-1尿激酶，PAI-1-tPA，prourokinase，脂蛋白脂肪酶和抑肽酶，這樣的結(jié)合維生素蛋白如維生素D結(jié)合蛋白，維生素A結(jié)合蛋白，阿樸脂蛋白(apolipoprotein)如阿樸脂蛋白B和阿樸脂蛋白E，堿性多肽如氨基葡糖苷和多粘菌素B，低分子量蛋白和激素如甲狀旁腺激素，胰島素，β2-m，內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，催乳激素，溶菌酶和細(xì)胞色素C。
已經(jīng)有，在人體，如megalin不僅表達(dá)在近端曲小管上皮細(xì)胞而且表達(dá)在甲狀旁腺細(xì)胞表面，胎盤絨毛間隙(placental intervillous spaces)，epididymal上皮細(xì)胞，II型肺泡(alveolar)上皮細(xì)胞，乳腺上皮細(xì)胞，甲狀腺小泡細(xì)胞，眼睛睫毛體上皮細(xì)胞等。因此這些細(xì)胞可以成為megalin表達(dá)細(xì)胞。在上述細(xì)胞中，最優(yōu)選來(lái)自患者自己殘余腎的近端曲小管上皮細(xì)胞作為megalin表達(dá)細(xì)胞。
由于megalin表達(dá)在細(xì)胞表面，其可用于本發(fā)明中，除上述來(lái)自患者或其它人的megalin表達(dá)細(xì)胞外，還有能通過基因傳遞作為衍生自megalin表達(dá)細(xì)胞來(lái)自患者或其它人高水平表達(dá)megalin的細(xì)胞，作為衍生自來(lái)自患者或其它人的非megalin表達(dá)細(xì)胞通過基因傳遞能表達(dá)megalin的細(xì)胞，此外，衍生自胚細(xì)胞，干細(xì)胞或通過誘導(dǎo)分化的細(xì)胞。本發(fā)明所用的基因傳遞方法，可以是本領(lǐng)域已知的物理，化學(xué)或生物方法。分化誘導(dǎo)方法，例如有包括添加分化誘導(dǎo)物質(zhì)的方法，包含改變各種環(huán)境因素如溫度，壓力，pH或/和滲透壓的方法。
在上述表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞中，考慮移植細(xì)胞的排異性優(yōu)選來(lái)自患者自己的細(xì)胞。此外，優(yōu)選人近端曲小管上皮細(xì)胞和/或由于基因傳遞高水平表達(dá)megalin的人近端曲小管上皮細(xì)胞。
對(duì)于非megalin表達(dá)細(xì)胞，考慮技術(shù)技能的易行性優(yōu)選衍生自患者自體的高吞噬性巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞。
優(yōu)選由基因操縱引起megalin表達(dá)。
現(xiàn)在描述構(gòu)建本發(fā)明的具有蛋白代謝功能的體內(nèi)人工腎的方法。本發(fā)明的體內(nèi)人工腎采用海綿片構(gòu)建，其中注射了包含促血管生成生長(zhǎng)因子的水凝膠，以及表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞。優(yōu)選地，構(gòu)建人工腎的方法包含注射包含促血管生成生長(zhǎng)因子的水凝膠進(jìn)入海綿片的步驟，皮下移植海綿片的步驟，注射表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞進(jìn)入移植的海綿片的步驟。
水凝膠可通過本領(lǐng)域已知的方法制備，沒有特別的限制。例如，利用通過氫鍵，離子鍵，配位鍵等產(chǎn)生分子間聚集的物理現(xiàn)象，采用交聯(lián)試劑引起化學(xué)交聯(lián)的方法，通過光或照射引發(fā)的化學(xué)交聯(lián)。水凝膠?；?molding)(成型)方法沒有特別限制，例如乳狀液方法，?；椒?，噴霧干燥方法可用于制備顆粒水凝膠。
為使促血管生成生長(zhǎng)因子包含在水凝膠中，只要促血管生成生長(zhǎng)因子生物活性不受到大的損害，所述方法沒有特別限制。例如，包含制備后干燥水凝膠以及采用含生長(zhǎng)因子的溶液將其注入的方法，或包含將沒有干燥水凝膠制備的具有生長(zhǎng)因子溶液的水凝膠的方法，此外包含引起生長(zhǎng)因子存在于用于制備水凝膠的起始溶液的方法。
例如，含促血管生成生長(zhǎng)因子的水凝膠可以通過注射器注射進(jìn)入海綿片。
為固定化含促血管生成生長(zhǎng)因子的水凝膠以及保持表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞，將海綿片皮下移植進(jìn)入活體或可以利用的其它部位?？稍谧⑸溥M(jìn)入含促血管生成生長(zhǎng)因子的海綿片后進(jìn)行海綿片的移植，或者可在水凝膠注射進(jìn)入后移植。
本發(fā)明的體內(nèi)人工腎可通過將表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞注射進(jìn)入海綿片來(lái)構(gòu)建，所述海綿片注射了含促血管生成生長(zhǎng)因子的凝膠，移植進(jìn)入活體。
表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞可采用，例如注射器或微毛細(xì)管注射進(jìn)入海綿片。
注射表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞的計(jì)時(shí)沒有特別限制，為了保證表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞的附著和增殖，需要在必須的移植具有含促血管生成生長(zhǎng)因子的水凝膠注射其中的海綿片后血管生成天數(shù)間隔后移植細(xì)胞，或者在先注射含生長(zhǎng)因子的水凝膠進(jìn)入海綿片后。必須的血管生成天數(shù)取決于所用的促血管生成生長(zhǎng)因子以及水凝膠性質(zhì)。當(dāng)使用含bFGF堿處理明膠凝膠時(shí)，例如，天數(shù)是3到8天。


圖1是有關(guān)在實(shí)施例和對(duì)比例中125I標(biāo)記的β2-m在幾個(gè)組織中的攝取。圖中，下列符號(hào)為transpl.實(shí)施例；cont.對(duì)比例；T移植的細(xì)胞腫塊(phyma)；L肝；P肺；H心臟；S骨骼肌。
圖2是125I標(biāo)記的β2-m整合進(jìn)入移植細(xì)胞的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。圖中，泳道分別表示下列實(shí)施例泳道1用于腹膜內(nèi)給藥的125I標(biāo)記的β2-m；泳道2實(shí)驗(yàn)后恢復(fù)的移植細(xì)胞腫塊勻漿；泳道3實(shí)驗(yàn)后從移植細(xì)胞小鼠采集的血液。
圖3表示了實(shí)施例和對(duì)比例中三氯乙酸(TCA)引起的血液沉積的放射性同位素計(jì)數(shù)結(jié)果。圖中，下列術(shù)語(yǔ)為對(duì)照組為對(duì)比例；移植組為實(shí)施例。
具體實(shí)施例方式
下面的例子用于具體說(shuō)明本發(fā)明。這些實(shí)施例并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
(實(shí)施例)(1)含bFGF的明膠凝膠微粒的制備含bFGF的明膠凝膠微粒由Tabata等方法準(zhǔn)備(Tabata，Y，等，J.Biomaterri.Sci.Polymer Edn.，10957-968，1999)。因此，10ml 10％wt的堿處理明膠(等電點(diǎn)5.0，Nitta Gelatin產(chǎn)品)水溶液先預(yù)熱到40℃，與25μl 25％wt的戊二醛混合，混合物在425rpm攪拌下滴加到40℃375ml橄欖油中，形成w/o乳狀液。25℃下持續(xù)攪拌24小時(shí)，化學(xué)交聯(lián)明膠。加入100ml丙酮，離心收集所得微粒(4℃，3000rpm，5分鐘)，丙酮中離心沖洗5次。沖洗后微粒保持在100ml 100mM水性明膠溶液中，其中含有0.1％wt Tween80，37℃下一小時(shí)，以阻斷殘余的來(lái)自戊二醛的未反應(yīng)醛基。將如此得到的交聯(lián)明膠微粒蒸餾水中沖洗2次，然后凍干，環(huán)氧乙烷氣體消毒。37℃下水中溶脹24小時(shí)后，明膠凝膠微粒水含量95％。光學(xué)顯微鏡下測(cè)定微粒大小(直徑)，60-130μm。具有等電點(diǎn)9.6的重組bFGF(Kaken Pharmaceutical Co.產(chǎn)品)的10mg/ml水溶液(10μl)滴加到上述所得的干明膠凝膠微粒2mg部分上，25℃下保持1小時(shí)得到含bFGF的明膠凝膠微粒。
(2)凝膠海綿片的制備采用冷凍均漿器1800-2000rpm下攪拌60分鐘0.3％脂肪變性膠原質(zhì)鹽酸(atherocollagen hydrochloric acid)溶液(pH3.0)。起泡的溶液灌注到模中，-40℃下快速冷凍，凍干48小時(shí)，105℃下減壓干燥24小時(shí)。然后4℃下0.05M乙酸的0.2％戊二醛溶液中進(jìn)行交聯(lián)24小時(shí)，用磷酸鹽緩沖的生理鹽(PBS)(pH7.4)沖洗模具(molding)，浸沒在15％乙醇水溶液中.模具-135℃下快速冷凍，然后凍干(48小時(shí))，環(huán)氧乙烷氣體消毒得到膠原質(zhì)海綿片。
(3)表達(dá)megalin細(xì)胞的皮下移植如上(1)中得到的含bFGF的明膠凝膠微粒懸浮在0.15mlPBS中，采用1ml注射器(具有23G針頭)將懸浮液注射入如上所得膠原質(zhì)海綿片(1×1×0.5cm)。將海綿片移植到5周齡雌性裸小鼠(BALB/cA Jcl-nu；CLEA日本)皮下背側(cè)(dorsal side)，二乙基醚吸入麻醉.
一周后，病理確認(rèn)海綿片中血管生成，0.15ml細(xì)胞懸浮液采用1ml注射器(具有23G針頭)注射進(jìn)入麻醉的小鼠，懸浮液如下制備，將得自培養(yǎng)在補(bǔ)充有10％(vol/vol)新生牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle培養(yǎng)基(LIFE TECHNOLOGIES，GIBCO BRL，Rockville，MD，USA)中的大鼠卵黃囊上皮癌細(xì)胞(L2細(xì)胞)，現(xiàn)在帶有表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞(1×107細(xì)胞/ml)懸浮。細(xì)胞注射兩周后，當(dāng)細(xì)胞腫塊最長(zhǎng)直徑不短于2cm時(shí)，麻醉下從背側(cè)手術(shù)切除小鼠雙腎，產(chǎn)生小鼠腎不足狀態(tài).沒有觀察到移植的L2細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
(對(duì)比例)如上進(jìn)行同樣的步驟，只是不注射細(xì)胞懸浮液，在步驟(3)中只有PBS注射進(jìn)入海綿片。
(實(shí)驗(yàn)例)將如上實(shí)施例和對(duì)比例中所得的腎不足狀態(tài)的小鼠進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn).
(1)使用IODOGEN(Pierce產(chǎn)品)125I標(biāo)記的β2微球蛋白(Microglobulin，Oriental Yeast Co.產(chǎn)品)。碘化作用產(chǎn)生6×103cpm/ng蛋白的比活。125I標(biāo)記的β2-m用含0.5％牛血清(BSA)的PBS稀釋到11ng/μl濃度。125I標(biāo)記的β2-m(2.8μg/250μl)腹膜內(nèi)給藥到上述腎不足狀態(tài)的15只小鼠的每一只，評(píng)價(jià)小鼠的下述各項(xiàng)。125I標(biāo)記的β2-m給藥后3，6或14小時(shí)用生理鹽水全身灌注(general perfusion)殺死5只小鼠。
(2)采集處死后的每只小鼠的移植的細(xì)胞腫塊，心，肺，肝臟，和骨骼肌，稱重，在Eppendorf管中進(jìn)行g(shù)amma射線計(jì)數(shù)(counting)。所得結(jié)果表示于圖1中。
圖1表示了有關(guān)實(shí)施例和對(duì)比例中組織中125I標(biāo)記的β2-m攝入的數(shù)據(jù)?？v座標(biāo)表示每單位重量組織的125I數(shù)(count)，移植細(xì)胞中125I數(shù)總是顯著(*p＜0.05)高于心，肺，肝臟，和骨骼肌中的，不論測(cè)定時(shí)間。另一方面，心，肺，肝臟，和骨骼肌中的125I數(shù)在實(shí)施例和對(duì)比例間沒有表現(xiàn)出任何顯著的不同。這些結(jié)果顯示125I標(biāo)記的β2-m已經(jīng)被有效的整合進(jìn)入移植細(xì)胞。
(3)此外，采用UITRA TURRAX(IKA LAB ORTECHNIK，Staufen，Germany)在補(bǔ)充有2％β巰基乙醇的Laemmli樣品緩沖液中允漿移植的細(xì)胞腫塊，將所得進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。所得結(jié)果表示于圖2中.
圖2表示了整合進(jìn)入移植細(xì)胞125I標(biāo)記的β2-m的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。與腹膜內(nèi)給藥的125I標(biāo)記的β2-m結(jié)果相比揭示移植細(xì)胞含有125I標(biāo)記的β2m單體以及其分解產(chǎn)物。另一方面，在細(xì)胞移植受體小鼠的血液樣品中，除分解產(chǎn)物，觀察到比移植細(xì)胞中更大數(shù)量的β2-m的concatemer。這些結(jié)果指示移植細(xì)胞中放射性同位素?cái)?shù)量不是由于血液中的雜質(zhì)，而是由于整合進(jìn)入移植細(xì)胞的β2-m的分解。
(4)此外，處死小鼠后采集的每一只的血液，10μl血液樣品部分與415μl含1％BSA的PBS混合，混合物然后與75μl 1 00％三氯乙酸(以下稱TCA)混合以沉淀未分解蛋白。離心收集沉淀蛋白，gamma計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，從而評(píng)價(jià)血液中未分解125I標(biāo)記的β2-m水平。所得結(jié)果顯示于圖3中。
圖3表示了實(shí)施例和對(duì)比例中TCA引起的血液沉淀的放射性同位素計(jì)數(shù)。125I標(biāo)記的β2-m給藥后6和14小時(shí)，與對(duì)比例相比，實(shí)施例血液的TCA沉淀中放射性同位素計(jì)數(shù)顯著減少(*p＜0.05)。這指示與對(duì)比例相比，實(shí)施例中125I標(biāo)記的β2-m分解數(shù)量更大，即移植細(xì)胞正在產(chǎn)生代謝蛋白的功能。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明的具有代謝蛋白功能的人工腎可以在體內(nèi)發(fā)揮作用，在改善腎不足患者的QOL方面有用。
權(quán)利要求
1.一種具有代謝蛋白功能的體內(nèi)人工腎，其含有，作為組件的海綿片，所述海綿片具有其中注射有含促血管生成生長(zhǎng)因子水凝膠和表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的人工腎，其中所述促血管生成生長(zhǎng)因子是堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。
3.權(quán)利要求2的人工腎，其中bFGF是基因工程技術(shù)產(chǎn)生的人bFGF。
4.權(quán)利要求1的人工腎，其中水凝膠是明膠凝膠。
5.權(quán)利要求4的人工腎，其中明膠凝膠主要由等電點(diǎn)4.5-5.5的明膠種類組成。
6.權(quán)利要求1的人工腎，其中海綿片由膠原質(zhì)制成。
7.權(quán)利要求1的人工腎，其中表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞是人近端曲小管上皮細(xì)胞和/或通過基因傳遞方法在表面高水平表達(dá)megalin的人近端曲小管上皮細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1的人工腎，其中megalin的表達(dá)是基因操縱的結(jié)果。
9.構(gòu)建具有蛋白代謝功能的體內(nèi)型人工腎的方法，其包含使用其中注射有含促血管生成生長(zhǎng)因子水凝膠和表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞的海綿片。
10.權(quán)利要求9的構(gòu)建人工腎的方法，其包含將含有促血管生成生長(zhǎng)因子水凝膠注射進(jìn)入海綿片的步驟，皮下移植海綿片的步驟，將表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞注射進(jìn)入移植的海綿片的步驟。
11.權(quán)利要求9的構(gòu)建人工腎的方法，其中所述促血管生成生長(zhǎng)因子是bFGF。
12.權(quán)利要求11的構(gòu)建人工腎的方法，其中bFGF是基因工程技術(shù)產(chǎn)生的人bFGF。
13.權(quán)利要求9的構(gòu)建人工腎的方法，其中水凝膠是明膠凝膠。
14.權(quán)利要求13構(gòu)建的人工腎的方法，其中明膠凝膠主要由等電點(diǎn)4.5-5.5的明膠種類組成。
15.權(quán)利要求9的構(gòu)建人工腎的方法，其中海綿片由膠原質(zhì)制成。
16.權(quán)利要求9的構(gòu)建人工腎的方法，其中表面表達(dá)有megalin的細(xì)胞是人近端曲小管上皮細(xì)胞和/或通過基因傳遞方法在表面高水平表達(dá)megalin的人近端曲小管上皮細(xì)胞。
17.權(quán)利要求9的構(gòu)建人工腎的方法，其中megalin的表達(dá)是基因操縱的結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及提供體內(nèi)型人工腎，其具有蛋白代謝功能。即一種具有代謝蛋白功能的體內(nèi)型人工腎，其特征為具有作為組成成員的海綿片，所述海綿片具有含生長(zhǎng)因子的水凝膠，其可促進(jìn)血管生成，注射進(jìn)入以及具有表達(dá)在表面的megalin的細(xì)胞，其是內(nèi)吞作用受體，在近端曲小管細(xì)胞中的蛋白代謝中發(fā)揮主要作用；構(gòu)建體內(nèi)型人工腎的方法，所述腎具有蛋白代謝的功能，其特征在于采用了注射進(jìn)入具有含生長(zhǎng)因子的水凝膠的海綿片，其可促進(jìn)血管生成，以及具有在表面表達(dá)megalin的細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61L27/38GK1509155SQ0281005
公開日2004年6月30日 申請(qǐng)日期2002年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月17日
發(fā)明者田畑泰彥, 齋藤亮彥, 下條文武, 古吉重雄, 山下憲司, 司, 彥, 武, 田 泰彥, 雄 申請(qǐng)人:鐘淵化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社, 田畑泰彥, 齋藤亮彥