專利名稱：產(chǎn)生抗人ngal特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其產(chǎn)生的單克隆抗體與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及雜交瘤細(xì)胞株及由其產(chǎn)生的抗人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白特異性單克隆抗體。
背景技術(shù)：
腎損傷是臨床上各種危重疾病最常見的并發(fā)癥之一。近幾十年來雖然對腎損傷病理生理和發(fā)病機(jī)制的研究以及臨床治療方法已經(jīng)有了很大進(jìn)步，但其發(fā)病率和死亡率仍然居高不下。已經(jīng)明確，早期治療對腎損傷的逆轉(zhuǎn)十分重要，而早期診斷是指導(dǎo)臨床及時(shí)治療的關(guān)鍵。目前，臨床上常用的經(jīng)典腎損傷生物化學(xué)標(biāo)志物主要有血尿素氮、血肌酐、血胱抑素C。尿素是人體蛋白質(zhì)代謝的重要終末小分子代謝產(chǎn)物，其濃度并不完全依賴于腎功能，當(dāng)腎小球?yàn)V過率下降到正常的50%以下時(shí)，血尿素濃度才迅速升高，只能作為粗略估計(jì)腎功能的指標(biāo)；肌酐是肌酸代謝的終末產(chǎn)物，與尿素相比，其受腎外因素影響小，能較好的指示腎臟功能。但與血尿素一樣，血肌酐對腎臟儲備功能的損失不敏感；有研究表明血胱抑素C在腎損傷發(fā)生12小時(shí)才上升，此時(shí)腎功能已經(jīng)受到不可逆損傷，增加了腎損傷的死亡率。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)在急性腎損傷極早期就顯著升高，其敏感性高，窗口期短，作為腎損傷的生物學(xué)預(yù)警和診斷指標(biāo)受到廣泛關(guān)注。NGAL是中性粒細(xì)胞特異性顆粒中發(fā)現(xiàn)的一種25Kd的小分子分泌型蛋白。廣泛分布于成人骨髓、子宮、前列腺、唾液腺、胃、闌尾、結(jié)腸和氣管以及胎兒脾臟和肺組織中。這種25kDa的蛋白質(zhì)由198個(gè)氨基酸組成，前20個(gè)氨基酸為前導(dǎo)序列，NGAL是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(lipocalin)超家族的新成員，能夠結(jié)合并運(yùn)輸疏水性小分子，參與體內(nèi)抗炎作用并可能與腫瘤存在密切聯(lián)系。2003年Mishra J等觀察到缺血再灌注損傷后的小鼠腎臟和順鉬誘導(dǎo)的中毒性腎損害中，小鼠尿液中NGAL顯著增高，2011年Barasch研究小組在NatureMedcine上報(bào)道了用Luciferase-2和mCherry雙螢光報(bào)告基因在NGAL啟動子和其5’ UTR驅(qū)動下的knock in小鼠模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，揭示了缺血性和細(xì)胞毒性腎損害時(shí)NGAL基因表達(dá)活性在腎組織中的Henles管和集合管的上皮細(xì)胞呈劑量依賴性的顯著變化。說明腎損傷時(shí)尿中NGAL主要來自腎組織，而不是來自正常時(shí)也低表達(dá)NGAL的中性粒細(xì)胞、肝細(xì)胞、呼吸道和腸道等上皮細(xì)胞。說明NGAL在腎損傷診斷中有重要的應(yīng)用價(jià)值。實(shí)現(xiàn)NGAL免疫檢測的關(guān)鍵問題是如何獲得其單克隆抗體及多克隆抗體以及作為免疫檢測的抗原標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測，NGAL蛋白在86位氨基酸可能有糖基化，為能最好地接近天然蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，通過基因工程在293細(xì)胞中表達(dá)適用于免疫學(xué)檢測工作標(biāo)準(zhǔn)品的重組NGAL蛋白，為下一步NGAL單克隆抗體和多克隆抗體的制備提供抗原，并用于NGAL特性的研究。N GAL對于腎損傷的早期診斷更具有特異性和敏感性，有望成為理想的腎損傷早期診斷生化指標(biāo)。免疫檢測技術(shù)是基于抗原一抗體反應(yīng)的原理對待測物(抗原/抗體)進(jìn)行定量定性分析的檢測方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、便捷等優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)代生命科學(xué)的重要研究手段，在生物分析檢測領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。構(gòu)建基于免疫檢測技術(shù)的NGAL檢測體系對于腎臟疾病早期診斷、人類健康等都具有重要的意義，同時(shí)具有較大的社會意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前市場上出售的用于檢測NGAL的酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒，均采用國外進(jìn)口 NGAL抗體，價(jià)格昂貴，且為科研用試劑盒，難以大面積進(jìn)行臨床應(yīng)用。因此，制備高特異性的NGAL特異性單克隆抗體成為迫切需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供兩株產(chǎn)生抗人NGAL特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明所提供的產(chǎn)生抗人NGAL的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株均保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)Jia:中國湖北省武漢市武漢大學(xué)，郵編:430072，保藏日期為2012年12月26日，保藏號分別為CCTCC N0.C2012197和CCTCC N0.C2012198，分類命名分別為雜交瘤細(xì)胞株NGAL (1-F2)和雜交瘤細(xì)胞株NGAL (1-G2)，在本申請中分別命名為1-F2和 1-G2。雜交瘤細(xì)胞株1-F2和1-G2均由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列免疫Balb/c小鼠后小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后培養(yǎng)產(chǎn)生。本發(fā)明還提供一種由雜交瘤細(xì)胞株1-F2所產(chǎn)生的單克隆抗體，該單克隆抗體的亞類屬于IgGl。本發(fā)明還提供一種由雜交瘤細(xì)胞株1-G2所產(chǎn)生的單克隆抗體。該單克隆抗體的亞類屬于IgGl。本發(fā)明還提供雜交瘤細(xì)胞株1-F2所產(chǎn)生的單克隆抗體和/或雜交瘤細(xì)胞株1-G2所產(chǎn)生的單克隆抗體制備腎損傷診斷或檢測制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種用于診斷或檢測腎損傷的試劑盒，其包含雜交瘤細(xì)胞株1-F2所產(chǎn)生的單克隆抗體和/或雜交瘤細(xì)胞株1-G2所產(chǎn)生的單克隆抗體。 本發(fā)明具體通過下述技術(shù)方案完成本發(fā)明的目的:1.NGAL重組蛋白的制備:從GENEBANK中獲得人NGAL編碼序列，通過擴(kuò)增人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白NGAL的基因片斷，將目的基因與真核表達(dá)載體連接，構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，表達(dá)人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白。純化重組蛋白并進(jìn)行純度、濃度和活性鑒定，得到高純度的NGAL重組蛋白。2.通過生物信息學(xué)預(yù)測，NGAL蛋白86位氨基酸有明顯糖基化，為能得到最好的能夠識別天然蛋白的特異性單克隆抗體，以方案I中得到的NGAL重組蛋白作為免疫原免疫動物Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)經(jīng)多次細(xì)胞融合，利用間接ELISA法和克隆化篩選出能穩(wěn)定分泌抗NGAL單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株并檢測其細(xì)胞培養(yǎng)上清的效價(jià)。之后進(jìn)行抗體亞類鑒定和抗體的特異性實(shí)驗(yàn)，證實(shí)得到的抗體是特異性針對NGAL的。3.建立NGAL的ELISA檢測體系:利用已制備的抗NGAL抗體作為捕獲抗體和檢測抗體，以NGAL重組蛋白作為檢測抗原，進(jìn)行抗體配對試驗(yàn)，經(jīng)過優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件，獲得能檢測天然NGAL的配對抗體并以此成功建立了檢測NGAL的雙抗體夾心ELISA方法。本發(fā)明通過雜交瘤技術(shù)，制備了抗NGAL單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1-F2和1_G2，能分泌相應(yīng)的NGAL特異性單克隆抗體，能進(jìn)行成功配對和檢測天然血清，初步建立了檢測NGAL的雙抗體夾心ELISA方法。
為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，作詳細(xì)說明如下。


圖1為NGAL基因逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析。其中，M為DNAMarker ;1_5 分別為五個(gè)退火溫度 60°C、62°C、64°C、66°C、68°C。圖2為pcDNA3.1-NGAL用EcoR I及Acc65 I雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析圖。其中，M 為 DNA marker ;泳道 I 為 pcDNA3.1，泳道 2 為 pcDNA3.1-NGAL0圖3為重組NGAL蛋白表達(dá)Western blot鑒定圖；其中，I為細(xì)胞提取蛋白；2為細(xì)胞培養(yǎng)上清。圖4為重組NGAL蛋白純化圖。其中I為紫外吸收曲線，2為溶液電導(dǎo)，3為純化抗體濃度，F(xiàn)1、F2、分別為指不同時(shí)間蛋白純化出現(xiàn)的吸收峰。圖5為純化后重組NGAL蛋白的SDS-PAGE鑒定。其中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I為純化后NGAL。圖6為ELISA鑒定單克隆抗體1_F2檢測NGAL重組蛋白。其中，左I孔為陰性對照，左 2 12 孔分別為抗體稀釋倍數(shù) 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000、1:1024000。圖7為ELISA鑒定單克隆抗體1_G2檢測NGAL重組蛋白。其中，左1_3孔為陰性對照,左 4 12 孔分別為抗體稀釋倍數(shù) 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000。
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圖8為Western blot鑒定單克隆抗體1-F2結(jié)合NGAL重組蛋白；其中，泳道I為重組蛋白NGAL ;泳道2為無關(guān)蛋白PCT。圖9為Western blot鑒定單克隆抗體1_G2結(jié)合NGAL重組蛋白。其中，泳道I為重組蛋白NGAL ;泳道2為無關(guān)蛋白PCT。圖10為標(biāo)準(zhǔn)ELISA檢測重組蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖11為標(biāo)準(zhǔn)ELISA檢測臨床標(biāo)本中NGAL結(jié)果(正常人與腎病患者比較)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過RT-PCR擴(kuò)增人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白NGAL的基因片斷，將目的基因與真核表達(dá)載體pcDNA3.1連接，構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NGAL0用重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞，表達(dá)人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白。利用pcDNA3.1構(gòu)建的NGAL真核表達(dá)質(zhì)粒在293細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示，表達(dá)的重組蛋白分子質(zhì)量約為25kD。采用蛋白親和層析柱純化NGAL重組蛋白，通過鎳柱純化后得到高純度NGAL重組蛋白，含量約為0.54mg/mL。本發(fā)明通過生物信息學(xué)預(yù)測得知NGAL蛋白86位氨基酸可能有糖基化，為能得到最好的能夠識別天然蛋白的特異性單克隆抗體，以293細(xì)胞表達(dá)的NGAL重組蛋白作為免疫原免疫動物Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)經(jīng)多次細(xì)胞融合，利用間接ELISA法和克隆化篩選出能穩(wěn)定分泌抗NGAL特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，腹水經(jīng)HiTrap IgGPurification HP親和層析柱純化,對所得的單克隆抗體進(jìn)行效價(jià)測定和親和力測定。經(jīng)篩選得到2株穩(wěn)定分泌NGAL特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1-F2和1-G2，經(jīng)亞類鑒定均為IgGl，2株單抗效價(jià)均在1:256000以上，親和力分別為6.39 X IO10M^1和3.65 X IO9M^1,Western blot鑒定表明2株單克隆抗體均具有較高的特異性。本發(fā)明建立了 NGAL的ELISA檢測體系:應(yīng)用抗NGAL抗體1_F2為捕獲抗體，抗NGAL抗體1-G2為檢測抗體，建立標(biāo)準(zhǔn)的雙抗體夾心ELISA檢測方法，能夠檢測尿液中的天然NGAL，并以此成功建立了檢測NGAL的雙抗體夾心ELISA方法。材料和來源實(shí)驗(yàn)動物:Balb/c小鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(中國重慶)。細(xì)胞株和質(zhì)粒:293細(xì)胞株中國典型培養(yǎng)物保藏中心購買(CCTCC)，pcDNA3.1質(zhì)粒購自Novagen公司。細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司，Lipo2000購自Novagen公司。酶及試劑盒:限制性內(nèi)切酶EcoR I及Acc65 I和質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)MEGA公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根公司。其它試劑:HRP-山羊抗小鼠IgG購自中山公司。實(shí)施例1NGAL重組蛋白的制備1.NGAL編碼序列全基因獲得 根據(jù)GeneBank提供的NGAL基因序列(NM_005564.3)，確定人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白基因擬克隆序列，具體如SEQ ID N0:2所不: 設(shè)計(jì)NGAL全長弓I物:分別如SEQ ID NO: 3和4所示SEQ ID NO:3 =NGAL-1:5’ -TAAGGTACCCATGCCCCTAGGTCTCCTG-3’SEQ ID NO::4:NGAL_2:5’ -GGTGGAATTTTAGCCGTCGATACACTG-3’引物分別含酶切位點(diǎn)=NGAL-1:Acc651 ;NGAL_2 =EcoR I，由 Invitrogen 公司合成。通過Trizol Reagent法提取白細(xì)胞總RNA,通過逆轉(zhuǎn)錄獲得白細(xì)胞cDNA,通過PCR擴(kuò)增獲得人NGAL，建立PCR體系，在不同的退火溫度下進(jìn)行PCR。取25 μ L PCR產(chǎn)物1%ΤΑΕ電泳進(jìn)行分析(圖1)。使用北京天根的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(普通離心柱型)回收PCR產(chǎn)物。2.NGAL重組質(zhì)粒構(gòu)建及酶切鑒定將pcDNA3.1載體及NGAL PCR回收產(chǎn)物分別用EcoR I和Acc65 I雙酶切消化Ih后，進(jìn)行DNA凝膠電泳，回收目的條帶，用T4DNA連接酶4°C過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，將菌液混勻后涂于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板上，37°C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日挑取單個(gè)菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)過夜。用質(zhì)粒提取試劑盒從培養(yǎng)細(xì)菌中提取質(zhì)粒，用EcoR I和Acc65 I雙酶切后行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在約600bp處可見特異性條帶,表明pcDNA3.1載體中已插入大小約為600bp的片段(圖2)。3.NGAL重組質(zhì)粒目的片斷測序?qū)cDNA3.1-NGAL重組質(zhì)粒送往上海英駿公司測序,并應(yīng)用Vector5.0工具將測序結(jié)果與GeneBank的NGAL序列進(jìn)行同源性分析。測序的結(jié)果顯示，插入片段長度為597bp，與GeneBank中報(bào)道的NGAL序列完全一致。4.NGAL重組蛋白的表達(dá)及鑒定
I) 293細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng)將凍存的293細(xì)胞迅速由液氮轉(zhuǎn)入37°C水浴中，將DMEM培養(yǎng)基和血清37°C預(yù)熱并配置含10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基。將細(xì)胞懸液移入37°C預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，1000rmp/min離心5min,棄上清,加入3_4mL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基并輕輕吹勻，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，置于5%C02>37dC孵育箱培養(yǎng),每日換液。2)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞將培養(yǎng)的293細(xì)胞接種至六孔板內(nèi)，次日觀察細(xì)胞長滿平板達(dá)90-95%密度，用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin2000 (Invitrogen公司)將重組質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后加入G418(800 μ g/ml )，培養(yǎng)3天，收取上清和細(xì)胞進(jìn)行Wester nblot鑒定(圖3)。確定轉(zhuǎn)染成功進(jìn)行克隆化，得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株并擴(kuò)大培養(yǎng)。3 ) NGAL重組蛋白的表達(dá)和純化收取培養(yǎng)上清，使用蛋白親和層析柱(Ni2+22DA2Sepharose Fast Flow)純化重組蛋白(圖4)。收集得到成品蛋白，然后分別取樣行SDS-PAGE電泳(圖5)，經(jīng)HPLC檢測其純度為95%。5.NGAL重組蛋白濃度、純度鑒定Lowry法測定重組蛋白濃度:按照常規(guī)方法制備用于分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定標(biāo)本濃度，多管計(jì)算平均值，測得濃度為0.54mg/ml。實(shí)施例2生物信息學(xué)分析及免疫原的確定1.從GENEBANK中查找NGAL蛋白的氨基酸序列，該蛋白由198個(gè)氨基酸殘基組成。 2.在線生物信息學(xué)糖基化預(yù)測分析NGAL蛋白中86位氨基酸可能會被糖基化，為能得到最好的能夠識別天然蛋白的特異性單克隆抗體，選取293細(xì)胞表達(dá)的全長NGAL蛋白作為免疫原，其氨基酸序列具體同SEQ ID N0:1。實(shí)施例3抗NGAL單克隆抗體的制備1.NGAL單克隆抗體的制備將重組全長NGAL蛋白與等量的弗氏完全佐劑乳化，抗原乳化采用雙注射器互推法。乳化完成后，以四肢皮下多點(diǎn)注射加腹腔注射途徑對5只8周齡左右的Balb/c小鼠，進(jìn)行基礎(chǔ)免疫(100 μ g/小鼠)。2周后，將NGAL全抗原與等量的弗氏不完全佐劑乳化，以四肢皮下多點(diǎn)注射加腹腔注射途徑對5只Balb/c小鼠，進(jìn)行追加免疫(100 μ g/小鼠)；2周后，再采用同樣方式追加免疫一次，7天后處死取出小鼠脾臟，將脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。融合過程為將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(Sp2/0)以8:1混合，以聚乙二醇為融合劑。融合細(xì)胞懸于含小牛血清的HAT培養(yǎng)液中，并置于6%C02中在37°C培養(yǎng)。用ELISA法進(jìn)行篩選。對檢出的陽性克隆孔采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，并置于5%C02中于37°C培養(yǎng)，直至所有細(xì)胞生長孔的培養(yǎng)液均呈陽性為止，即可進(jìn)行單克隆抗體的擴(kuò)大培養(yǎng)。采用小鼠腹腔內(nèi)誘生單克隆抗體的方法進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。取已成年的Balb/c小鼠，于腹腔內(nèi)注入液態(tài)石蠟0.5mL, I周后再于腹腔內(nèi)注入雜交瘤細(xì)胞。用生理鹽水將雜交瘤細(xì)胞懸浮混勻，并將細(xì)胞數(shù)調(diào)至4X IO5個(gè)/mL，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL雜交瘤細(xì)胞。10-14天后收集腹水。 2.NGAL單克隆抗體的純化
收集腹水后對其進(jìn)行純化，具體方案為:配置抗體純化所需buffer:BindingBufferCA 液，20mmol/L 憐酸鈉，0.8mol/L (NH4) 2S04, ρΗ7.5)；Elution BufferCB 液，20mmol/L 憐酸鈉，ρΗ7.5) !Regeneration buffer (C 液，20mmol/L 憐酸鈉，pH7.5,并按體積比 30%加入異丙醇)。在單抗腹水中加入硫酸銨，使其終溶度與A液中硫酸銨的溶度一致，0.45 μ m濾膜過濾等待上樣；選用HiTrap IgG Purification HP柱接入AKTA prime蛋白純化儀,用A、B液和C液對柱子進(jìn)行充分洗滌，用A液進(jìn)行充分平衡后，將準(zhǔn)備的樣品從A管上樣，上樣后用A液平衡柱子，去除雜蛋白，再用B液洗脫純化柱，收集洗脫峰；調(diào)節(jié)洗脫蛋白的pH至7.0-8.0，將抗體分裝冷凍于_20°C保存；用C液使填料進(jìn)行再生，然后用A液進(jìn)行平衡即可。3.抗NGAL單克隆抗體亞類的鑒定米用美國Sigma 公司 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping ReagentsCELISA/Ouchterlony Double Diffusion, Stock N0.1S0_2L0T114k4817),操作按說明書進(jìn)行。I)包被酶標(biāo)板:用包被液將NGAL重組蛋白稀釋為最佳工作濃度5 μ g/mL，每孔加100 μ L抗原液，每株加12孔，于4°C過夜，洗滌5遍，空干。2)封閉:每孔加封閉液350yL，37°C孵育Ih 1.5h，洗滌5遍，空干。3)每孔加入100 μ I新鮮的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清或稀釋單抗，室溫(20°C 25°C)靜置lh，搖洗3min，共5次。4)用抗體稀釋液以 1:2000 稀釋 IgM、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG、IgA。5)每孔加入IOOyL已稀釋的抗體，每種抗體均加2孔，室溫靜置30min，搖洗3min,共 5 次。6)每孔加入100 μ L1:1000稀釋的兔抗羊IgG抗體，室溫靜置15min，搖洗3min，
共5次。7)每孔加入100 μ L底物顯色液,室溫避光反應(yīng)IOmin 15min。h.每孔加入50 μ L
終止液，觀察結(jié)果，確定Ig亞類。4.單克隆抗體親和力鑒定以Friguent法測定親和力常數(shù)，將NGAL抗原溶解在0.05mol/L碳酸緩沖液(pH9.6)中，終濃度為I μ g/ml,以每孔100 μ I的量將溶液加到96孔板中4°C包被過夜，以含1%BSA的PBS溶液對板進(jìn)行封閉,將板干燥后在4°C保存?zhèn)溆?。反?yīng)系統(tǒng)的建立:反應(yīng)系統(tǒng)中抗NGAL單抗的初始濃度為20ng/mL。NGAL抗原的初始濃度從1000ng/ml (1250x 10mol/L)往下倍比稀釋，形成8個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)，在37°C反應(yīng)Ih ;以每孔100 μ I將反應(yīng)液以雙孔加入到包被了 NGAL抗原的免疫反應(yīng)板，37°C孵育Ih后洗板5次；加人100 μ I山羊抗鼠二抗每結(jié)合物溶液37°C反應(yīng)lh，洗板5次，加人底物顯色15min后加人終止液，測定0D450值計(jì)算各個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)的抗原結(jié)合率推算親和力常數(shù)，得出1-F2 親和力為 6.39 X IO10ITi, 1-G2 為 3.65 X IO9M'5.ELISA鑒定抗NGAL單克隆抗體將純化的NGAL抗原用包被稀釋液稀釋至5 μ g/ml, ELISA條板每孔加入100 μ 1，4°C包被過夜。次日取出板子棄抗原，洗板。將待鑒定單克隆抗體作1:1000，1:2000，1:4000，
1:8000,1:16000..... .，按100 μ I/孔加入對應(yīng)條孔中，另作空白及陰陽對照孔。37°C孵育
lh，洗板，加入二抗，1:3000稀釋HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，按100 μ I/孔加入對應(yīng)條孔中，37°C孵育40min。棄液，洗板，拍干，加入底物液100 μ I/孔，避光顯色lOmin，加入終止液50 μ I/孔。結(jié)果可見，抗NGAL單克隆抗體1-F2和1_G2呈現(xiàn)肉眼可見的濃度梯度(圖6、圖7)。6.抗NGAL單克隆抗體的Western blot鑒定I)將 Marker3y 1、如六1^抗原20“1、無關(guān)蛋白 procalcitonin (PCT)20 μ I 電泳。2)電泳結(jié)束后，取下凝膠，置于轉(zhuǎn)印緩沖液中平衡lOmin。3)將0.22 μ m PVDF膜先用無水甲醇處理20s，再用ddH20洗滌5min。然后再浸入Transfer Buffer 超過 5min。同時(shí)將濾紙浸入 Transfer Buffer 中。4)轉(zhuǎn)膜:從下至上依次排列，濾紙-PVDF膜-膠-濾紙，排出氣泡，放入轉(zhuǎn)膜儀，18V恒壓電轉(zhuǎn)移1.5h。5)轉(zhuǎn)膜完成后，在膜上可見清晰蛋白marker，ddH20清洗兩遍，TBST洗5min。將轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中，室溫封閉2h。6)棄去封閉液，用I X TBST漂洗膜3次，每次15min。7)加入以1:1000稀釋的純化抗體，4°C孵育過夜。8) I XTBST 漂洗膜 3 次，每次 15min。9)加入已稀釋到1:10000的HRP-羊抗小鼠IgG抗體，37°C孵育3h。10) IXTBST 洗滌 3 次，每次 15min。
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11)用化學(xué)發(fā)光顯色，顯影定影后，觀察分析結(jié)果并攝像。在重組NGAL蛋白25KD處均可見抗NGAL單克隆抗體結(jié)合清晰條帶(圖8、圖9)。實(shí)施例4雙抗體夾心ELISA法檢測標(biāo)準(zhǔn)中的NGAL1.HRP標(biāo)記抗體本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與抗體蛋白的氨基相結(jié)合，所獲酶標(biāo)記抗體的產(chǎn)率高，具體步驟如下:稱取IOmg HRP酶，加2mL純水配置為5mg/ml的HRP液體，按照每mg HRP酶加入34 μ L計(jì)算，加340 μ LNaIO4,4°C避光放置，Ih后，按照每mg HRP酶加入250 μ L的量加入乙二醇250 μ L，避光放置4°C，30min后轉(zhuǎn)入透析袋中，用ImM醋酸緩沖液(pH4.0-4.4)透析過夜，期間至少換液2次，均要求避光?？贵w的準(zhǔn)備:
0.0lM的PBS緩沖液進(jìn)行4°C透析過夜，并測定蛋白濃度。標(biāo)記:抗體與HRP酶按1:1(質(zhì)量比)混合，加入ImoVLNa2CO3緩沖液(1:80)，調(diào)解反應(yīng)的pH為9.5，25°C反應(yīng)2_3h。終止:新鮮配制0.1moVLNaH4B (4mg/mL),按照每mg HRP酶加入47 μ I。4°C放置2h后，轉(zhuǎn)入透析袋。用0.0lmol/L PBS緩沖液(pH7.0-7.2)透析過夜，期間至少換液兩次，避光。分裝保存:標(biāo)記好的抗體用避光EP管分裝，并測定抗體效價(jià)。_20°C保存。2.抗體配對及臨床樣本的檢測I)標(biāo)本收集:從第三軍醫(yī)大學(xué)第一和第二附屬醫(yī)院收集臨床診斷明確腎病患者的尿液標(biāo)本，取回過程中用冰袋儲存，以保持標(biāo)本新鮮，離心取上清加防腐劑后做好標(biāo)記分裝于1.5ml Ep管中，-80 V保存，并將病人基本信息錄入電腦，做好編號。2)標(biāo)本檢測:選取單克隆抗體1-F2作為捕獲抗體，酶標(biāo)單克隆抗體1-G2作為檢測抗體，重組蛋白NGAL為標(biāo)準(zhǔn)品，樣本檢測方法如下:
a.包被酶標(biāo)板:用包被液將抗體稀釋為5 μ g/ml，每孔加100 μ 1，4°C包被過夜。b.將包被過夜的酶標(biāo)板洗3遍，甩干。c.封閉:每孔加封閉液350 μ 1，37°C孵育lh，洗滌3遍，甩干。d.用抗體稀釋液將NGAL重組蛋白從500ng/ml開始倍比稀釋，每孔加100 μ 1，第一孔為空白對照，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測33例腎損傷標(biāo)本，24例正常標(biāo)本，每孔加100μ 1，37°C孵育Ih。e.洗板3遍，甩干。f.將相對應(yīng)的酶標(biāo)二抗以1:5000稀釋，每孔加入100μ 1，37°C孵育30min。g.洗板5遍,甩干。h.每孔加入100 μ I底物顯色液，室溫避光顯色5min。1.每孔加入50 μ I終止液，讀板，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定臨床樣本中NGAL的含量。3)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用SPSS13.0軟件將心梗組合正常對照組用ELISA所測NGAL結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果表明，利用配對抗體1-F2-1-G2和NGAL重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)品成功繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖10)，并且在對24例正常尿液和33例腎損傷患者尿液檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，33例腎病患者(285.854ng/ml)顯著高于24例正常血清(6.155ng/ml ;Ρ〈0.01)(圖11)，說明配對抗體能夠成功應(yīng)用于天然血清中NGAL的檢測。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許之更動與改進(jìn)，因此本發(fā)明之保護(hù)范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生抗人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號為CCTCC N0.C2012197。
2.—種產(chǎn)生抗人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號為CCTCC N0.C2012198。
3.如權(quán)利要求1或2所述的雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于，由SEQID NO:1所示的氨基酸序列免疫Balb/c小鼠后，小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后培養(yǎng)產(chǎn)生。
4.如權(quán)利要求1或2所述的雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于，所述人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的基因序列如SEQ ID NO: 2所不。
5.一種由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株所產(chǎn)生的單克隆抗體。
6.如權(quán)利要求5所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的亞類屬于IgGl。
7.一種由權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞株所產(chǎn)生的單克隆抗體。
8.—種如權(quán)利要求7所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的亞類屬于IgGl。
9.如權(quán)利要求5和/或7所述的單克隆抗體在制備人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白免疫檢測制劑中的應(yīng)用。
10.一種用于診斷或檢測腎損傷的試劑盒，其特征在于，包含如權(quán)利要求5和/或7所述的單克隆 抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了產(chǎn)生抗人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及由其產(chǎn)生的單克隆抗體。所述雜交瘤細(xì)胞株由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列免疫Balb/c小鼠后，小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后培養(yǎng)產(chǎn)生。所述的抗體，能夠用于人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋的免疫檢測。藉此能夠開發(fā)出人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋的免疫檢測試劑，用于診斷或檢測急性腎損傷等疾病。
文檔編號C12N5/20GK103074303SQ20121058048
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者陳安, 胡川閩, 何瑩, 易維京 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)