專利名稱：截短的vegf相關(guān)蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的截短形式的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)相關(guān)蛋白質(zhì)。特別是本發(fā)明涉及基本上不含有其它蛋白質(zhì)的N-末端截短的VEGF相關(guān)蛋白質(zhì)。這種截短的VEGF相關(guān)蛋白質(zhì)可被用于體內(nèi)和體外刺激血管生成。
本發(fā)明也涉及編碼這種新的截短的VEGF相關(guān)蛋白質(zhì)的核苷酸，含有這種核苷酸的細(xì)胞，組織和動(dòng)物；使用這種核苷酸的治療方法；和與上述所有內(nèi)容相關(guān)的方法。
背景血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，也被稱作血管通透性因子(VPF)，是多種器官中的不同細(xì)胞類型產(chǎn)生的一族蛋白質(zhì)，并以高度選擇性的方式(幾乎是專門地)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞(Ferrara等，內(nèi)分泌學(xué)評論，1318-32，(1992)的綜述；Dvorak等，美國生理學(xué)雜志，1461029-39，1995；Thomas，生物化學(xué)雜志，271603-6，1996)。這些文獻(xiàn)以及本文引用的其它文獻(xiàn)全部引入本文作為參考。
當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)中檢測時(shí)，VEGF具有強(qiáng)的促細(xì)胞分裂作用(Gospodarowicz等，美國科學(xué)院院刊，867311-15，1989)和趨化作用(Favard等，生物學(xué)細(xì)胞(Biol.Cell)731-6，1991)。此外，VEGF誘導(dǎo)纖溶酶原激活劑、纖溶酶原激活劑抑制劑、和纖溶酶原激活劑受體(Mandriota等，生物化學(xué)雜志2709709-16，1995；Pepper等，181902-06，1991)，以及膠原酶(Unemori等，細(xì)胞生理學(xué)雜志153557-62，1992)、調(diào)節(jié)生長中的毛細(xì)血管向組織中侵入的酶系統(tǒng)。VEGF也通過內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)管狀結(jié)構(gòu)的形成，這是一個(gè)體外血管生成的例子(Nicosia等，美國生理學(xué)雜志，1451023-29，1994)。
在體內(nèi)，VEGF誘導(dǎo)血管生成(Leung等，科學(xué)2461306-09，1989)和提高血管通透性(Senger等，科學(xué)219983-85，1983)。現(xiàn)已知VEGF是重要的毛細(xì)血管形成的生理調(diào)節(jié)劑。在器官生長中，它們參與正常的新的毛細(xì)血管的形成，包括胎兒生長(Peters等，美國科學(xué)院院刊908915-19，1993)，組織修復(fù)(Brown等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1761375-79，1992)，月經(jīng)周期，和懷孕(Jackson等，Placenta 15341-53，1994；Cullinanand Koos，內(nèi)分泌學(xué)133829-37，1993；Kamat等，美國生理學(xué)雜志146157-65，1995)。在胎兒發(fā)育過程中，VEGF好像在血管從血島的從頭生成中起著重要的作用(Risau和Flamme，細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)年度評論1173-92，1995)，這是在缺少一個(gè)單一的VEGF等位基因的胚胎中異常血管發(fā)育和致死性所證實(shí)的(Carmeliet等，自然380435-38，1996)。而且，VEGF與許多疾病的病理性血管生長特征相關(guān)，包括實(shí)體瘤(Potgens等，Biol.Chem.Hoppe-Seyler 37657-70，1995)，視網(wǎng)膜病(Miller等，美國病理學(xué)雜志145574-84，1994Aiello等，N.Engl.J.Med.3311480-87，1994；Adamis等，美國眼科學(xué)雜志118445-50，1994)，牛皮癬(Detmar等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1801141-46，1994)，和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Fava等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志180341-46，1994)。
VEGF表達(dá)是通過激素(Schweiki等，臨床調(diào)查雜志912235-43，1993)生長因子(Thomas，生物化學(xué)雜志271603-06，1996)，和通過氧過少(Schweiki等，自然359843-45，1992，Levy等，生物化學(xué)雜志2712746-53，1996)調(diào)節(jié)的。氧過少條件下對VEGF的向上調(diào)節(jié)作為一種補(bǔ)償機(jī)制特別重要，該機(jī)制通過誘導(dǎo)額外的毛細(xì)血管形成和導(dǎo)致血流增加提高組織的氧化能力。該機(jī)制被認(rèn)為在腫瘤和視網(wǎng)膜病的病理性血管形成中起一份作用。但是，缺氧后VEGF表達(dá)的向上調(diào)節(jié)對組織修復(fù)也是必需的，例如，在表皮損傷的愈合中(Frank等，生物化學(xué)雜志27012607-613，1995)，冠狀缺血(Banai等，心血管研究281176-79，1994；Hashimoto等，美國病理學(xué)雜志267H1948-H1954，1994)。
在血管缺血的動(dòng)物模型中VEGF治療性地誘導(dǎo)血管生成的能力已在兔慢性肢體局部缺血模型中得到證實(shí)，這是通過重復(fù)地進(jìn)行肌肉注射或施用單個(gè)動(dòng)脈內(nèi)VEGF的劑團(tuán)可提高旁系血管形成所證實(shí)的，這是通過測量局部缺血的后肢中血流量進(jìn)行的(Pu等，循環(huán)88208-15，1993；Bauters等，美國生理學(xué)雜志267H1263-71，1994；Takeshita等，循環(huán)90[第二部分]，II-228-34，1994；Bauters等，血管外科雜志21314-25，1995；Bauters等，循環(huán)912802-09，1995；Takeshita等，臨床調(diào)查雜志93662-70，1994)。在這一模型中，VEGF也顯示出與堿性FGF協(xié)同作用改善局部缺血(Asahara等，循環(huán)92[增刊2]，II-365-71，1995)。據(jù)報(bào)道，VEGF也可加速氣囊損傷的大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮的修復(fù)，從而抑制下面的平滑肌層的病理性加厚，使腔直徑和血流保持不變(Asahara等，循環(huán)912793-2801，1995)。VEGF也顯示出在犬冠狀動(dòng)脈中誘導(dǎo)EDRF(產(chǎn)生于內(nèi)皮的松弛因子(氧化氮))-依賴性松弛，從而可能通過與血管生成不相關(guān)的第二機(jī)制提高局部缺血區(qū)域的血流(Ku等，美國生理學(xué)雜志265H586-H592，1993)。這些數(shù)據(jù)結(jié)合在一起提供了VEGF對傷口愈合，局部缺血疾病和再狹窄具有治療作用的證據(jù)。
VEGF家族由至少4個(gè)成員組成，VEGF-121，VEGF-165，VEGF-189，VEGF-206。最初被表征的VEGF是一種34-45kDa的糖基化的蛋白質(zhì)，它由兩個(gè)相同的165個(gè)氨基酸殘基的亞基組成(Tischer等，生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊1651198-1206，1989)。VEGF-165 cDNA編碼一個(gè)191殘基的氨基酸序列，它是由一個(gè)26殘基的分泌信號肽序列和165殘基的成熟蛋白亞基組成的，分泌信號肽序列在該蛋白質(zhì)從細(xì)胞中分泌后被切除。VEGF強(qiáng)烈地與肝素結(jié)合，在殘基115至159之間的強(qiáng)堿性序列被認(rèn)為與此有關(guān)(

圖1)(Thomas，生物化學(xué)雜志，271603-06(1996))。VEGF家族的其它成員為具有或長或短的同源二聚體，其長度為121，189和206殘基(分別為VEGF-121，VEGF-189，和VEGF-206)(Tischer等，生物化學(xué)雜志26611947-54，1991；Park等，細(xì)胞的分子生物學(xué)41317-26(1993))。這4種形式的VEGF產(chǎn)生于VEGF基因的多達(dá)8個(gè)外顯子的不同剪切(VEGF-121，外顯子1-5，8；VEGF-165，外顯子1-5，7，8；VEGF-189，外顯子1-5，6a，7，8；VEGF-206，外顯子1-5，6b，7，8(外顯子6a和6b是指同一個(gè)外顯子的兩種不同的剪切形式))(Houck等，分子內(nèi)分泌學(xué)，51806-14(1991))。VEGF序列含有8個(gè)保守的二硫鍵形成核心半胱氨酸殘基。所有的VEGF基因編碼指導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入分泌途徑的信號肽。但是，僅僅發(fā)現(xiàn)VEGF-121和-165可容易地被培養(yǎng)的細(xì)胞分泌，而VEGF-189和-206仍然與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)。這些VEGF形式具有一個(gè)額外的高堿性序列，相應(yīng)于VEGF-189和-206中的殘基115-139(基質(zhì)靶擊序列)，它賦予對細(xì)胞外基質(zhì)的酸性組分的高度的親和性(Thomas，生物化學(xué)雜志271603-06(1996))。
各種VEGF同種型的促細(xì)胞分裂活性根據(jù)每一個(gè)同種型而有所不同。例如，VEGF-121和VEGF-165對內(nèi)皮細(xì)胞具有相似的促細(xì)胞分裂活性。但是，VEGF-189和VEGF-206僅具有微弱的促細(xì)胞分裂活性(Ferrara等，內(nèi)分泌學(xué)評論1318-32，1992)。這些同種型活性的降低被歸因于它們的強(qiáng)烈的與細(xì)胞和基質(zhì)的親和性，這是通過缺乏24殘基的“基質(zhì)靶擊”序列的VEGF-206突變體的正常的促細(xì)胞分裂活性所證實(shí)，該“基質(zhì)靶擊”序列在VEGF-189和VEGF-206中均存在(圖1中的殘基115-139)(Ferrara等，內(nèi)分泌學(xué)評論1318-32，1992)。
由血纖維蛋白溶酶產(chǎn)生的VEGF-165的N-末端片斷(VEGF(1-110))與KDR受體的結(jié)合與VEGF-165和VEGF-121具有相同的親和性，而C-末端VEGF片斷(111-165)不具有結(jié)合活性(Keyt等，生物化學(xué)雜志2717788-95，1996)。令人感興趣的是，在這一研究中，VEGF-121和VEGF-110的促細(xì)胞分裂活性與VEGF-165相比降低了約110倍，提示了VEGF-165的C-末端區(qū)域在VEGF同種型的生物學(xué)效力中的潛在作用。鑒于先前的顯示VEGF-121和VEGF-165對內(nèi)皮細(xì)胞生長具有相同效力的結(jié)果，這一發(fā)現(xiàn)的意義就不太清晰。而且，由于VEGF與KDR受體的功能性相互作用被認(rèn)為至少部分依賴于細(xì)胞表面硫酸肝素蛋白聚糖(Cohen等，生物化學(xué)雜志，27011322-26，1995；Tessler等，生物化學(xué)雜志，26912456-61，1994)，可以想象，結(jié)果的不同產(chǎn)生于各種實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的不同。在這一方面，還不清楚在多大程度上細(xì)胞表面硫酸肝素調(diào)節(jié)VEGF-121(缺乏肝素結(jié)合區(qū)域)和VEGF-165(具有肝素結(jié)合區(qū)域)的功能性相互作用(Tessler等，生物化學(xué)雜志26912456-61，1994；Cohen等，生物化學(xué)雜志，27011322-26，1995；Gitay-Goren等，生物化學(xué)雜志，2715519-23(1996))。VEGF與血小板來源的生長因子(PDGF)相關(guān)(Andersson等，生長因子12159-64，1995)。VEGF也與來源于胎盤生長因子(PlGF)基因，PlGF-129和PlGF-150，的蛋白質(zhì)家族相關(guān)(Maglione等，美國科學(xué)院院刊，889267-71，1991；癌基因8925-31，1993)。最近已鑒定出幾種額外的VEGF-相關(guān)的基因，并被命名為VEGF-B(也被稱作VEGF-相關(guān)因子VRF-1)(Grimmond等，基因組研究，6122-29，1996；Olofsson等，美國科學(xué)院院刊，932567-81，1996)VRF-2(Grimmond等，基因組研究，6122-29，1996)，和VEGF-C(Joukov等，EMBO J，15290-98，1996；Lee等，美國科學(xué)院院刊，931988-92，1996)和VEGF-3(PCT申請第PCT/US95/07283號，1996年12月12日公開，
發(fā)明者皮特·波赫恩 申請人:科萊特諾醫(yī)療公司