專利名稱：一個(gè)番茄抗蟲相關(guān)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，特別是涉及一個(gè)番茄抗蟲相關(guān)基因及其編碼蛋白與其在培育抗蟲植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，在世界范圍內(nèi)，因昆蟲侵害對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量造成的損失十分嚴(yán)重。傳統(tǒng)控制昆蟲侵害的方法中最普遍采用的是大量施用化學(xué)殺蟲劑。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界通過(guò)植保措施增加的產(chǎn)量中有80％依靠農(nóng)藥?；瘜W(xué)殺蟲劑的使用在取得了一定經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也帶來(lái)了農(nóng)藥殘毒、環(huán)境污染、生態(tài)破壞、害蟲抗藥性和再猖獗等嚴(yán)重問(wèn)題。因此，研究和利用植物的自身抗性基因從而有效控制農(nóng)業(yè)蟲害成為人類孜孜以求的目標(biāo)。
在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，植物為抵抗昆蟲的捕食，建立起復(fù)雜多樣的抗性反應(yīng)機(jī)制?？傮w上講，植物對(duì)昆蟲的抗性分為組成型抗性和誘導(dǎo)型抗性兩種類型。誘導(dǎo)型抗性是指植物受到昆蟲侵害后，迅速合成一系列對(duì)昆蟲具有毒性的化學(xué)物質(zhì)，從而對(duì)昆蟲的進(jìn)食、消化吸收、生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖等活動(dòng)產(chǎn)生抑制作用，最終達(dá)到抗蟲的目的。與組成型抗性相比，誘導(dǎo)型抗性是一種更為主動(dòng)且更為經(jīng)濟(jì)有效的抗性反應(yīng)方式，該種抗性更具有理論研究意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。因此，利用植物自身的抗性建立一種無(wú)殘毒、無(wú)污染的農(nóng)業(yè)害蟲可持續(xù)控制途徑是我國(guó)乃至世界農(nóng)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。
在研究植物與農(nóng)業(yè)病蟲害相互作用關(guān)系中，番茄是公認(rèn)的模式植物。番茄中存在對(duì)昆蟲抗性反應(yīng)強(qiáng)弱的標(biāo)志物—蛋白酶抑制劑(Proteinase Inhibitors，PIs)。蛋白酶抑制劑是一類富含絲氨酸的小分子量堿性蛋白質(zhì)分子，通過(guò)抑制昆蟲體內(nèi)消化酶的活性而達(dá)到抗蟲的目的。當(dāng)番茄植株受到昆蟲侵害后會(huì)大量合成PIs等與抗性相關(guān)的物質(zhì)，并且PIs不只是在受傷的部位大量合成(稱為局部反應(yīng))，在植物其它部位，包括未受傷的葉片中也可合成(稱為系統(tǒng)反應(yīng))，是一種植物系統(tǒng)的抗性反應(yīng)。
對(duì)于這種植物系統(tǒng)的抗性反應(yīng)，一種傳統(tǒng)假說(shuō)解釋為即對(duì)應(yīng)于昆蟲的侵害(或機(jī)械受傷)刺激，植物會(huì)合成一類信號(hào)分子(Signal)，這類信號(hào)分子可以長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)街参锶淼母鱾€(gè)部位，包括未受傷的葉片，從而誘導(dǎo)抗性相關(guān)基因的表達(dá)。目前所鑒定到的信號(hào)分子主要包括多肽信號(hào)分子系統(tǒng)素(Systemin)以及來(lái)源于不飽和脂肪酸的植物激素茉莉酸(Jasmonic acid，JA)。
系統(tǒng)素是從番茄葉片中提取到的能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)PIs表達(dá)的由18個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，是由其前體產(chǎn)物—一個(gè)由200個(gè)氨基酸組成的前系統(tǒng)素(Prosystemin)的C-末端剪切而來(lái)的。系統(tǒng)素在番茄系統(tǒng)抗性中起到必不可少的作用。在受傷葉片上體外飼喂經(jīng)同位素標(biāo)記的系統(tǒng)素可以檢測(cè)到系統(tǒng)素在韌皮部“運(yùn)動(dòng)”。據(jù)此，Ryan教授提出系統(tǒng)素是系統(tǒng)抗性中進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)男盘?hào)分子(Ryan，C.A.1992.Thesearch for the proteinase inhibitor inducing factor，PIIF.Plant Mol.Biol.19，123-134.)。
受傷反應(yīng)刺激系統(tǒng)素從其前體蛋白-前系統(tǒng)素上剪切下來(lái)。生化研究表明，系統(tǒng)素可與位于膜上的受體蛋白SR160特異性結(jié)合。SR160是一個(gè)富含亮氨酸的受體蛋白激酶，它含有一個(gè)位于細(xì)胞外的富含亮氨酸區(qū)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)位于細(xì)胞內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)素和SR160結(jié)合后會(huì)引發(fā)特定的磷酸脂酶的活性以釋放JA合成的最初底物亞麻酸(Linolenic acid)，從而誘導(dǎo)JA的生物合成并隨之參與誘導(dǎo)抗性相關(guān)基因的表達(dá)。系統(tǒng)素和JA通過(guò)一個(gè)共同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)控抗性相關(guān)基因的局部和系統(tǒng)表達(dá)。
目前，有關(guān)JA合成的生化途徑已經(jīng)基本清楚，但有關(guān)JA生物合成的調(diào)控以及JA的信號(hào)傳導(dǎo)途徑仍知之甚少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)番茄抗蟲相關(guān)基因及其編碼蛋白。
本發(fā)明所提供的番茄抗蟲相關(guān)基因，名稱為L(zhǎng)eAcx1，來(lái)源于番茄屬番茄(lycopersicon esculentum)，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的多核苷酸；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的DNA；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由2248個(gè)堿基組成，其編碼框?yàn)樽?’端第108-第2102位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明所提供的與番茄抗蟲相關(guān)基因的編碼蛋白LeAcx1是具有下述氨基酸殘基序列之一的多肽1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與番茄抗蟲相關(guān)的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №2由664個(gè)氨基酸殘基組成。
含有上述與番茄抗蟲相關(guān)基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌以及擴(kuò)增與番茄抗蟲相關(guān)基因中任一片段的引物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
利用植物表達(dá)載體，將本發(fā)明的番茄抗蟲相關(guān)基因?qū)胫参锛?xì)胞或組織，可得到對(duì)蟲害耐受力增強(qiáng)的植物。
使用LeAcx1構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
攜帶有本發(fā)明LeAcx1的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、玉米、小麥等單子葉植物，也可以是番茄、擬南芥、煙草、棉花等雙子葉植物。
本發(fā)明的番茄LeAcx1突變將導(dǎo)致JA合成缺失及相關(guān)抗性基因表達(dá)的喪失。該基因位于JA合成途經(jīng)的下游，在由JA前體物質(zhì)12-OPDA(12-oxo-phytodienoic acid，12-OPDA)轉(zhuǎn)化為JA的過(guò)程中起重要作用。12-OPDA本身不能作為抗性反應(yīng)的信號(hào)分子，它需要被運(yùn)輸?shù)竭^(guò)氧化物酶體，經(jīng)過(guò)三輪β-氧化形成JA后才能作為信號(hào)分子而誘導(dǎo)抗性相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)控對(duì)昆蟲的抗性。同時(shí)，因?yàn)樵摶蚴侵舅峤到獾谋亟?jīng)途經(jīng)-β-氧化的限速酶，因而在遺傳調(diào)控番茄脂肪酸含量方面也有具有重要價(jià)值。番茄果實(shí)脂肪酸的含量及組成對(duì)其品質(zhì)、風(fēng)味、及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有重要影響。利用LeAcx1過(guò)量表達(dá)或反義表達(dá)(JL1突變體本身就是反義表達(dá)的品系)的轉(zhuǎn)基因材料，可以獲得品質(zhì)性狀突出的番茄轉(zhuǎn)基因品系。此外，在其它農(nóng)作物如油料作物大豆中可獲得LeAcx1的對(duì)等基因并進(jìn)行類似的轉(zhuǎn)基因研究。LeAcx1在植物對(duì)昆蟲抗性育種和品質(zhì)改良中將發(fā)揮巨大作用。


圖1為L(zhǎng)eAcx1基因圖位克隆的遺傳圖譜圖2為轉(zhuǎn)LeAcx1植株的抗蟲效果試驗(yàn)結(jié)果圖3為正常番茄植株和過(guò)量表達(dá)LeAcx1的轉(zhuǎn)基因番茄植株(35S∷LeAcx1)上生長(zhǎng)的昆蟲(tobaco hornworm)的比較具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、番茄抗性缺失突變體JL1的獲得選用番茄常規(guī)品種M82為實(shí)驗(yàn)材料，將其種子浸泡于0.5％甲基磺酸乙酯(ethylmethyl sulfonate，EMS)中12小時(shí)進(jìn)行誘變處理，經(jīng)培養(yǎng)后對(duì)其后代材料進(jìn)行蛋白酶抑制劑II的有無(wú)抗性檢測(cè)，對(duì)缺失蛋白酶抑制劑II的材料進(jìn)行自交繁殖。每一世代都用上述同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)，最后選擇對(duì)蛋白酶抑制劑抗性缺失的單株進(jìn)行自交繁殖，經(jīng)過(guò)5個(gè)世代的選擇，得到穩(wěn)定的番茄抗性缺失突變體材料，命名為JL1。
該突變體JL1最基本的表型特征是受傷后缺乏抗性相關(guān)蛋白PIs的表達(dá)，對(duì)其進(jìn)行接蟲試驗(yàn)，結(jié)果該突變體對(duì)昆蟲抗性喪失，進(jìn)一步分析表明受傷后的JL1植株中茉莉酸(JA)的積累水平僅為正常植株的4％，但JA合成中間產(chǎn)物12-OPDA的積累是正常的。
實(shí)施例2、LeAcx1的獲得1、用圖位克隆的方法獲得番茄LeAcx1通過(guò)對(duì)包含1200個(gè)個(gè)體的大群體進(jìn)行精細(xì)作圖分析，將目的基因定位到番茄第8號(hào)染色體上一個(gè)長(zhǎng)度約為80KB的由BAC克隆166B24和232L13所覆蓋的區(qū)域，如圖1所示(數(shù)字代表分子標(biāo)記與目的基因間重組體的個(gè)數(shù))，對(duì)該DNA片段進(jìn)行序列分析，預(yù)測(cè)該BAC克隆覆蓋8個(gè)基因，其中首尾相連的兩個(gè)?；o酶氧化酶(Acyl-CoAOxidase，ACX)基因被認(rèn)為是造成JL1抗性缺失基因JL1(將與導(dǎo)致JL1蛋白酶抑制劑抗性缺失的相關(guān)基因統(tǒng)稱為JL1)的重要候選基因，分別命名為L(zhǎng)eAcx1、LeAcx2，其中，LeAcx1具有序列表中SEQ ID №1的多核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №1由2248個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第108-第2102位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。從功能上說(shuō)，酰基輔酶氧化酶是植物脂肪酸β-氧化第一步所需的酶也是限速酶，這與根據(jù)JL1突變體的表型所預(yù)測(cè)的JL1在由12-OPDA轉(zhuǎn)化為JA的過(guò)程中起重要作用的結(jié)論一致。
2、根據(jù)以下實(shí)驗(yàn)確定JL1的本質(zhì)1)利用遺傳學(xué)方法進(jìn)一步縮小目的基因的范圍，具體方法為利用步驟1定位過(guò)程中獲得的重組個(gè)體驗(yàn)證上述8個(gè)基因與JL1的共分離情況。如果某個(gè)基因是JL1基因的候選基因，就應(yīng)該與其表現(xiàn)共分離。具體方法為上述重組個(gè)體是依據(jù)和JL1基因連鎖得到，對(duì)于某個(gè)候選基因而言，將上述重組個(gè)體進(jìn)行連鎖關(guān)系PCR檢測(cè)，如果這些重組個(gè)體與該基因連鎖，表明該基因與JL1基因共分離。結(jié)果8個(gè)基因中僅有LeAcx1和LeAcx2與JL1基因共分離。
2)在基因組DNA和cDNA水平上，比較LeAcx1和LeAcx2在突變體和正常材料間的序列多態(tài)性，序列分析結(jié)果表明僅有LeAcx1在JL1突變體中發(fā)生了一個(gè)由堿基C-T的突變，該突變導(dǎo)致LeAcx1所編碼的氨基酸殘基序列中第139個(gè)氨基酸蘇氨酸(Threonine，Thr)突變?yōu)楫惲涟彼?Isoleucine，Ile)。SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)調(diào)查結(jié)果顯示該Thr139位于?；o酶氧化酶的輔酶黃素蛋白活性中心的關(guān)鍵部位，且該氨基酸在動(dòng)物、微生物及植物的同類蛋白中高度保守，一旦發(fā)生突變，將導(dǎo)致酶活性的喪失。根據(jù)該結(jié)果，初步斷定LeAcx1即為JL1基因。
3)利用轉(zhuǎn)基因手段進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)步驟1獲得的LeAcx1的cDNA序列及載體pBI121適宜的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增LeAcx1，引物序列如下引物1(上游引物)5’-GCTCTAGAGCGTAAGAGAGATGGAGGGT-3’(劃線部分堿基為XbaI識(shí)別位點(diǎn))引物2(下游引物)5’-CGAGCTCGAACAGTTTGCTGCAGCTCTCG-3’(劃線部分堿基為SacI識(shí)別位點(diǎn))根據(jù)步驟1獲得的LeAcx1的cDNA序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增LeAcx1，引物序列如下引物3(上游引物)5’-CTGAGAGTAAGAGAGATGGAG-3’引物4(下游引物)5’-CTGGGAGGAAAAGAAGCCAAA-3’提取番茄常規(guī)品種M82的總RNA，以其反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，用限制性內(nèi)切酶XbaI和SacI對(duì)經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，然后將經(jīng)純化的酶切產(chǎn)物與經(jīng)相同酶酶切的載體pBI121連接，再將其連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，經(jīng)篩選后選擇重組子，然后在其介導(dǎo)下轉(zhuǎn)化番茄抗性缺失突變體JL1，然后用PCR的方法，在引物3和引物4的引導(dǎo)下，篩選轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行接蟲試驗(yàn)，結(jié)果該轉(zhuǎn)基因植株對(duì)昆蟲產(chǎn)生抗性，從而斷定LeAcx1就是JL1基因。
實(shí)施例3、LeAcx1生物學(xué)功能的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)1、LeAcx1在JA合成及脂肪酸代謝中的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)根據(jù)步驟1獲得的突變LeAcx1的cDNA序列及載體pET-23b適宜的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增LeAcx1，引物序列如下引物5(上游引物)5’-CGAGCTCGGTAGAGGAGATGGAGGGTGTA-3’(劃線部分堿基為SacI識(shí)別位點(diǎn)引物6(下游引物)5’-CCGCTCGAGCGGAACAGTTTGCTGCAGCTCTCG-3’(劃線部分堿基為XhoI識(shí)別位點(diǎn))提取番茄常規(guī)品種M82的總RNA，以其反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，在引物5和引物6的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，用限制性內(nèi)切酶SacI和XhoI對(duì)經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，然后將經(jīng)純化的酶切產(chǎn)物與經(jīng)相同酶酶切的載體pET-23b連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)篩選后選擇重組子，在37℃下使其表達(dá)，以突變體JL1中突變的LeAcx1作為對(duì)照，并用上述同樣方法使其表達(dá)，然后利用不同碳鏈長(zhǎng)度(C4-C20)的脂肪酸輔酶(月桂酸、豆蔻酸、棕櫚酸、亞麻酸、亞油酸或花生酸均可)為底物確定其表達(dá)譜，結(jié)果表明對(duì)含有十四碳原子和十六碳原子的脂肪酸輔酶活性最高。
2、LeAcx1對(duì)昆蟲抗性的遺傳調(diào)控利用煙草花葉病毒啟動(dòng)子(CaMV-35S，Genbank號(hào)AY819771)構(gòu)建含有LeAcx1的植物表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化番茄，然后用PCR的方法，在引物3和引物4的引導(dǎo)下，篩選轉(zhuǎn)基因植株，然后對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行抗性相關(guān)基因PIs的表達(dá)分析并結(jié)合昆蟲飼喂實(shí)驗(yàn)的篩選，得到一系列LeAcx1過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果如圖2和圖3所示，表明與野生型正常番茄植株相比，過(guò)量表達(dá)LeAcx1的轉(zhuǎn)基因番茄植株(35S∷LeAcx1)對(duì)昆蟲的抗性明顯提高。
序列表<160>2<210>1<211>2248<212>DNA<213>番茄屬番茄(lycopersicon esculentum)<400>1tatcttttct ttttttcaag aattcaattg ggtatttgta aaacaaccca agattggatt 60ttttttcatt gtgtaagaat tttggttttg atctgagagt aagagagatg gagggtgtag 120attatttggc tgatgagagg aagaaagctg gatttgatgt ggatgagatg aagattgttt 180gggctggttc tcgtcatgat tttgaactta cagatcgtat ctctaagctt gttgctagtg 240atcctggctt cagtaaggag ggaagaacca tgcttcctag gaaagagcta ttcaagaaca 300ctctaaggaa ggcagcatat gcatggaaac ggatcattga acttcgtcta tctcaagagg 360aagccactat gttaaggcgt tacgtagatg agcctgcttt tactgatctt cattggggaa 420tgtttatacc tgccataaaa ggacagggca cagataaaca gcaggaaaag tggctgccgc 480tggcttacaa gatgcaaata attggctgtt atgctcaaac tgaacttggt catgggtcca 540atgtgcaagg ccttgagacc actgccacat ttgatcctca aacagatgaa tttgtcattc 600atagtccaac attgacgtca agcaagtggt ggcctggtgg attgggtaaa gtgtctaccc 660atgctgttgt gtatgctcgt cttataacag atggtaaaga ctatggggtt aatggtttta 720ttgtccaact acggagcttg gaggaccaca aacctcttcc aggtgttact gttggagaca 780ttggaatgaa atttgggaac ggagcataca attccatgga taatggggtg ttaagctttg 840atcacgtgcg cattccaaga gatcaaatgt tgatgagggt ttctcaagtt acaaaggaag 900gaaaatatgt tcagtctgat attcctcgac aactccttta tgggaccatg gtatatgtac 960ggcaatcaat tgtagcagat gcttcccttg caatgtctcg ggctgtgtgt attgcaacca1020gatacagtgc cgttcgtaga caatttggct ctcagaatgg tggacaagaa actcaggtga1080ttgactacaa aactcagcaa aacaggctct tccccttgtt ggcttctgca tatgccttca1140gatttgttgg tgagtggctg aaatggttgt acactgatgt tacccaaaga cttgcagcaa1200atgatttctc aacattgcct gaggcacatg catgtaccgc aggattgaag tctttgacca1260ccagtgccac tgctgatgga attgaagaat gccgaaagtt atgcggaggt catggttatc1320
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65 70 75 80Leu Ser Gln Glu Glu Ala Thr Met Leu Arg Arg Tyr Val Asp Glu Pro85 90 95Ala Phe Thr Asp Leu His Trp Gly Met Phe Ile Pro Ala Ile Lys Gly100 105 110Gln Gly Thr Asp Lys Gln Gln Glu Lys Trp Leu Pro Leu Ala Tyr Lys115 120 125Met Gln Ile Ile Gly Cys Tyr Ala Gln Thr Glu Leu Gly His Gly Ser130 135 140Asn Val Gln Gly Leu Glu Thr Thr Ala Thr Phe Asp Pro Gln Thr Asp145 150 155 160Glu Phe Val Ile His Ser Pro Thr Leu Thr Ser Ser Lys Trp Trp Pro165 170 175Gly Gly Leu Gly Lys Val Ser Thr His Ala Val Val Tyr Ala Arg Leu180 185 190Ile Thr Asp Gly Lys Asp Tyr Gly Val Asn Gly Phe Ile Val Gln Leu195 200 205Arg Ser Leu Glu Asp His Lys Pro Leu Pro Gly Val Thr Val Gly Asp210 215 220Ile Gly Met Lys Phe Gly Asn Gly Ala Tyr Asn Ser Met Asp Asn Gly225 230 235 240Val Leu Ser Phe Asp His Val Arg Ile Pro Arg Asp Gln Met Leu Met245 250 255Arg Val Ser Gln Val Thr Lys Glu Gly Lys Tyr Ile Gln Ser Asp Ile260 265 270Pro Arg Gln Leu Leu Tyr Gly Thr Met Val Tyr Val Arg Gln Ser Ile275 280 285Val Ala Asp Ala Ser Leu Ala Met Ser Arg Ala Val Cys Ile Ala Thr290 295 300Arg Tyr Ser Ala Val Arg Arg Gln Phe Gly Ser Gln Asn Gly Gly Gln305 310 315 320Glu Thr Gln Val Ile Asp Tyr Lys Thr Gln Gln Asn Arg Leu Phe Pro
325 330 335Leu Leu Ala Ser Ala Tyr Ala Phe Arg Phe Val Gly Glu Trp Leu Lys340 345 350Trp Leu Tyr Thr Asp Val Thr Gln Arg Leu Ala Ala Asn Asp Phe Ser355 360 365Thr Leu Pro Glu Ala His Ala Cys Thr Ala Gly Leu Lys Ser Leu Thr370 375 380Thr Ser Ala Thr Ala Asp Gly Ile Glu Glu Cys Arg Lys Leu Cys Gly385 390 395 400Gly His Gly Tyr Leu Cys Ser Ser Gly Leu Pro Glu Leu Phe Ala Val405 410 415Tyr Val Pro Ala Cys Thr Tyr Glu Gly Asp Asn Val Val Leu Gln Leu420 425 430Gln Val Ala Arg Phe Leu Met Lys Thr Ile Ser Gln Leu Gly Thr Gly435 440 445Lys Lys Pro Val Gly Thr Val Ser Tyr Met Gly Arg Ile Glu His Leu450 455 460Met Gln Cys Arg Ser Asp Val Lys Gln Ala Glu Asp Trp Leu Lys Pro465 470 475 480Ser Ala Val Leu Glu Ala Phe Glu Ala Arg Ser Ala Arg Met Ser Val485 490 495Ala Cys Ala Lys Asn Leu Ser Lys Phe Glu Asn Gln Glu Glu Gly Phe500 505 510Ala Glu Leu Ala Ala Asp Leu Val Glu Ala Ala Val Ala His Cys Gln515 520 525Leu Ile Val Val Ser Lys Tyr Ile Glu Lys Leu Gln Gln Asn Ile Pro530 535 540Gly Lys Gly Val Lys Gln Gln Leu Glu Val Leu Cys Gly Ile Tyr Ser545 550 555 560Leu Phe Ile Leu His Lys His Gln Gly Asp Phe Leu Gly Thr Gly Tyr565 570 575Ile Thr Ser Lys Gln Gly Ser Leu Ala Asn Asp Gln Leu Arg Ala Leu
580 585 590Tyr Ser Gln Leu Arg Pro Asn Ala Val Ser Leu Val Asp Ala Phe Asn595 600 605Tyr Thr Asp His Tyr Leu Gly Ser Ile Leu Gly Arg Tyr Asp Gly Asn610 615 620Val Tyr Pro Lys Leu Tyr Glu Ala Ala Trp Lys Asp Pro Leu Asn Lys625 630 635 640Ser Asp Ile Ala Asp Gly Phe His Glu Tyr Ile Arg Pro Leu Leu Lys645 650 655Gln Gln Leu Arg Thr Ala Lys Leu660
權(quán)利要求
1.番茄抗蟲相關(guān)基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述番茄抗蟲相關(guān)基因的蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于具有下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與番茄抗蟲相關(guān)的蛋白質(zhì)。
4.含有權(quán)利要求1所述番茄抗蟲相關(guān)基因的植物表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求1所述番茄抗蟲相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6.含有權(quán)利要求1所述番茄抗蟲相關(guān)基因的宿主菌。
7.擴(kuò)增權(quán)利要求1所述基因中任一片段的引物。
8.一種培育對(duì)蟲害耐受力增強(qiáng)的植物的方法，是利用植物表達(dá)載體，將權(quán)利要求1所述的基因?qū)胫参锛?xì)胞或組織，得到對(duì)蟲害耐受力增強(qiáng)的植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述植物宿主為番茄、擬南芥、煙草、棉花、水稻、玉米或小麥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)番茄抗蟲相關(guān)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，其目的是提供一個(gè)番茄抗蟲相關(guān)基因及其編碼蛋白與其在培育抗蟲植物中的應(yīng)用。所述番茄抗蟲相關(guān)基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID　№2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID№1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的番茄LeAcx1突變將導(dǎo)致JA合成缺失及相關(guān)抗性基因表達(dá)的喪失，在植物對(duì)昆蟲的抗性育種和品質(zhì)改良中將發(fā)揮巨大作用。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1824778SQ200510008609
公開(kāi)日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月18日
發(fā)明者李傳友, 李常保, 蔣紅玲, 吳曉燕 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所