本發(fā)明涉及生化分離技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種同時分離純化試劑級的藻藍蛋白與別藻藍蛋白的方法。

背景技術(shù)：

水華藍藻中富含藻膽蛋白，不同藻膽蛋白的結(jié)構(gòu)基本相似，均含有兩條結(jié)構(gòu)相似的多肽鏈α和β亞基，分子量約為3萬道爾頓，每一亞基各與一分子的藻藍素結(jié)合。按照吸收光譜性質(zhì)藻膽蛋白可分為藻藍蛋白、別藻藍蛋白、藻紅蛋白和藻紅藍蛋白。其中，藻藍蛋白和別藻藍蛋白一般以三聚體和六聚體的形式存在。藻藍蛋白和別藻藍蛋白的純度越高，售價越高，純度計算分別以A₆₂₀/A₂₈₀與A₆₅₀/A₂₈₀來表征，根據(jù)其純度的不同可分級為：食品級>0.7，藥品級>3.0和試劑級>4.0。藻藍蛋白和別藻藍蛋白都具有抗氧化性、抗炎性、抗衰老性、抗癌性和免疫熒光性等功能。因此，被廣泛用作天然色素(食品、化妝品、染料等)、醫(yī)藥保健品和分子生物學(xué)研究中的熒光試劑。一般來說，水華藍藻中藻藍蛋白的含量達5％以上，別藻藍蛋白含量在2％以上。從水華藍藻中提取純化較高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白，既可實現(xiàn)水華藍藻處理的無害化，又可實現(xiàn)高附加值的資源化利用。

藻藍蛋白和別藻藍蛋白提取的方法主要有：凍融法、超聲波法、高壓均質(zhì)法、化學(xué)試劑法等等?，F(xiàn)行很多的破壁提取方法強調(diào)聯(lián)用，盡管一定程度上增加了藍藻破壁后蛋白質(zhì)的得率，但是增加了相應(yīng)工藝步驟，操作復(fù)雜性增加，成本增大。另外，藻藍蛋白和別藻藍蛋白純化的方法主要包括：鹽析、超濾、透析、利凡諾沉淀、雙水相萃取和層析法等等?，F(xiàn)行很多的純化方法主要重點在于單一提取純化純度大于4以上的藻藍蛋白，不能整體有效的同時分離和純化出高附加值的藻藍蛋白和別藻藍蛋白，未能實現(xiàn)高附加值的多種蛋白質(zhì)綜合利用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種同時分離純化試劑級的藻藍蛋白與別藻藍蛋白的方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中不能整體有效的同時分離和純化出高附加值的試劑級的藻藍蛋白和別藻藍蛋白的問題。

為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種同時分離純化試劑級的藻藍蛋白與別藻藍蛋白的方法，包括如下步驟：

S1，將藍藻進行破壁以產(chǎn)生藻液，將所述藻液進行固液分離，所得液體即為藻膽蛋白粗提液；

S2，向所述藻膽蛋白粗提液中加入適量硫酸銨，混勻并靜置后離心，獲得上清液；

S3，向步驟S2中獲得的上清液中追加適量硫酸銨，混勻并靜置后離心，獲得沉淀；

S4，將步驟S3中獲得的沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，并用磷酸鹽緩沖液作為透析液將溶解后的溶液透析脫鹽，脫鹽后的溶液再離心棄去變性蛋白以獲得透析后的藻膽蛋白溶液；

S5，將步驟S4中透析后的藻膽蛋白溶液，過平衡好的纖維素層析柱，并依次用含不同離子強度的洗脫液洗脫，分別收集洗脫的組分，檢測組分中藻藍蛋白和別藻藍蛋白的純度和濃度，將主要富含藻藍蛋白和別藻藍蛋白的組分用磷酸鹽緩沖液作為透析液進行透析脫鹽以獲得含藻藍蛋白和別藻藍蛋白的混合液；

S6，將步驟S5中獲得的混合液過平衡好的羥基磷灰石層析柱，并依次用含不同離子強度的洗脫液洗脫，分別收集洗脫的組分，以獲得了試劑級的藻藍蛋白和試劑級的別藻藍蛋白。

優(yōu)選地，所述步驟S1的具體操作為：將-20℃條件下冷凍保存的新鮮藍藻在25-35℃下融化，再放入-20℃條件下冷凍，重復(fù)此步驟至少2次，以實現(xiàn)藍藻細胞的破壁；將藍藻破壁后的溶液用多層紗布粗過濾，去除藻渣，再離心后去渣即可獲得藻膽蛋白粗提液。

優(yōu)選地，所述步驟S2中硫酸銨添加量為1.0～1.4mol/L。

優(yōu)選地，所述步驟S3中追加硫酸銨使其物質(zhì)的量濃度達到1.6～2.2mol/L。

優(yōu)選地，所述步驟S4中磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01mol/L，pH為6.5，選用截留量為100KDa的透析袋進行透析脫鹽。

優(yōu)選地，所述步驟S5中采用0.02mol/L、pH＝6.5、3～5倍柱體積的磷酸鹽緩沖液平衡纖維素層析柱，平衡后，將透析后的藻膽蛋白溶液上樣，上樣量為柱床體積的1/3～2/3。

優(yōu)選地，所述步驟S5中用分別含0.1、0.3、1.5mol/L氯化鈉的0.02mol/L、pH＝6.5的磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫線速度為200～300cm/h。

優(yōu)選地，所述步驟S6中采用0.01mol/L、pH＝7.0、3～5倍柱體積的磷酸鹽緩沖液平衡羥基磷灰石層析柱，平衡后，將步驟S5中獲得的混合液上樣，上樣量為柱床體積的1/3～2/3。

優(yōu)選地，所述步驟S6中采用含有0.1mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液洗脫，磷酸鹽緩沖液的濃度梯度分別為0.02、0.05、0.1mol/L，pH＝7.0，洗脫線速度為200～300cm/h。

優(yōu)選地，所述步驟S2、步驟S3中的離心操作均在4℃下進行。

如上所述，本發(fā)明的一種同時分離純化試劑級的藻藍蛋白與別藻藍蛋白的方法，具有以下有益效果：本發(fā)明以水華新鮮藍藻為原料，通過采用鹽析聯(lián)合柱層析分離純化試劑級藻藍蛋白和試劑級別藻藍蛋白，與傳統(tǒng)層析法工藝相比，在兼顧蛋白質(zhì)回收率的前提下，能同時提取純化兩種高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白，提高了藍藻細胞中高價值蛋白綜合提取純化的效率，并且可以放大。

附圖說明

圖1顯示為本發(fā)明的同時分離純化試劑級的藻藍蛋白與別藻藍蛋白的方法的流程圖。

圖2顯示為本發(fā)明的同時分離純化試劑級的藻藍蛋白與別藻藍蛋白的方法的實施例一的纖維素柱層析后第一洗脫次序洗脫的組分光譜圖。

圖3顯示為本發(fā)明的同時分離純化試劑級的藻藍蛋白與別藻藍蛋白的方法的實施例一的纖維素柱層析后第二洗脫次序洗脫的含不同濃度(濃度單位為mg/mL)藻藍蛋白的組分光譜圖。

圖4顯示為本發(fā)明的同時分離純化試劑級的藻藍蛋白與別藻藍蛋白的方法的實施例一的HA柱層析后第一洗脫次序洗脫的含不同濃度(濃度單位為mg/mL)藻藍蛋白的組分光譜圖。

圖5顯示為本發(fā)明的同時分離純化試劑級的藻藍蛋白與別藻藍蛋白的方法的實施例一的HA柱層析后第二洗脫次序洗脫的組分光譜圖。

具體實施方式

以下由特定的具體實施例說明本發(fā)明的實施方式，熟悉此技術(shù)的人士可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點及功效。

請參閱圖1至圖5。須知，本說明書所附圖式所繪示的結(jié)構(gòu)、比例、大小等，均僅用以配合說明書所揭示的內(nèi)容，以供熟悉此技術(shù)的人士了解與閱讀，并非用以限定本發(fā)明可實施的限定條件，故不具技術(shù)上的實質(zhì)意義，任何結(jié)構(gòu)的修飾、比例關(guān)系的改變或大小的調(diào)整，在不影響本發(fā)明所能產(chǎn)生的功效及所能達成的目的下，均應(yīng)仍落在本發(fā)明所揭示的技術(shù)內(nèi)容所能涵蓋的范圍內(nèi)。同時，本說明書中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中間”及“一”等的用語，亦僅為便于敘述的明了，而非用以限定本發(fā)明可實施的范圍，其相對關(guān)系的改變或調(diào)整，在無實質(zhì)變更技術(shù)內(nèi)容下，當亦視為本發(fā)明可實施的范疇。

本發(fā)明提供一種同時分離純化試劑級的藻藍蛋白與別藻藍蛋白的方法，采用凍融破壁獲得藻膽蛋白粗提液，采用鹽析聯(lián)合柱層析的方法同時分離和純化獲得試劑級藻藍蛋白和別藻藍蛋白。凍融法的原理是通過冷凍破壞了細胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)，增加細胞膜的通透性，同時細胞內(nèi)的水結(jié)冰，形成冰晶，撐破細胞膜，進而溶脹破壁，通過室溫融化的方式獲得藻膽蛋白破壁粗提液。凍融法易于保存藍藻，不受時空限制，不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變形，操作簡單。鹽析法是使用中性鹽來中和溶液中蛋白質(zhì)的電荷，破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，使蛋白質(zhì)相互聚集形成沉淀而析出。Cellufine A-500柱層析是一種陰離子交換分離技術(shù)，原理是利用蛋白質(zhì)在不同pH緩沖液中蛋白質(zhì)所帶正負電荷的差異，從而與陰離子離子交換劑結(jié)合的能力也不同，所以被洗脫到溶液中的順序也不同，從而被分離出來。纖維素基材的離子交換填料是交聯(lián)的球狀纖維素顆粒，有著較高的流速、機械穩(wěn)定性和溶劑的耐受性。與葡聚糖、瓊脂糖和人工合成的聚合物類填料相比，具有機械強度高、溶出物少的優(yōu)點。HA填料具有獨特的分離機理，是目前唯一直接用于蛋白質(zhì)和核酸純化的無機層析填料，具有高度耐堿、生物安全性的優(yōu)點。其表面具有豐富的PO₄^3-和Ca²⁺，具有陽離子交換和金屬螯合的混合作用機理。

如圖1所示，本發(fā)明提供一種同時分離純化試劑級的藻藍蛋白與別藻藍蛋白的方法，包括如下步驟：

(1)將-20℃條件下冷凍保存(一般保存約10h)的新鮮藍藻(含水率99％)在25℃下融化(融化解凍時間可選為約6h)，再放入-20℃條件下冷凍，重復(fù)此步驟至少2次，以實現(xiàn)藍藻細胞的破壁；將藍藻破壁后的溶液用多層紗布粗過濾，紗布數(shù)目優(yōu)選為200目，去除藻渣，再在4℃下進行8000r/min的高速離心，離心時間20min，去渣即可獲得藻膽蛋白粗提液；

(2)一步鹽析：在4℃下，向上述藻膽蛋白粗提液加入中(NH₄)₂SO₄固體使粗提液中(NH₄)₂SO₄的濃度為1.0～1.4mol/L，攪拌混勻后靜置30min，再在4℃下進行8000r/min的高速離心，離心時間20min，棄去沉淀，保留上清液；

(3)二步鹽析：在4℃下，向步驟(2)獲取的上清液中繼續(xù)加入(NH₄)₂SO₄固體使上清液中(NH₄)₂SO₄的濃度為1.6～2.2mol/L，攪拌混勻后靜置30min，再在4℃下進行8000r/min的高速離心，離心時間20min，棄去上清液，獲得藻膽蛋白沉淀；

(4)透析脫鹽：向步驟(3)獲得的藻膽蛋白沉淀中加入少量0.01mol/L(指磷酸根濃度)，pH為6.5的磷酸鹽緩沖溶液，以將藻膽蛋白沉淀溶解。再將溶解后的溶液置于截留量為100KDa的透析袋中，并用0.01mol/L、pH為6.5的磷酸鹽緩沖溶液作為透析液透析12h，脫鹽后的溶液再進行8000r/min高速離心，離心時間30min，棄去變性蛋白以獲得透析后的藻膽蛋白溶液。

(5)Cellufine A-500柱層析：柱子的規(guī)格優(yōu)選為Vantage-L 1.6cm×50cm可伸縮實驗室規(guī)模層析柱，量取50ml體積的Cellfine A-500，浸泡于2倍體積的高鹽度洗脫溶液(20mmol/L磷酸鹽溶液加入2mol/L的氯化鈉溶液中而制得)中，常溫下?lián)u勻靜止1h。輕輕攪動層析填料使混合液均勻，用玻璃棒引流于層析柱中，敲擊層析柱以確保裝填均勻緊實；使用0.02mol/L、pH＝6.5、3～5倍柱體積的磷酸鹽緩沖液平衡Cellufine A-500層析柱，平衡后，將透析后的藻膽蛋白溶液上樣，上樣量為柱床體積的1/3～2/3；進樣完畢后分別用含0.1、0.3、1.5mol/L氯化鈉的0.02mol/L、pH＝6.5的磷酸鹽緩沖液洗脫樣品，洗脫線速度為200～300cm/h；分別收集用三種梯度的洗脫液洗脫的組分，檢測組分中藻藍蛋白和別藻藍蛋白的純度和濃度，并進行紫外-可見吸收光譜掃描，將主要富含藻藍蛋白和別藻藍蛋白的組分用0.01mol/L、pH為6.5的磷酸鹽緩沖液作為透析液進行透析脫鹽以獲得含藻藍蛋白和別藻藍蛋白的混合液；

(6)HA柱層析：柱子的規(guī)格優(yōu)選為Vantage-L 1.6cm×50cm可伸縮實驗室規(guī)模層析柱，稱取30g羥基磷灰石(HA)，浸泡于50ml的0.1mol/L的NaOH溶液中，常溫下?lián)u勻靜止1h。輕輕攪動層析填料使混合液均勻，用玻璃棒引流于層析柱中，敲擊層析柱以確保裝填均勻緊實；使用0.01mol/L、pH＝7.0、3-5倍柱體積的磷酸鹽緩沖液平衡HA層析柱，平衡后，將步驟(5)中獲得的含藻藍蛋白和別藻藍蛋白的混合液上樣，上樣量為柱床體積的1/3～2/3；進樣完畢后用含有0.1mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液洗脫，磷酸鹽緩沖液的濃度梯度分別為0.02、0.05、0.1mol/L，pH＝7.0，洗脫線速度為200～300cm/h；分別收集洗脫的組分，以獲得試劑級的藻藍蛋白和試劑級的別藻藍蛋白。

以下提供三個實施例。藻藍蛋白、別藻藍蛋白、藻紅蛋白的吸光度用紫外-可見分光光度儀檢測，藻藍蛋白純度計算依據(jù)公式P₁＝A₆₂₀/A₂₈₀，別藻藍蛋白純度計算依據(jù)公式P₂＝A₆₅₀/A₂₈₀，藻紅蛋白純度計算依據(jù)公式P₃＝A₅₆₅/A₂₈₀，藻藍蛋白濃度計算依據(jù)公式[PC]＝(A₆₂₀-0.7×A₆₅₀)/7.38，別藻藍蛋白濃度計算依據(jù)公式[APC]＝(A₆₅₀-0.19×A₆₂₀)/5.65，藻紅蛋白濃度計算依據(jù)公式[PE]＝(A₅₄₀-2.8×[PC]-1.34×[APC])/12.7，回收率計算依據(jù)公式Y(jié)＝(C_tV_t/C₀V₀)×100％，其中：A₂₈₀、A₅₄₀、A₅₆₅、A₆₂₀、A₆₅₀分別為波長280、540、565、620、650nm處的吸光度；C_t為樣品溶液中的藻藍蛋白(別藻藍蛋白)質(zhì)量濃度；C₀為粗提液中的藻藍蛋白質(zhì)(別藻藍蛋白)質(zhì)量濃度；V_t為樣品溶液的體積；V₀為粗提液的體積。

實施例一：

(1)將-20℃條件下冷凍保存(一般保存約10h)的新鮮藍藻(含水率99％)在25℃下融化(融化解凍時間可選為約6h)，再放入-20℃條件下冷凍，重復(fù)此步驟至少2次，以實現(xiàn)藍藻細胞的破壁；將藍藻破壁后的溶液用多層紗布粗過濾，紗布數(shù)目優(yōu)選為200目，去除藻渣，再在4℃下進行8000r/min的高速離心，離心時間20min，去渣即可獲得藻膽蛋白粗提液；

(2)一步鹽析：在4℃下，向上述藻膽蛋白粗提液加入中(NH₄)₂SO₄固體使粗提液中(NH₄)₂SO₄的濃度為1.0mol/L，攪拌混勻后靜置30min，再在4℃下進行8000r/min的高速離心，離心時間20min，棄去沉淀，保留上清液；

(3)二步鹽析：在4℃下，向步驟(2)獲取的上清液中繼續(xù)加入(NH₄)₂SO₄固體使上清液中(NH₄)₂SO₄的濃度為1.6mol/L，攪拌混勻后靜置30min，再在4℃下進行8000r/min的高速離心，離心時間20min，棄去上清液，獲得藻膽蛋白沉淀；

(4)透析脫鹽：向步驟(3)獲得的藻膽蛋白沉淀中加入少量0.01mol/L，pH為6.5的磷酸鹽緩沖溶液，以將藻膽蛋白沉淀溶解。再將溶解后的溶液置于截留量為100KDa的透析袋中，并用0.01mol/L、pH為6.5的磷酸鹽緩沖溶液作為透析液透析12h，脫鹽后的溶液再進行8000r/min高速離心，離心時間30min，棄去變性蛋白以獲得透析后的藻膽蛋白溶液。

(5)Cellufine A-500柱層析：柱子的規(guī)格優(yōu)選為Vantage-L 1.6cm×50cm可伸縮實驗室規(guī)模層析柱，量取50ml體積的Cellfine A-500，浸泡于2倍體積的高鹽度洗脫溶液(20mmol/L磷酸鹽溶液加入2mol/L的氯化鈉溶液中而制得)中，常溫下?lián)u勻靜止1h。輕輕攪動層析填料使混合液均勻，用玻璃棒引流于層析柱中，敲擊層析柱以確保裝填均勻緊實；使用0.02mol/L、pH＝6.5、5倍柱體積的磷酸鹽緩沖液平衡Cellufine A-500層析柱，平衡后，將透析后的藻膽蛋白溶液上樣，上樣量為柱床體積的2/3；進樣完畢后分別用含0.1、0.3、1.5mol/L氯化鈉的0.02mol/L、pH＝6.5的磷酸鹽緩沖液洗脫樣品，洗脫線速度為200cm/h；分別收集用三種梯度的洗脫液洗脫的組分，檢測組分中藻紅蛋白、藻藍蛋白以及別藻藍蛋白的純度和濃度，并進行紫外-可見吸收光譜掃描。

按照洗脫順序，洗脫出來的溶液顏色分別為粉紅色、藍色、黃褐色。對三個洗脫的組分進行250-700nm紫外-可見吸收光譜掃描，按照洗脫順序，第一洗脫次序洗脫的組分(組分1)光譜圖和第二洗脫次序洗脫的組分(組分2)光譜圖分別如圖2、圖3所示。由圖2可以看出，于270nm和565nm處出現(xiàn)吸收峰，說明主要物質(zhì)成分為藻紅蛋白，因為藻紅蛋白在565nm附近具有典型特征吸收峰。圖3為纖維素柱層析后，第二洗脫次序洗脫的含不同濃度(濃度單位為mg/mL，由洗脫后的組分進行不同倍數(shù)的稀釋而得)藻藍蛋白的組分光譜圖，從上到下，濃度依次下降，從圖中可以看出，對不同濃度的藻藍蛋白，均分別于277nm和620nm附近出現(xiàn)吸收峰，說明主要物質(zhì)成分為藻藍蛋白，因為藻藍蛋白在可見光區(qū)620nm處具有典型的特征吸收峰，在280nm處有典型的蛋白質(zhì)部分氨基酸的吸收峰，并且，隨著濃度的增加，其吸光度也增大。

通過檢測組分中藻紅蛋白、藻藍蛋白以及別藻藍蛋白的純度和濃度可知，組分1中的粉紅色物質(zhì)主要為藻紅蛋白，組分2中除主要含藻藍蛋白外還含有少量別藻藍蛋白。第三洗脫次序洗脫的黃褐色物質(zhì)成分含有少量的藻藍蛋白和別藻藍蛋白，另外還含有核酸類物質(zhì)。由此將主要富含藻藍蛋白和別藻藍蛋白的組分(這里為組分2)用0.01mol/L、pH為6.5的磷酸鹽緩沖液作為透析液進行透析脫鹽以獲得含藻藍蛋白和別藻藍蛋白的混合液；

(6)HA柱層析：柱子的規(guī)格優(yōu)選為Vantage-L 1.6cm×50cm可伸縮實驗室規(guī)模層析柱，稱取30g羥基磷灰石(HA)，浸泡于50ml的0.1mol/L的NaOH溶液中，常溫下?lián)u勻靜止1h。輕輕攪動層析填料使混合液均勻，用玻璃棒引流于層析柱中，敲擊層析柱以確保裝填均勻緊實；使用0.01mol/L、pH＝7.0、5倍柱體積的磷酸鹽緩沖液平衡HA層析柱，平衡后，將步驟(5)中獲得的含藻藍蛋白和別藻藍蛋白的混合液上樣，上樣量為柱床體積的1/3；進樣完畢后用含有0.1mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液洗脫，磷酸鹽緩沖液的濃度梯度分別為0.02、0.05、0.1mol/L，pH＝7.0，洗脫線速度為200cm/h；分別收集洗脫的組分，以獲得試劑級的藻藍蛋白和試劑級的別藻藍蛋白。對洗脫的組分進行紫外-可見吸收光譜掃描，按照洗脫順序，第一洗脫次序洗脫的組分(組分1)和第二洗脫次序洗脫的組分(組分2)的光譜掃描圖分別如圖4、圖5所示。圖4為HA柱層析后，第一洗脫次序洗脫的含不同濃度(濃度單位為mg/mL，由洗脫后的組分進行不同倍數(shù)的稀釋而得)藻藍蛋白的組分光譜圖，從上到下，濃度依次下降，從圖中可以看出，對不同濃度的藻藍蛋白，均分別于280nm和620nm附近出現(xiàn)吸收峰，說明主要物質(zhì)成分為藻藍蛋白，因為藻藍蛋白在可見光區(qū)620nm處具有典型的特征吸收峰，在280nm處有典型的蛋白質(zhì)部分氨基酸的吸收峰，并且，隨著濃度的增加，其吸光度也增大。由圖5可知，分別于278nm和650nm處出現(xiàn)吸收峰，說明主要物質(zhì)成分為別藻藍蛋白，因為別藻藍蛋白在650nm附近具有典型特征吸收峰。經(jīng)檢測組分中藻藍蛋白和別藻藍蛋白的純度和濃度可知，組分1的主要成分為藻藍蛋白，組分2的主要成分為別藻藍蛋白。此外，經(jīng)檢測分析，第三洗脫次序洗脫的組分為殘留在柱中與HA結(jié)合比較緊密的痕量雜質(zhì)蛋白組分。其實驗數(shù)據(jù)見表1，經(jīng)過HA柱層析后，組分1中的藻藍蛋白以及組分2中的別藻藍蛋白的純度均大于4.0，說明采用本發(fā)明的分離純化方法，可實現(xiàn)試劑級藻藍蛋白和別藻藍蛋白的分離純化。

表1 實施例一實驗數(shù)據(jù)

實施例二：

(1)將-20℃條件下冷凍保存(一般保存約10h)的新鮮藍藻(含水率99％)在25℃下融化，再放入-20℃條件下冷凍，重復(fù)此步驟至少2次，以實現(xiàn)藍藻細胞的破壁；將藍藻破壁后的溶液用多層紗布粗過濾，紗布數(shù)目優(yōu)選為200目，去除藻渣，再在4℃下進行8000r/min的高速離心，離心時間20min，去渣即可獲得藻膽蛋白粗提液；

(2)一步鹽析：在4℃下，向上述藻膽蛋白粗提液加入中(NH₄)₂SO₄固體使粗提液中(NH₄)₂SO₄的濃度為1.2mol/L，攪拌混勻后靜置30min，再在4℃下進行8000r/min的高速離心，離心時間20min，棄去沉淀，保留上清液；

(3)二步鹽析：在4℃下，向步驟(2)獲取的上清液中繼續(xù)加入(NH₄)₂SO₄固體使上清液中(NH₄)₂SO₄的濃度為1.8mol/L，攪拌混勻后靜置30min，再在4℃下進行8000r/min的高速離心，離心時間20min，棄去上清液，獲得藻膽蛋白沉淀；

(4)透析脫鹽：向步驟(3)獲得的藻膽蛋白沉淀中加入少量0.01mol/L，pH為6.5的磷酸鹽緩沖溶液，以將藻膽蛋白沉淀溶解。再將溶解后的溶液置于截留量為100KDa的透析袋中，并用0.01mol/L、pH為6.5的磷酸鹽緩沖溶液作為透析液透析12h，脫鹽后的溶液再進行8000r/min高速離心，離心時間30min，棄去變性蛋白以獲得透析后的藻膽蛋白溶液。

(5)Cellufine A-500柱層析：柱子的規(guī)格優(yōu)選為Vantage-L 1.6cm×50cm可伸縮實驗室規(guī)模層析柱，量取50ml體積的Cellfine A-500，浸泡于2倍體積的高鹽度洗脫溶液(20mmol/L磷酸鹽溶液加入2mol/L的氯化鈉溶液中而制得)中，常溫下?lián)u勻靜止1h。輕輕攪動層析填料使混合液均勻，用玻璃棒引流于層析柱中，敲擊層析柱以確保裝填均勻緊實；使用0.02mol/L、pH＝6.5、5倍柱體積的磷酸鹽緩沖液平衡Cellufine A-500層析柱，平衡后，將透析后的藻膽蛋白溶液上樣，上樣量為柱床體積的2/3；進樣完畢后分別用含0.1、0.3、1.5mol/L氯化鈉的0.02mol/L、pH＝6.5的磷酸鹽緩沖液洗脫樣品，洗脫線速度為200cm/h；分別收集用三種梯度的洗脫液洗脫的組分，檢測組分中藻紅蛋白、藻藍蛋白以及別藻藍蛋白的純度和濃度，并進行紫外-可見吸收光譜掃描，將主要富含藻藍蛋白和別藻藍蛋白的組分用0.01mol/L、pH為6.5的磷酸鹽緩沖液作為透析液進行透析脫鹽以獲得含藻藍蛋白和別藻藍蛋白的混合液；

(6)HA柱層析：柱子的規(guī)格優(yōu)選為Vantage-L 1.6cm×50cm可伸縮實驗室規(guī)模層析柱，稱取30g羥基磷灰石(HA)，浸泡于50ml的0.1mol/L的NaOH溶液中，常溫下?lián)u勻靜止1h。輕輕攪動層析填料使混合液均勻，用玻璃棒引流于層析柱中，敲擊層析柱以確保裝填均勻緊實；使用0.01mol/L、pH＝7.0、5倍柱體積的磷酸鹽緩沖液平衡HA層析柱，平衡后，將步驟(5)中獲得的含藻藍蛋白和別藻藍蛋白的混合液上樣，上樣量為柱床體積的1/2；進樣完畢后用含有0.1mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液洗脫，磷酸鹽緩沖液的濃度梯度分別為0.02、0.05、0.1mol/L，pH＝7.0，洗脫線速度為200cm/h；分別收集洗脫的組分，以獲得試劑級的藻藍蛋白和試劑級的別藻藍蛋白。對洗脫的組分進行紫外-可見吸收光譜掃描分析，并檢測組分中藻藍蛋白和別藻藍蛋白的純度和濃度。按照洗脫順序，第一洗脫次序洗脫的組分(組分1)主要成分為藻藍蛋白，第二洗脫次序洗脫的組分(組分2)的主要成分為別藻藍蛋白。其實驗數(shù)據(jù)見表2，經(jīng)過HA柱層析后，組分1中的藻藍蛋白以及組分2中的別藻藍蛋白的純度均大于4.0，說明采用本發(fā)明的分離純化方法，可實現(xiàn)試劑級藻藍蛋白和別藻藍蛋白的分離純化。

表2 實施例二實驗數(shù)據(jù)

實施例三：

(1)將-20℃條件下冷凍保存(一般保存約10h)的新鮮藍藻(含水率99％)在30℃下融化，再放入-20℃條件下冷凍，重復(fù)此步驟至少2次，以實現(xiàn)藍藻細胞的破壁；將藍藻破壁后的溶液用多層紗布粗過濾，紗布數(shù)目優(yōu)選為200目，去除藻渣，再在4℃下進行8000r/min的高速離心，離心時間20min，去渣即可獲得藻膽蛋白粗提液；

(2)一步鹽析：在4℃下，向上述藻膽蛋白粗提液加入中(NH₄)₂SO₄固體使粗提液中(NH₄)₂SO₄的濃度為1.4mol/L，攪拌混勻后靜置30min，再在4℃下進行8000r/min的高速離心，離心時間20min，棄去沉淀，保留上清液；

(3)二步鹽析：在4℃下，向步驟(2)獲取的上清液中繼續(xù)加入(NH₄)₂SO₄固體使上清液中(NH₄)₂SO₄的濃度為2.0mol/L，攪拌混勻后靜置30min，再在4℃下進行8000r/min的高速離心，離心時間20min，棄去上清液，獲得藻膽蛋白沉淀；

(4)透析脫鹽：向步驟(3)獲得的藻膽蛋白沉淀中加入少量0.01mol/L，pH為6.5的磷酸鹽緩沖溶液，以將藻膽蛋白沉淀溶解。再將溶解后的溶液置于截留量為100KDa的透析袋中，并用0.01mol/L、pH為6.5的磷酸鹽緩沖溶液作為透析液透析12h，脫鹽后的溶液再進行8000r/min高速離心，離心時間30min，棄去變性蛋白以獲得透析后的藻膽蛋白溶液。

(5)Cellufine A-500柱層析：柱子的規(guī)格優(yōu)選為Vantage-L 1.6cm×50cm可伸縮實驗室規(guī)模層析柱，量取50ml體積的Cellfine A-500，浸泡于2倍體積的高鹽度洗脫溶液(20mmol/L磷酸鹽溶液加入2mol/L的氯化鈉溶液中而制得)中，常溫下?lián)u勻靜止1h。輕輕攪動層析填料使混合液均勻，用玻璃棒引流于層析柱中，敲擊層析柱以確保裝填均勻緊實；使用0.02mol/L、pH＝6.5、5倍柱體積的磷酸鹽緩沖液平衡Cellufine A-500層析柱，平衡后，將透析后的藻膽蛋白溶液上樣，上樣量為柱床體積的2/3；進樣完畢后分別用含0.1、0.3、1.5mol/L氯化鈉的0.02mol/L、pH＝6.5的磷酸鹽緩沖液洗脫樣品，洗脫線速度為300cm/h；分別收集用三種梯度的洗脫液洗脫的組分，檢測組分中藻紅蛋白、藻藍蛋白以及別藻藍蛋白的純度和濃度，并進行紫外-可見吸收光譜掃描，將主要富含藻藍蛋白和別藻藍蛋白的組分用0.01mol/L、pH為6.5的磷酸鹽緩沖液作為透析液進行透析脫鹽以獲得含藻藍蛋白和別藻藍蛋白的混合液；

(6)HA柱層析：柱子的規(guī)格優(yōu)選為Vantage-L 1.6cm×50cm可伸縮實驗室規(guī)模層析柱，稱取30g羥基磷灰石(HA)，浸泡于50ml的0.1mol/L的NaOH溶液中，常溫下?lián)u勻靜止1h。輕輕攪動層析填料使混合液均勻，用玻璃棒引流于層析柱中，敲擊層析柱以確保裝填均勻緊實；使用0.01mol/L、pH＝7.0、5倍柱體積的磷酸鹽緩沖液平衡HA層析柱，平衡后，將步驟(5)中獲得的含藻藍蛋白和別藻藍蛋白的混合液上樣，上樣量為柱床體積的2/3；進樣完畢后用含有0.1mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液洗脫，磷酸鹽緩沖液的濃度梯度分別為0.02、0.05、0.1mol/L，pH＝7.0，洗脫線速度為300cm/h；分別收集洗脫的組分，以獲得試劑級的藻藍蛋白和試劑級的別藻藍蛋白。對洗脫的組分進行紫外-可見吸收光譜掃描分析，并檢測組分中藻藍蛋白和別藻藍蛋白的純度和濃度。按照洗脫順序，第一洗脫次序洗脫的組分(組分1)主要成分為藻藍蛋白，第二洗脫次序洗脫的組分(組分2)的主要成分為別藻藍蛋白。其實驗數(shù)據(jù)見表3，經(jīng)過HA柱層析后，組分1中的藻藍蛋白以及組分2中的別藻藍蛋白的純度均大于4.0，說明采用本發(fā)明的分離純化方法，可實現(xiàn)試劑級藻藍蛋白和別藻藍蛋白的分離純化。

表3 實施例三實驗數(shù)據(jù)

依據(jù)上述三個實施例制得的藻藍蛋白為深藍色溶液，藻藍蛋白的純度(A₆₂₀/A₂₈₀)大于4.0，滿足試劑級藻藍蛋白純度的要求，蛋白質(zhì)回收率≥6.0％。別藻藍蛋白為天藍色溶液，別藻藍蛋白的純度(A₆₅₀/A₂₈₀)大于4.0，滿足試劑級別藻藍蛋白純度的要求，蛋白質(zhì)回收率≥2.0％。

綜上所述，本發(fā)明以水華新鮮藍藻為原料，通過采用鹽析聯(lián)合柱層析制備試劑級藻藍蛋白和試劑級別藻藍蛋白，與傳統(tǒng)層析法工藝相比，在兼顧蛋白質(zhì)回收率的前提下，能同時提取純化兩種高純度的藻藍蛋白和別藻藍蛋白，提高了藍藻細胞中高價值蛋白綜合提取純化的效率，并且可以放大。

所以，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點而具高度產(chǎn)業(yè)利用價值。

上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。