本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體涉及一種快速制備寨卡病毒特異全人源單克隆抗體的方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：單克隆抗體(monoclonalantibodies,mAbs)無疑是最具潛力的一類用于治療及診斷的生物制劑，目前單克隆抗體已經(jīng)有應(yīng)用于腫瘤、自身免疫性疾病及感染性疾病的診斷及治療。隨著單克隆抗體的應(yīng)用越來越廣泛，單克隆抗體的制備技術(shù)也得到的迅速發(fā)展。陳惠發(fā)表了一篇題目為“用小鼠雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)麻疹病毒抗體”的論文，該論文將BALB/e小鼠骨髓瘤p3x63Ags細(xì)胞與同系小鼠經(jīng)vero細(xì)胞傳代的麻疹病毒LEC株免疫的脾細(xì)胞在PEG作用下雜交。雜交細(xì)胞分種微量培養(yǎng)盤的孔內(nèi)，進(jìn)行孵育，用HAT培養(yǎng)液篩選單克隆細(xì)胞，用RIA檢測，單克隆細(xì)胞孔中60帕麻疹抗體陽性。但是，上述采用的鼠來源的抗體用于人類疾病的治療會有出現(xiàn)針對外源蛋白的有害免疫反應(yīng)的風(fēng)險。為克服鼠源抗體的不足，人雜交瘤技術(shù)及EBV轉(zhuǎn)染的人永生化B細(xì)胞技術(shù)應(yīng)運而生。顧若蘭發(fā)表了一篇題目為“用雜交瘤技術(shù)建立永生化肝細(xì)胞研究藥物代謝”的論文，該論文利用雜交瘤技術(shù)將原代肝細(xì)胞與不同親本瘤細(xì)胞株融合，建立符合藥物代謝研究要求、具備良好藥物代謝酶活性的肝雜交瘤細(xì)胞株，并對其生物學(xué)特性及功能進(jìn)行鑒定；評價肝雜交瘤細(xì)胞株在體外藥物代謝研究中的應(yīng)用價值。但這些技術(shù)方法存在高選擇、低融合及轉(zhuǎn)染效率低的缺陷，不適合大的抗體庫的篩選如從成千上萬的記憶細(xì)胞中分離特異性抗體。寨卡病毒可引起新生兒小頭癥及成人的Guillain-Barre綜合癥而受到世界的關(guān)注。目前針對寨卡病尚無有效的疫苗及治療方法。單個B細(xì)胞抗體技術(shù)(singleBcellantibodytechnologies)，即從單個B細(xì)胞分離及克隆免疫球蛋白編碼基因，維持了原始B細(xì)胞中抗體的重鏈及輕鏈配對。目前常用的針對病毒感染的全人單抗的分離主要采用熒光標(biāo)記的抗原篩選感染者IgG+的記憶細(xì)胞，進(jìn)行單細(xì)胞克隆。如在HIV感染者用熒光標(biāo)記的gp140成功分離到與重組三聚體gp140抗原反應(yīng)的IgG+的記憶細(xì)胞。這種方法一般是選擇恢復(fù)期病人的外周血單個核細(xì)胞中的記憶細(xì)胞，只能篩選已知抗原，但會丟失一些不與重組抗原蛋白結(jié)合，但具有中和病毒等作用的重要的功能抗體，不利于該方法的大規(guī)模推廣和應(yīng)用。因此，研究和發(fā)開出可以預(yù)防及治療寨卡病毒的方法是目前亟需解決的難題。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種快速制備寨卡病毒特異全人源單克隆抗體的方法與應(yīng)用，以解決上述的問題。本發(fā)明提供了一種快速制備寨卡病毒特異全人源單克隆抗體的方法，包括以下步驟：S1外周血單個核細(xì)胞分離：取寨卡感染者急性期外周靜脈EDTA抗凝血，利用密度梯度離心方法分離外周血單個核細(xì)胞，分裝2-4×106/管，置于液氮中凍存；S2漿細(xì)胞分離：將步驟S1凍存的外周血單個核細(xì)胞放置于37℃水浴中溶化，用PBS緩沖液洗滌3-4次，接著加入熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行染色，室溫避光孵育12-16min，使用PBS緩沖液洗滌后，加入300-500μlPBS緩沖液懸浮細(xì)胞上流式儀，分選出單個漿細(xì)胞于96孔PCR板中凍存；所述抗體為IgD、CD19、CD27、CD38、IgM和CD45，所述標(biāo)記的熒光為FITC、ECD、PC7、APCA750、PB和KO；S3抗體可變區(qū)基因的PCR擴(kuò)增和抗體的克?。豪肞CR方法從步驟S2得到的單個漿細(xì)胞中擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因，具體步驟如下：反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈：將含有單個B細(xì)胞的96孔板加入隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶等，渦旋混勻，反應(yīng)加熱后置于冰上，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；PCR擴(kuò)增抗體基因：配制PCR體系，經(jīng)過預(yù)變性、變性、退火、延伸循環(huán)，PCR擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因.PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定，對陽性的基因片段進(jìn)行測序分析.將從同一樣品孔中篩選得到的一對重鏈、輕鏈可變區(qū)基因分別連接到載體上構(gòu)建抗體表達(dá)質(zhì)粒；S4共轉(zhuǎn)染及鑒定：將步驟S3構(gòu)建的抗體表達(dá)質(zhì)粒采用96孔板瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)2-3天后收取培養(yǎng)上清用于ELISA鑒定。進(jìn)一步地，所述步驟S2中抗體與標(biāo)記熒光的配對為：IgD-FITC、CD19-ECD、CD27-PC7、CD38-APCA750、IgM-PB和CD45-KO。進(jìn)一步地，所述步驟S2的流式分析中在IgM和IgD雙陰的B細(xì)胞群體里定義CD27++-++CD138++群體為漿細(xì)胞。進(jìn)一步地，所述步驟S3中PCR擴(kuò)增中的聚合酶為Phusion超保真DNA聚合酶。進(jìn)一步地，所述步驟S3中PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段1：98℃30s；階段2：循環(huán)17次，98℃10s，60-68℃30s,68℃30s；階段3：循環(huán)13次，98℃10s，68℃30s,72℃30s；階段4：72℃5min；在4℃保溫。進(jìn)一步地，所述步驟S4轉(zhuǎn)染時的轉(zhuǎn)染試劑為轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000。進(jìn)一步地，所述步驟S4轉(zhuǎn)染時轉(zhuǎn)染試劑的添加量與抗體表達(dá)質(zhì)粒的體積比為3:1。另外，本發(fā)明還提供了所述的快速制備寨卡病毒特異全人源單克隆抗體的方法制備的寨卡病毒特異全人源單克隆抗體在預(yù)防或治療寨卡病毒病的藥物或診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的快速制備寨卡病毒特異全人源單克隆抗體的方法是采用單個B細(xì)胞抗體技術(shù)從病毒感染急性期漿細(xì)胞中獲得抗體,進(jìn)一步對抗體進(jìn)行評估，避免了只能篩選與已知抗原結(jié)合的抗體，丟失一些不與重組抗原蛋白結(jié)合且功能重要的抗體，大大的提高了篩選的效率和節(jié)約了時間。本發(fā)明提供的快速制備寨卡病毒特異全人源單克隆抗體的方法簡單快捷，不需要標(biāo)記的抗原，僅需要相對較少的B細(xì)胞，而且可分離在體內(nèi)存在而在體外很難效仿的構(gòu)象結(jié)構(gòu)域的功能性抗體，獲得的特異性抗體對寨卡疫苗的研制有重要的指導(dǎo)意義，而且有些抗體可能具有臨床治療的應(yīng)用前景?？傊?，本發(fā)明提供的快速制備寨卡病毒特異全人源單克隆抗體的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢：(1)本發(fā)明提供的快速制備寨卡病毒特異全人源單克隆抗體的方法不需要標(biāo)記的抗原，操作簡單；(2)本發(fā)明提供的快速制備寨卡病毒特異全人源單克隆抗體的方法可以分離針對在體內(nèi)存在而在體外很難效仿的構(gòu)象結(jié)構(gòu)域的功能性抗體，大大的提高了篩選的效率。附圖說明圖1為樣品管上機(jī)分析的設(shè)門程序圖；圖2為抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切(VH，AgeI/SalI,VK,AgeI/Xhol,VL,AgeI/BsiWI)的凝膠電泳圖,其中：VH，VK和VL的凝膠電泳圖的橫向泳道分別標(biāo)志均為：1-1，1-2，2-1,2-2,3-1,3-2,4-1,4-2，M2K，M5K，5-1,5-2,6-1,6-2,7-1,7-2,8-1,8-2；圖3為抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切(VH，AgeI/SalI,VK,AgeI/Xhol,VL,AgeI/BsiWI)與相應(yīng)的載體連接構(gòu)建抗體表達(dá)質(zhì)粒圖；圖4為抗體克隆流程圖。具體實施方式以下通過具體實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明不僅僅限于以下實施例。在本發(fā)明的范圍內(nèi)或者在不脫離本發(fā)明的內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)，對本發(fā)明進(jìn)行的變更、組合或替換，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的，且包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實施例1、一種快速制備寨卡病毒特異全人源單克隆抗體的方法S1外周血單個核細(xì)胞分離：取寨卡感染者急性期外周靜脈EDTA抗凝血，利用密度梯度離心方法分離外周血單個核細(xì)胞，分裝5×106/管，置于液氮中凍存；S2漿細(xì)胞分離：將步驟S1凍存的外周血單個核細(xì)胞放置于37℃水浴中溶化，用PBS緩沖液洗滌3次，接著加入熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行染色，室溫避光孵育15min，使用PBS緩沖液洗滌后，加入400μlPBS緩沖液懸浮細(xì)胞上流式儀，分選出單個漿細(xì)胞于96孔PCR板中凍存；所述抗體為IgD、CD19、CD27、CD38、IgM和CD45，所述標(biāo)記的熒光為FITC、ECD、PC7、APCA750、PB和KO；S3抗體可變區(qū)基因的PCR擴(kuò)增和抗體的克?。豪肞CR方法從步驟S2得到的單個漿細(xì)胞中擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因，具體步驟如下：反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈：將含有單個B細(xì)胞的96孔板加入隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶等，渦旋混勻，反應(yīng)加熱后置于冰上，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；PCR擴(kuò)增抗體基因：配制PCR體系，經(jīng)過預(yù)變性、變性、退火、延伸循環(huán)，PCR擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因.PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定，對陽性的基因片段進(jìn)行測序分析.將從同一樣品孔中篩選得到的一對重鏈、輕鏈可變區(qū)基因分別連接到載體上構(gòu)建抗體表達(dá)質(zhì)粒；S4共轉(zhuǎn)染及鑒定：將步驟S3構(gòu)建的抗體表達(dá)質(zhì)粒采用96孔板瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)2-3天后收取培養(yǎng)上清用于ELISA鑒定。實施例2、一種快速制備寨卡病毒特異全人源單克隆抗體的具體操作步驟S1外周血單個核細(xì)胞分離：取寨卡感染者急性期外周靜脈EDTA抗凝血，利用密度梯度離心方法分離外周血單個核細(xì)胞，分裝5×106/管，置于液氮中凍存。S2漿細(xì)胞分離：將步驟S1凍存的外周血單個核細(xì)胞放置于37℃中水浴溶化，使用PBS緩沖液洗滌3次，接著加入抗體進(jìn)行染色，室溫避光孵育15min，使用PBS緩沖液洗滌后，加入400μlPBS緩沖液懸浮細(xì)胞上流式儀，所述流式儀為貝克曼庫爾特MoFloAstriosEQ超高速流式細(xì)胞分選系統(tǒng)，熒光標(biāo)記的抗體染色：設(shè)9個分析管，如表1，1-7管加入相應(yīng)的單個熒光標(biāo)記的抗體，第9管加入7種混合的熒光標(biāo)記的抗體，第8管為只有細(xì)胞的空白管，表1熒光標(biāo)記的抗體染色管號染色管設(shè)置抗體及標(biāo)記的熒光體積(μl)熒光通道1單染IgD-FITC10FL12單染CD19-ECD5FL33單染7-AAD10FL44單染CD27-PC75FL55單染CD38-APCA7502FL86單染IgM-PB5FL97單染CD45-KO5FL108空白管不加抗體--9樣品管7種抗體混合液--單個漿細(xì)胞分選：樣品管上機(jī)分析，依據(jù)圖1設(shè)門。依據(jù)7-AAD及CD45圈出活的CD45陽性的白細(xì)胞。依據(jù)CD19圈出B細(xì)胞。在IgM和IgD雙陰的B細(xì)胞群體里定義CD27++-++CD138++群體為漿細(xì)胞。將單個漿細(xì)胞分選入96孔PCR板中。S3抗體可變區(qū)基因的PCR擴(kuò)增和抗體的克隆：利用PCR方法從步驟S2得到的單個漿細(xì)胞中擴(kuò)增可變區(qū)基因，具體步驟如下：反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈：將含有單個B細(xì)胞的96孔板加入隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶等，渦旋混勻，反應(yīng)加熱后置于冰上，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，所述cDNA合成為試劑盒(SuperScriptIIIFirstStrandSynthesisSystem,invitrogen,#18080051)。PCR擴(kuò)增抗體基因：配制PCR體系，經(jīng)過預(yù)變性、變性、退火、延伸循環(huán)，PCR擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定，對陽性的基因片段進(jìn)行測序分析.將從同一樣品孔中篩選得到的一對重鏈、輕鏈可變區(qū)基因分別連接到載體上構(gòu)建抗體表達(dá)質(zhì)粒；PCR引物序列參考文獻(xiàn)(JImmunolMethods.2008Jan1；329(1-2):112-24.)，經(jīng)2輪PCR擴(kuò)增抗體的重鏈(VH)及輕鏈可變區(qū)(VK/VL)。反應(yīng)使用Phusion超保真DNA聚合酶(PhusionHigh-FidelityPCRMasterMixwithGCBuffer,NEB,#M0532s)。反應(yīng)體系及循環(huán)條件如下表2：表2反應(yīng)體系及循環(huán)條件成分體積(μl)2XPhusionmasterGCBuffer12.55′引物混合物(10um)13′引物混合物(10um)1H2O至25模板1-2所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段1：98℃30s；階段2：循環(huán)17次，98℃10s，60-68℃30s，68℃30s；階段3：循環(huán)13次，98℃10s，68℃30s,72℃30s；階段4：72℃5min；在4℃保溫。所述PCR產(chǎn)物利用凝膠電泳圖如圖2所示。所述抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切(VH，AgeI/SalI,VK,AgeI/Xhol,VL,AgeI/BsiWI)與相應(yīng)的載體連接構(gòu)建抗體表達(dá)質(zhì)粒如圖3所示。經(jīng)序列分析確認(rèn)。從寨卡病人分離到4個與病毒E蛋白結(jié)合的單抗，其等位基因使用見表3。表3抗體重鏈及輕鏈的等位基因命名V基因D基因J基因LJF-8-4VHIGHV4-39*02FHD4-11*01HJ5*01FVKKV1-9*01FKJ3*01FLJF-5-2VHIGHV3-23*01FIGHD3-22*01FIGHJ4*02FVKIGKV1-12*01FIGKJ1*01FZHJ-6-6VHIGHV4-59*01FIGHD1-26*01FIGHJ1*01FVKIGKV1-39*01FIGKJ2*01FZHJ-8-5VHIGHV5-51*01FIGHD2-15*01FIGHJ6*02FVKIGKV3-20*01FIGKJ1*01F抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)序列如下表4所示：表4抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)序列S4共轉(zhuǎn)染及鑒定：將步驟S3構(gòu)建抗體表達(dá)質(zhì)粒采用96孔板瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)2-3天后收取培養(yǎng)上清用于ELISA鑒定?？贵w的表達(dá)：采用96孔板瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。每孔VH和VK質(zhì)粒各0.125μg,轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(Invitrogen)按1:3比例。細(xì)胞培養(yǎng)2-3天后收取培養(yǎng)上清用于ELISA。ELISA鑒定：同時檢測IgG及與病毒E蛋白結(jié)合。ELISA板首先包被上kappa和lamda抗體或包被寨卡病毒E蛋白。加入10倍或1：1稀釋的培養(yǎng)上清。2抗采用HRP標(biāo)記的抗人IgG。底物顯色終止后，讀取450nmOD。檢測結(jié)果如表5和表6所示。表5LJF-8-4和LJF-5-2的OD值命名IgGOD值E蛋白OD值LJF-8-43.58673.05643.40643.0674LJF-5-23.3823.57853.23943.4914陽性對照3.08362.32923.33282.3275陰性對照0.05580.25860.05370.2278表6ZHJ-6-6和ZHJ-8-5的OD值命名IgGOD值E蛋白OD值ZHJ-6-61.85580.21391.89740.2078ZHJ-8-52.10060.21272.21530.2051陽性對照1.86341.02071.83471.0104陰性對照0.04540.12510.4380.1154所述抗體克隆流程如圖4。當(dāng)前第1頁1 2 3