本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及絲氨酸蛋白酶抑制劑-3的結(jié)構(gòu)及其獲得方法、新的生理功能以及在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用。具體地說，本發(fā)明涉及絲氨酸蛋白酶抑制劑-3及其類似物、活性片段的結(jié)構(gòu)及其制備生產(chǎn)方法與功能，以及其在微生物及其相關(guān)分子模式檢測診斷、抑制昆蟲血淋巴黑色素產(chǎn)生、抑制昆蟲合成抗菌肽等生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用，制備絲氨酸蛋白酶抑制劑-3及其類似物或活性片段抗體及其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)超家族是蛋白酶抑制因子中最大的超家族，種類繁多，分布廣泛，具有共同起源且氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)相對保守，但功能卻高度分化。絕大多數(shù)Serpin主要在生物體內(nèi)通過抑制蛋白酶活性而起到負(fù)向調(diào)控作用，然而某些Serpin的功能并不局限于抑制蛋白酶，有些還可作為一種其他功能蛋白的輔蛋白，有些具有抑菌作用。

具有抑制活性的Serpin由蛋白質(zhì)主體和活性中心環(huán)兩部分組成，分子量約為40～50KDa。Serpin的主體結(jié)構(gòu)域極為保守，通常具有3個β-折疊(命名為A，B，C)和8-9個α螺旋。其中最具有代表性的是A-sheet和活性中心部分。在A-sheet中包含兩個β片層，包含了“Breach”和“Shutter”兩個部分。Serpin的活性中心環(huán)(Reactive Centre Loop,RCL)主要由位于C末端的約20個氨基酸殘基組成，暴露在Serpin的蛋白主體之外，帶有能夠被靶酶特異識別的位點(diǎn)，稱之為P1，從P1的羧基端開始的氨基酸稱為P1′。

Serpin的作用機(jī)制不同于常規(guī)酶與底物間的相互作用(鎖鑰機(jī)制)。它通過破壞靶酶的結(jié)構(gòu)而使靶酶完全喪失活性。當(dāng)Pl和P1靶在酶的作用下斷裂時，Serpin首先與靶酶形成共價酯鍵，即形成?；钢虚g體。經(jīng)過構(gòu)型的改變?；I水解，形成能量低的穩(wěn)定產(chǎn)物。也有解釋稱：RCL牽引靶酶轉(zhuǎn)向Serpin的另一側(cè)從而引起靶酶構(gòu)象改變，因此Serpin型抑制劑也被稱為自殺性抑制劑。這一構(gòu)象變化過程要比蛋白酶水解快幾個數(shù)量級，所形成的復(fù)合物根據(jù)其形成的Serpin成員及環(huán)境的不同可保持穩(wěn)定達(dá)數(shù)周甚至數(shù)年，但最終還可分解為有活性的蛋白酶和已斷裂的Serpin。同時，有些Serpin的抑制活性還受輔助因子的調(diào)控。

Serpin是昆蟲重要的負(fù)向調(diào)控因子。據(jù)文獻(xiàn)報道，果蠅基因組中共含有29個Serpin基因片段，其中已有13個基因得到分離并確認(rèn)相關(guān)功能。例如serpin-27A對于Toll通路具有重要負(fù)調(diào)控。2003年Hashimoto等人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)果蠅受到真菌侵染時，細(xì)胞外的Serpin 43Ac會調(diào)節(jié)Toll途徑對其做出反應(yīng)。2004年Riche等人發(fā)現(xiàn)果蠅Serpin 4A是一種細(xì)胞內(nèi)絲氨酸蛋白酶抑制劑，在細(xì)胞分泌途徑中起著調(diào)節(jié)的作用。美國白蛾血漿中發(fā)現(xiàn)一種可抑制酚氧化酶原激活系統(tǒng)的Serpin。而煙草天蛾的Serpin-1基因經(jīng)可變剪切可產(chǎn)生12種蛋白形式，其中，serpin-7、serpin-6、serpin-3和serpin-1J可抑制PAP-3的活性；Serpin-5可調(diào)節(jié)HP6、proHP8和proPAP1的活性；Serpin-4對于HP6具有抑制作用。在黃粉蟲中，SPN-40、SPN-55和SPN-48可分別特異性抑制SP級聯(lián)中的三種絲氨酸蛋白酶來調(diào)節(jié)Toll信號通路和酚氧化酶級聯(lián)反應(yīng)。

經(jīng)序列分析及生物學(xué)功能研究表明，果蠅SPN-43Ac、黃粉蟲SPN48以及煙草天蛾Serpin-3序列同源性較高(在此統(tǒng)一命名為Serpin-3)，且生物學(xué)功能相似，均參與調(diào)節(jié)先天性免疫信號通路中絲氨酸蛋白酶級聯(lián)系統(tǒng)。因此，對于Serpin-3抑制底物及其抑制機(jī)制的研究，為深入了解先天性免疫信號調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要的研究意義。

目前尚未見對鱗翅目(Lepidoptera)的天(大)蠶蛾科昆蟲Serpin-3的結(jié)構(gòu)、制備、生物學(xué)功能以及功能應(yīng)用的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供一系列Serpin-3及其制備方法。

所述的Serpin-3全序列的氨基酸及核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的Serpin-3成熟肽的氨基酸及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本發(fā)明還提供了所述重組Serpin-3的類似物或活性片段。

所述的Serpin-3類似物或活性片段為包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列，如SEQ ID：3-16所示。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述天然Serpin-3、重組Serpin-3及其類似物或活性片段，以天然Serpin-3、重組Serpin-3及其類似物或活性片段作為抗原的抗體在生物領(lǐng)域中的應(yīng)用，包括1.針對微生物的預(yù)防、檢測診斷、治療等生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用；2.針對微生物相關(guān)分子模式的預(yù)防、檢測診斷、治療等生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用；3.針對Serpin-3、重組Serpin-3、重組Serpin-3類似物或活性片段的檢測與追蹤等生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用；4.通過其抑制鱗翅目天(大)蠶蛾科昆蟲的酚氧化酶原激活系統(tǒng)以及抗菌肽的合成，從而抑制鱗翅目天(大)蠶蛾科昆蟲的免疫防御系統(tǒng)，提高鱗翅目的天(大)蠶蛾科昆蟲的抗微生物能力；5.其對絲氨酸蛋白酶強(qiáng)烈的抑制活性的特點(diǎn)，且不易產(chǎn)生耐藥性，可以作為制備腫瘤、胃炎、胰腺炎、癌癥等疾病的藥物應(yīng)用。

本發(fā)明是針對鱗翅目的天(大)蠶蛾科昆蟲體內(nèi)的Serpin-3，研究天然Serpin-3的制備方法、一級結(jié)構(gòu)(基因和蛋白質(zhì))、生物學(xué)功能以及其應(yīng)用，利用基因工程技術(shù)獲得重組Serpin-3及其類似物或活性片段以及其生物學(xué)功能和應(yīng)用。此外，利用天然、重組Serpin-3及其類似物或活性片段作為抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，同時研究了該抗體的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

首先利用蛋白提取、分離、純化技術(shù)，從鱗翅目天(大)蠶蛾科昆蟲中分離、純化獲得天然Serpin-3。其次，利用蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)以及分子生物學(xué)技術(shù)，解析Serpin-3的一級結(jié)構(gòu)(基因和蛋白質(zhì))并獲得其基因。再次，利用基因工程技術(shù)，實(shí)現(xiàn)Serpin-3基因在宿主細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)合蛋白提取、分離、純化技術(shù)獲得重組Serpin-3。同時，利用基因重組技術(shù)，獲得Serpin-3的類似物或部分片段。天然、重組Serpin-3以及其類似物或部分片段，能夠特異性抑制絲氨酸蛋白酶的活性，這種抑制作用一方面能夠抑制昆蟲體液免疫中的酚氧化酶原激活系統(tǒng)，另一方面抑制昆蟲細(xì)胞免疫而降低抗菌肽的合成。本發(fā)明的天然、重組Serpin-3以及其類似物或部分片段以及其抗體的生物學(xué)功能，可廣泛應(yīng)用于針對微生物的預(yù)防、檢測診斷、治療；鱗翅目天(大)蠶蛾科昆蟲的抗病以及針對基于絲氨酸蛋白酶抑制作用的腫瘤、胃炎、胰腺炎、癌癥等疾病的治療。

本發(fā)明的Serpin-3，其氨基酸序列如SEQ ID：1所示。

其制備方法如下：

一、天然Serpin-3的制備

本發(fā)明所獲得天然Serpin-3是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，包括：

以昆蟲血淋巴作為原料，通過親和層析、疏水層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、鹽析、超濾或上述方法的不同組合，分離純化得到不同純度乃至電泳純或HPLC純的Serpin-3。

其中，昆蟲血淋巴(簡稱血淋巴)，是昆蟲血液(或血細(xì)胞裂解物)和淋巴液的混合物或/和昆蟲壓榨或勻漿的體液，用緩沖溶液或酸性溶液或堿性溶液溶解提取，離心除去不溶雜質(zhì)得到的抽提液；

Serpin-3的提取、分離、純化體系基本條件的特征：(1)溶液的酸堿度在pH2～pH10，優(yōu)選pH4-pH9；(2)調(diào)節(jié)溶液酸堿度的化學(xué)試劑是常規(guī)、通用的酸或堿及其溶液。酸及其溶液優(yōu)選HCl、HAc、磷酸、檸檬酸、硫酸、硼酸及它們的溶液。堿及其溶液優(yōu)選NaOH、KOH、Tris、檸檬酸鈉或鉀鹽、磷酸鈉或鉀鹽、硼砂及它們的溶液；(3)緩沖液是常規(guī)、通用緩沖離子對緩沖液，優(yōu)選檸檬酸根緩沖離子對、HCl-Tris緩沖離子對、檸檬酸根-磷酸根緩沖離子對、磷酸根緩沖離子對、醋酸根緩沖離子對、硼酸根緩沖離子對、硼酸-Tris緩沖離子對或上述各緩沖離子的組合；(4)溶液或緩沖液的離子強(qiáng)度在0.001mol/L～0.8mol/L，優(yōu)選0.01mol/L～0.3mol/L。上述條件既不破壞提取、分離、純化所采用介質(zhì)的理化性質(zhì)，又不影響Serpin-3的生物活性。

昆蟲血淋巴的收集：將昆蟲用蒸餾水或去離子水反復(fù)清洗，采用常規(guī)方法，如蠟盤法、離心法、背血管取血法、灌注法、壓榨、勻漿法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪開法、穿刺法等，在4℃至～25℃條件下收集昆蟲血淋巴。

本發(fā)明的分離分析方法包含如下中的一種或兩種以上的組合：

1.離子交換層析分離純化Serpin-3

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按Serpin-3提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至要求條件范圍下。將處理好的樣品上樣于預(yù)先用緩沖液平衡好的離子交換層析，先用緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以采用鹽濃度階段方式，分別用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L鹽溶液進(jìn)行階段洗脫；也可以采用鹽濃度梯度方式，梯度為0.00mol/L～3mol/L。利用抗Serpin-3抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有Serpin-3的洗脫液合并儲存?zhèn)溆?；也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽，或再進(jìn)一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。

離子交換層析分離純化的特征：(1)層析介質(zhì)選擇陽離子交換層析填料，如CM-離子交換層析填料或SP-離子交換層析填料或S-離子交換層析填料等陽離子交換層析填料，此時緩沖液酸堿度選擇在pH2-pH7；(2)層析介質(zhì)選擇陰離子交換層析填料，如Q-離子交換層析填料或DEAE-離子交換層析填料或QAE-離子交換層析填料等離子交換層析填料，此時緩沖液酸堿度選擇在pH7-pH12；(3)緩沖液及其濃度選擇，按上述Serpin-3提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征；(4)洗脫的鹽溶液可以選擇要求濃度的緩沖液或在緩沖液中加中性鹽到需要的濃度；(5)中性鹽選擇(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl或KCl，優(yōu)選NaCl；(6)分離純化操作溫度按上述Serpin-3提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征。上述條件既不影響Serpin-3的生物活性，又不影響活性成分的分離純化。

2.親和層析分離純化Serpin-3

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按Serpin-3提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至Serpin-3的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。將處理好的樣品液上樣于預(yù)先用緩沖液平衡好的親和層析柱，先用緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以采用鹽(或化學(xué)試劑)濃度梯度(0.0mol/L～3.0mol/L或0.0mol/L～6.0mol/L或0.0mol/L～8.0mol/L)方式洗脫；也可以采用鹽(或化學(xué)試劑)階段濃度洗脫方式，分別采用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L、8mol/L鹽溶液進(jìn)行階段方式洗脫。利用抗Serpin-3抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有Serpin-3的洗脫液合并儲存?zhèn)溆?；也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽(或化學(xué)試劑)或再進(jìn)一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。

親和層析分離純化的特征：(1)親和填料的配基選擇Serpin-3抗體、肝素、刀豆素、甲醛固定后的細(xì)菌或真菌、絲氨酸蛋白酶抑制劑(如苯甲咪)、sepharose CL-4B、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖胺、肽聚糖、脂磷壁酸、脂多糖、葡聚糖等；(2)分離純化操作溫度、緩沖液、酸堿度選擇，是按Serpin-3提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征；(3)洗脫的鹽(或化學(xué)試劑)溶液可以選擇要求濃度的緩沖液或在緩沖液中加鹽(或化學(xué)試劑)到需要的濃度；(4)洗脫用鹽(或化學(xué)試劑)可以選擇(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl或KCl或尿素或鹽酸胍；(5)洗脫用鹽(或化學(xué)試劑)選擇(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl或KCl的最高濃度為3.0mol/L，選擇尿素的最高濃度為8.0mol/L，選擇鹽酸胍的最高濃度為6.0mol/L；(6)如果洗脫用鹽(或化學(xué)試劑)選擇了尿素或鹽酸胍而使Serpin-3發(fā)生變性作用，可以通過常規(guī)、通用的蛋白質(zhì)復(fù)性方法進(jìn)行復(fù)性而獲得Serpin-3。

3.疏水層析分離純化Serpin-3

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按Serpin-3提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至Serpin-3的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。加中性鹽至2mol/L濃度，上樣于預(yù)先用2mol/L中性鹽-緩沖液溶液平衡的疏水層析柱，先用2mol/L中性鹽-緩沖液溶液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以采用中性鹽濃度梯度(2.0mol/L～0.0mol/L)方式洗脫；也可以采用鹽濃度階段洗脫方式，分別采用1.5mol/L、1.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L、0.0mol/L中性鹽溶液進(jìn)行階段方式洗脫。利用抗Serpin-3抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有Serpin-3的洗脫液合并儲存?zhèn)溆?；也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽或再進(jìn)一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。

疏水層析分離純化的特征：(1)疏水層析介質(zhì)選擇苯基-疏水層析填料或正辛烷-疏水層析填料-或己烷-疏水層析填料-或丁烷-疏水層析填料或羥基磷灰石-疏水層析填料；(2)中性鹽選擇(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl；(3)分離純化操作溫度、緩沖液、酸堿度選擇，是按Serpin-3提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征。

4.凝膠層析分離純化Serpin-3

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按Serpin-3提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至Serpin-3的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。樣品液上樣于預(yù)先用緩沖液平衡好的凝膠過濾層析柱并進(jìn)行分離純化洗脫，利用抗Serpin-3抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有Serpin-3的洗脫液合并儲存?zhèn)溆?；也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽或再進(jìn)一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。

凝膠層析分離純化的特征：(1)層析介質(zhì)可以選擇Sephacryl S-100HR或Sephacryl S-200HR或Sephadex G-50或Sephadex G-75或Sephadex G-100或Sephadex G-150或Superose 12prep grade或Superose 6 prep grade或Superdex 30prep grade或Superdex 75prep grade或Superose 12HR或Superose 6HR或Superdex Peptide HR或Superdex75HR或Superdex Peptide PE等凝膠層析填料；(2)分離純化操作溫度、緩沖液、酸堿度選擇，是按Serpin-3提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征，此外洗脫液的濃度，優(yōu)選在離子濃度大于0.15M及以上。

5.鹽析分離純化Serpin-3

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按Serpin-3提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至Serpin-3的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。在樣品溶液中加入蛋白質(zhì)鹽析常規(guī)、通用的中性鹽，至濃度達(dá)到Serpin-3仍處于溶解狀態(tài)，而一些雜蛋白處于沉淀。離心取其上清溶液繼續(xù)加入鹽析常規(guī)、通用的中性鹽至濃度達(dá)到Serpin-3沉淀狀態(tài)。離心棄上清，沉淀溶于Serpin-3提取、分離、純化體系基本條件特征的溶液或緩沖液儲存?zhèn)溆?；沉淀的溶解液，也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去其中的鹽或再進(jìn)一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。

鹽析分離純化的特征：(1)分離純化的緩沖液、酸堿度選擇，是按Serpin-3提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征；(2)鹽析使用的中性鹽，選擇(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl，優(yōu)選(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄；(3)在使Serpin-3處于溶解狀態(tài)時，選擇中性鹽在5％—30％，優(yōu)選15％—30％；(4)在使Serpin-3處于沉淀狀態(tài)時，選擇中性鹽在30％—90％，優(yōu)選30％—55％。

6.超濾分離純化Serpin-3以及處理Serpin-3溶液

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按Serpin-3提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至Serpin-3的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。利用常規(guī)、通用超濾方法，分離純化Serpin-3。一種方案，選擇一定規(guī)格的超濾膜，使Serpin-3透過超濾膜，而一些雜蛋白則被超濾膜截留，從而使Serpin-3得以分離純化；透過超濾膜的Serpin-3溶液，再選擇一定規(guī)格的超濾膜，使Serpin-3被截留，而一些雜蛋白則透過超濾膜，從而使Serpin-3得以分離純化。另一種方案，是選擇一定規(guī)格的超濾膜，使Serpin-3先被超濾膜截留，隨后再選擇一定規(guī)格的超濾膜，使Serpin-3透過超濾膜，從而使Serpin-3得以分離純化。

超濾處理Serpin-3溶液的目的，是除去Serpin-3溶液中的鹽或小分子雜質(zhì)或更換緩沖液。此外，對Serpin-3溶液進(jìn)行濃縮。處理方法同上所述，選擇一定規(guī)格的超濾膜，使Serpin-3被超濾膜截留，而鹽或小分子雜質(zhì)或緩沖液的緩沖離子對則透過超濾膜，從而實(shí)現(xiàn)去除鹽、小分子雜質(zhì)或更換緩沖液或濃縮的目的。

超濾分離純化和處理的特征：(1)透過Serpin-3的超濾膜選擇分子量為30kDa或40kDa或50kDa或60kDa規(guī)格的超濾膜，優(yōu)選30kDa～60kDa的超濾膜，大于或小于優(yōu)選規(guī)格的超濾膜，其收率或超濾效率均受影響；(2)截留Serpin-3的超濾膜選擇是分子量為3kDa或10kDa或20kDa或30kDa或40kDa或50kDa的超濾膜，優(yōu)選10kDa～30kDa的超濾膜，大于或小于優(yōu)選規(guī)格的超濾膜，其收率或超濾效率均受影響；(3)超濾分離純化或處理的操作溫度、緩沖液及其酸堿度或濃度選擇，是按Serpin-3提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征。

通過上述任何一種方法所獲得的Serpin-3純度，有時無法滿足相應(yīng)需要。

本發(fā)明為了從昆蟲血淋巴中分離純化高純度Serpin-3，并達(dá)到電泳純乃至HPLC純度。本發(fā)明將上述六種分離純化方法(離子交換柱層析、親和柱層析、疏水柱層析、凝膠過濾柱層析、鹽析、超濾)，進(jìn)行兩種分離純化方法自由組合或順序重排組合，或三種分離純化方法自由組合或順序重排組合，或四種分離純化方法自由組合或順序重排組合，或五種分離純化方法自由組合或順序重排組合，通過純化方法自由組合或順序重排組合，直至樣品純度得到預(yù)期要求。

本發(fā)明所指昆蟲是鱗翅目昆蟲，鱗翅目昆蟲優(yōu)選天(大)蠶蛾科(Saturniidae)昆蟲，選自柞蠶、蓖麻蠶、天蠶、印度柞蠶、琥珀蠶、美國柞蠶、樗蠶、大山蠶、美洲天蠶、樟蠶、楓蠶，昆蟲為任何地域的天然或人工放養(yǎng)或人工飼養(yǎng)的昆蟲。為使本專業(yè)技術(shù)人員更全面、清晰理解本發(fā)明，以柞蠶作為代表來描述下面的內(nèi)容，而選擇柞蠶作為代表來描述并不是以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍。

本發(fā)明所述的重組Serpin-3、重組Serpin-3類似物或活性片段是利用基因工程表達(dá)獲得，其表達(dá)形式包括(1)原核生物系統(tǒng)的表達(dá)載體，表達(dá)宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或枯草桿菌細(xì)胞，(2)酵母細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)載體，表達(dá)宿主細(xì)胞為酵母細(xì)胞，(3)昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)載體，表達(dá)宿主細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞，(4)哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)載體，表達(dá)宿主細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞。上述表達(dá)形式為細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或分泌形式表達(dá)，上述表達(dá)體系中的表達(dá)產(chǎn)物作為制備重組Serpin-3、重組Serpin-3類似物或活性片段的來源。

所述“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等。

本發(fā)明所指微生物以及其相關(guān)分子模式是真菌、革蘭陽性菌和革蘭陰性菌以及其相關(guān)分子模式。為使本專業(yè)技術(shù)人員更全面、清晰理解本發(fā)明，以畢赤酵母、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌等作為微生物(真菌、革蘭陽性菌和革蘭陰性菌)代表來描述下面的內(nèi)容，以Lys-PGN、DAP-PGN、脂磷壁酸、甘露聚糖、β-1,3-葡聚糖、脂多糖等作為微生物相關(guān)分子模式代表來描述下面的內(nèi)容，而選擇上述具體的微生物或具體的微生物相關(guān)分子模式作為代表來描述并不是以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍。

二、Serpin-3結(jié)構(gòu)解析以及其基因序列解析

按照常規(guī)蛋白質(zhì)化學(xué)與分子生物學(xué)的技術(shù)、方法、手段，對Serpin-3進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。包括：(1)利用生物質(zhì)譜測定天然Serpin-3的分子量；(2)采用常規(guī)蛋白水解酶及其水解條件，針對發(fā)明內(nèi)容所獲得Serpin-3進(jìn)行降解，通過HPLC分離降解片段，利用生物質(zhì)譜或Edman降解方法解析部分氨基酸序列，從而獲得Serpin-3分子內(nèi)許多片段的氨基酸序列；(3)利用分子生物學(xué)技術(shù)、方法，從昆蟲脂肪體提取總RNA，利用RACE技術(shù)構(gòu)建昆蟲cDNA pool。根據(jù)目的蛋白降解片段的氨基酸序列，設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增片段基因。隨后結(jié)合RACE技術(shù)獲得Serpin-3基因—cDNA，通過基因序列測定分析獲得其堿基序列并由其開放閱讀框堿基序列推導(dǎo)獲得Serpin-3全長一級結(jié)構(gòu)；(4)利用分子生物學(xué)技術(shù)、方法等，從昆蟲脂肪體提取其染色體基因。設(shè)計PCR擴(kuò)增上下游引物，以昆蟲染色體基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增Serpin-3染色體基因，通過基因序列測定分析獲得Serpin-3染色體基因中的內(nèi)含子、外顯子序列；(5)通過上述所獲得Serpin-3的分子量、分子內(nèi)部分氨基酸序列、cDNA開放閱讀框序列、染色體基因中的外顯子序列，彼此相互驗(yàn)證上述結(jié)構(gòu)信息，獲得Serpin-3全長一級結(jié)構(gòu)序列(參見SEQ ID NO:1)、天然Serpin-3或稱成熟Serpin-3一級結(jié)構(gòu)序列(參見SEQ ID NO:2)。

三、重組Serpin-3及其片段或類似物的制備

本發(fā)明還包含具有Serpin-3序列的重組Serpin-3及其部分片段或類似物。

所述的重組Serpin-3及其類似物或部分片段選自Met-絲氨酸蛋白酶抑制劑-3成熟肽氨基酸序列、Met-組氨酸標(biāo)簽-絲氨酸蛋白酶抑制劑-3成熟肽氨基酸序列、Met-絲氨酸蛋白酶抑制劑-3成熟肽-His6標(biāo)簽氨基酸序列、Met-His6標(biāo)簽-凝血酶酶切位點(diǎn)-絲氨酸蛋白酶抑制劑-3成熟肽氨基酸序列、Met-GST標(biāo)簽-凝血酶酶切位點(diǎn)-絲氨酸蛋白酶抑制劑-3成熟肽氨基酸序列、Met-絲氨酸蛋白酶抑制劑-3成熟肽-凝血酶酶切位點(diǎn)-GST標(biāo)簽氨基酸序列、Met-His6標(biāo)簽-絲氨酸蛋白酶抑制劑-3全序列氨基酸序列、Met-絲氨酸蛋白酶抑制劑-3全序列-His6標(biāo)簽氨基酸序列、Met-GST標(biāo)簽-凝血酶酶切位點(diǎn)-絲氨酸蛋白酶抑制劑-3全序列氨基酸序列、Met-絲氨酸蛋白酶抑制劑-3全序列-凝血酶酶切位點(diǎn)-GST標(biāo)簽氨基酸序列、Met-絲氨酸蛋白酶抑制劑-3成熟肽-Flag標(biāo)簽氨基酸序列、Met-Flag標(biāo)簽-絲氨酸蛋白酶抑制劑-3成熟肽氨基酸序列、Met-絲氨酸蛋白酶抑制劑-3全序列-Flag標(biāo)簽氨基酸序列、Met-Flag標(biāo)簽-絲氨酸蛋白酶抑制劑-3全序列氨基酸序列(參見SEQ ID：3-16)。

本發(fā)明的重組Serpin-3及其部分片段或類似物通過基因工程表達(dá)制備獲得，通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，包括：(1)將Serpin-3及其部分片段或類似物編碼DNA重組至表達(dá)載體；(2)用步驟⑴的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(原核或真核細(xì)胞)；(3)在適合的誘導(dǎo)表達(dá)條件下，培養(yǎng)步驟⑵的被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(4)收獲并純化所得到的目的蛋白。

本發(fā)明同時提供上述重組Serpin-3及其部分片段或類似物的表達(dá)產(chǎn)物分離純化方法。可使用鹽析沉淀、超濾、親和層析、離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過濾等方法以及上述方法的多種組合，從基因工程細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物或培養(yǎng)液中分離并純化所需的表達(dá)產(chǎn)物。在表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化過程中，可使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印跡法(Western)檢測表達(dá)產(chǎn)物的存在及相應(yīng)分子大小。

四、Serpin-3及其部分片段或類似物的生物學(xué)功能及其應(yīng)用

本發(fā)明再一個目的是針對天然、重組Serpin-3及其類似物、部分片段在體內(nèi)外對絲氨酸蛋白酶的抑制作用、對抗菌肽合成的抑制作用以及對激活酚氧化酶原激活系統(tǒng)的抑制作用，確定了天然、重組Serpin-3及其部分片段或類似物的生物活性。同時，考察Serpin-3在機(jī)體免疫應(yīng)答過程的表達(dá)，也研究了天然、重組Serpin-3及其部分片段或類似物的應(yīng)用。

此外，本發(fā)明也研究了天然、重組Serpin-3及其部分片段或類似物作為抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體、抗體的制備以及其應(yīng)用。

本發(fā)明所述的天然、重組Serpin-3及其部分片段或類似物獲得方法常規(guī)、簡單、產(chǎn)量高。

附圖說明：

圖1為分離純化天然Serpin-3電泳圖譜

泳道1：實(shí)施例1中方法-1所獲天然Serpin-3的電泳圖譜；

泳道2：實(shí)施例1中方法-2所獲天然Serpin-3的電泳圖譜；

泳道3：實(shí)施例1中方法-3所獲天然Serpin-3的電泳圖譜；

泳道4：實(shí)施例1中方法-4所獲天然Serpin-3的電泳圖譜。

圖2為分離純化重組Serpin-3(原核表達(dá)體系)電泳圖譜

泳道1：實(shí)施例3中方法-(1)所獲得重組Serpin-3的電泳圖譜；

泳道2：實(shí)施例3中方法-(2)所獲重組Serpin-3類似物的電泳圖譜；

泳道3：實(shí)施例3中方法-(3)所獲重組Serpin-3類似物的電泳圖譜；

泳道4：實(shí)施例3中方法-(4)所獲重組Serpin-3類似物的電泳圖譜。

圖3為分離純化重組Serpin-3(真核表達(dá)體系)電泳圖譜

A：分離純化重組Serpin-3(昆蟲表達(dá)體系)電泳圖譜

泳道1：實(shí)施例4中方法-1所獲得重組Serpin-3的電泳圖譜；

泳道2：實(shí)施例4中方法-2所獲重組Serpin-3類似物的電泳圖譜。

B：分離純化重組Serpin-3(酵母表達(dá)體系、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系)電泳圖譜

泳道1：實(shí)施例5中方法所獲得重組Serpin-3類似物的電泳圖譜；

泳道2：實(shí)施例6中方法所獲重組Serpin-3類似物的電泳圖譜。

圖4為Serpin-3及其類似物、活性片段對絲氨酸蛋白酶的抑制作用

A：天然Serpin-3對絲氨酸蛋白酶的抑制作用；

B：天然Serpin-3與絲氨酸蛋白酶形成共價復(fù)合物；

C：原核表達(dá)體系獲得的重組Serpin-3及其類似物、活性片段對絲氨酸蛋白酶的抑制作用；

D：真核表達(dá)體系獲得的重組Serpin-3及其類似物、活性片段對絲氨酸蛋白酶的抑制作用。

圖5為Serpin-3在昆蟲體內(nèi)對抗菌肽合成的抑制作用

A：Serpin-3在金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)下對抗菌肽合成的抑制作用；

B：不同微生物誘導(dǎo)下Serpin-3對抗菌肽Ceropin A表達(dá)的抑制作用；

C：不同微生物誘導(dǎo)下Serpin-3對抗菌肽attacin表達(dá)的抑制作用。

圖6為Serpin-3及其類似物、活性片段對酚氧化酶原系統(tǒng)的抑制作用

A：天然Serpin-3對柞蠶幼蟲黑化的抑制作用；

B：天然Serpin-3體內(nèi)對酚氧化酶原激活的抑制作用；

C：重組Serpin-3及其類似物、活性片段體外對酚氧化酶原激活的抑制作用(PAMPs激活)；

D：重組Serpin-3及其類似物、活性片段體外對酚氧化酶原激活的抑制作用(微生物激活)。

具體實(shí)施方式：

下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍。

實(shí)施例1

天然Serpin-3的分離純化

1.方法-1

將溶于抗凝緩沖溶液的柞蠶體液離心去除血細(xì)胞，以不含有血細(xì)胞的柞蠶血淋巴作為純化絲氨酸蛋白酶抑制劑-3的樣品。將200ml樣品進(jìn)行硫酸銨分級沉淀，取35～50％沉淀組分用檸檬酸-磷酸緩沖體系溶解稀釋，以此作為上樣初始液上樣于肝素親和層析柱以去除雜蛋白的影響，將流出液上樣于SP-Sepharose陽離子交換柱，并進(jìn)行洗滌洗脫，將含有目的片段的組分上樣于Q-Sepharose陰離子交換柱進(jìn)行洗滌洗脫，然后用ConA柱對目的組分進(jìn)行進(jìn)一步的洗滌洗脫，得到具有天然活性的Serpin-3純品。

試驗(yàn)結(jié)果如圖1泳道1，目的蛋白達(dá)到電泳純。

2.方法-2

將冰浴處理的樣品首先經(jīng)過截留分子量為150KDa濾膜以除去大分子量的蛋白，透過樣品再次經(jīng)過截留分子量為80kDa濾膜獲得進(jìn)一步純化及濃縮的樣品。將截留的樣品溶于Tris-HCl(20mM,pH 7.5)緩沖溶液中，并以此為上樣初始液樣于用相同緩沖溶液平衡的Mono S HR 5/5陽離子交換柱(FPLC系統(tǒng)中),流速為0.5ml/min。用0-100％0.5M NaCl(醋酸緩沖溶液，20mM,pH5.0)梯度洗脫條件下洗滌洗脫，將經(jīng)進(jìn)一步純化的含有目的蛋白的組分經(jīng)過截留分子量為15KDa的濾膜，截留的蛋白用醋酸鈉(20mM，pH5.0)緩沖溶液平衡并以此為上樣初始液上樣于DEAE sepharose CL-6B陰離子離子交換柱(Pharmacia 17-0710-01)，并在流速為0.5ml/min，Tris-HCl(20mM,pH 7.5)緩沖溶液洗滌色譜柱至A₂₈₀<0.01。用含有0.5M NaCl的Tris-HCl(20mM,pH 7.5)緩沖溶液逐級洗脫結(jié)合蛋白，最終獲得純化的天然serpin-3。

試驗(yàn)結(jié)果如圖1泳道2，目的蛋白達(dá)到電泳純。

3.方法-3

將溶于抗凝緩沖溶液的柞蠶體液離心去除血細(xì)胞，以不含有血細(xì)胞的柞蠶血淋巴作為純化serpin-3的樣品。將200ml樣品進(jìn)行硫酸銨分級沉淀，取35～50％沉淀組分作為上樣初始液作用于反相疏水C8層析柱，利用有機(jī)溶劑進(jìn)行洗滌洗脫，將含有目的蛋白的組分進(jìn)行透析除有機(jī)溶劑，并將透析后樣品上樣于凝膠過濾層析柱TSK gel G2000SW進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，獲得天然serpin-3。

試驗(yàn)結(jié)果如圖1泳道3，目的蛋白達(dá)到電泳純。

4.方法-4

將溶于抗凝緩沖溶液的柞蠶體液離心去除血細(xì)胞，以不含有血細(xì)胞的柞蠶血淋巴作為純化絲氨酸蛋白酶抑制劑-3的樣品。將200ml樣品進(jìn)行硫酸銨分級沉淀，取35～50％沉淀組分用檸檬酸-磷酸緩沖體系溶解稀釋，以此作為上樣初始液上樣于SP-Sepharose陽離子交換柱進(jìn)行洗滌洗脫，將含有目的蛋白的組分上樣于肝素層析柱進(jìn)行洗滌洗脫，將流出液上樣于羥基磷灰石層析柱進(jìn)行進(jìn)一步的除雜后，流出液上樣于Q-Sepharose陰離子交換柱進(jìn)行洗滌洗脫，將含有目的片段的組分上樣于凝膠過濾層析柱Sepharose CL-6B column進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，獲得天然serpin-3。

試驗(yàn)結(jié)果如圖1泳道4，目的蛋白達(dá)到電泳純。

實(shí)施例2：

Serpin-3結(jié)構(gòu)解析以及其基因序列解析

按照常規(guī)蛋白質(zhì)化學(xué)與分子生物學(xué)的技術(shù)、方法、手段，對Serpin-3進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。具體方法、手段按照發(fā)明內(nèi)容二中所列內(nèi)容實(shí)施。

獲得Serpin-3完整核苷酸序列及其氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)。

獲得Serpin-3成熟肽氨基酸序列及其核苷酸序列(如SEQ ID NO:2所示)。

實(shí)施例3：

利用原核生物表達(dá)系統(tǒng)獲得重組Serpin-3及其類似物、活性片段

本實(shí)施例列舉描述原核生物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明Serpin-3及其類似物、活性片段基因的構(gòu)建策略和基本方法。

原核生物表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略，均為基因工程表達(dá)的常規(guī)、通用的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略。

本實(shí)施是為使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍。

對于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化方法，是采用實(shí)施例1的方法、原理、策略等。

1.Serpin-3的表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)天然Serpin-3的N末端和C末端氨基酸序列，分別設(shè)計相應(yīng)寡核苷酸引物，同時在上述兩個寡核苷酸引物的5′端，分別加上限制性核酸內(nèi)切酶水解位點(diǎn)序列；以昆蟲脂肪體cDNA pool為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物并進(jìn)行核酸片段的凝膠回收；經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶酶切后與同樣進(jìn)行雙酶切表達(dá)質(zhì)粒，在DNA連接酶的作用下進(jìn)行重組連接，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；經(jīng)過菌落PCR和限制性核酸內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子后提交生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行DNA序列測定。通過上述基因工程的方法，構(gòu)建Serpin-3基因的表達(dá)載體。

本實(shí)施例表達(dá)載體構(gòu)建的特征：1.以大腸桿菌為宿主，表達(dá)載體可選擇pTYB11、pMAL-C2X、pET-28a、pGEX-2T、pBV220、pQE30、pET20b等；2.可以在Serpin-3的N端前融合一段肽段作為親和層析的標(biāo)簽(Tag)；3.可以在Serpin-3的C段后融合一段肽段作為親和層析的標(biāo)簽(Tag)；4.標(biāo)簽可以選擇His-Tag(連續(xù)六個及以上組氨酸)、GST-Tag、Flag等；5.可以在親和層析標(biāo)簽與Serpin-3之間，添加蛋白水解酶水解位點(diǎn)的氨基酸序列，如凝血酶、腸激酶、凝血X因子等，以獲得與天然Serpin-3蛋白結(jié)構(gòu)一致的重組Serpin-3蛋白。

2.重組Serpin-3蛋白及其類似物、活性片段的獲得

利用基因工程技術(shù)，將Serpin-3基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落后接種至含抗生素的LB，誘導(dǎo)Serpin-3基因的表達(dá)，從而獲得含有Serpin-3的培養(yǎng)液或菌體。含有Serpin-3的菌體首先經(jīng)裂解液裂解、超聲破碎，釋放目的蛋白后利用離心方法收集上清液作為重組Serpin-3的原料液備用。

重組目的基因表達(dá)的特征：1.表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主的方式可以選擇熱轉(zhuǎn)化法和電轉(zhuǎn)化方法；2.誘導(dǎo)表達(dá)的方式包括化學(xué)誘導(dǎo)—異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)和加溫誘導(dǎo)；3.Serpin-3基因可表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外；3.存在于細(xì)胞內(nèi)的Serpin-3需通過裂解液裂解、超速破碎等方式，將目的蛋白釋放至溶液中。

按照實(shí)施例1的方法、原理、策略等，從上述含Serpin-3的原料液中分離純化重組Serpin-3及其類似物、活性片段至需要的純度，直至達(dá)到電泳純或HPLC純。

例如：(1)采用pTYB11構(gòu)建無標(biāo)簽Serpin-3表達(dá)載體，采用電轉(zhuǎn)化方法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，Serpin-3表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)。采用裂解緩沖液重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎，離心獲得上清液作為進(jìn)一步分離純化Serpin-3的原料液。按照實(shí)施例1的方法、原理、策略等，分離純化Serpin-3至電泳純(圖2-泳道1)。

(2)采用pET-28a構(gòu)建N端前融合組氨酸標(biāo)簽的Serpin-3基因，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，His-Serpin-3表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)。采用裂解緩沖液(50m mol/LPBS,0.15mol/L NaCl,50m mol/L咪唑)重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎，離心獲得上清液作為進(jìn)一步分離純化Serpin-3的原料液。按照實(shí)施例1的方法、原理、策略等，分離純化Serpin-3至電泳純(圖2-泳道2)。

(3)采用pGEX-2T構(gòu)建C端后融合GST標(biāo)簽的Serpin-3表達(dá)載體，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)加溫誘導(dǎo)表達(dá)，Serpin-3-GST表達(dá)于胞內(nèi)。采用裂解緩沖液重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎，離心獲得上清液作為進(jìn)一步分離純化Serpin-3的原料液。按照實(shí)施例1的方法、原理、策略等，分離純化Serpin-3至電泳純(圖2-泳道3)。

(4)采用pET20b構(gòu)建C端后融合Flag標(biāo)簽的Serpin-3基因，采用電轉(zhuǎn)化方法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，經(jīng)加溫誘導(dǎo)表達(dá)，Serpin-3-Flag表達(dá)于胞外。按照實(shí)施例1的方法、原理、策略等，分離純化Serpin-3至電泳純(圖2-泳道4)。

上述表達(dá)重組的Serpin-3結(jié)構(gòu)如ID：3所示，分離純化獲得的重組表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)過SDS-PAGE驗(yàn)證其純度如圖2所示。

上述含標(biāo)簽的純化后表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過上述常規(guī)、通用的蛋白水解酶(如凝血酶、腸激酶、凝血X因子等)的水解作用，去除表達(dá)產(chǎn)物中的融合肽段，再經(jīng)分離純化從而獲得Serpin-3，該重組Serpin-3的結(jié)構(gòu)與天然Serpin-3的結(jié)構(gòu)相同。

實(shí)施例4：

利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)獲得重組Serpin-3及其類似物、活性片段

本實(shí)施例列舉描述昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明Serpin-3及其類似物、活性片段基因的構(gòu)建策略和基本方法。

昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略，均為基因工程表達(dá)的常規(guī)、通用的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略。

本實(shí)施例是使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍。

對于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化方法，采用實(shí)施例1的方法、原理、策略等。

1.利用pFastBac1-sf9昆蟲表達(dá)體系獲得重組Serpin-3及其類似物、活性片段

將Serpin-3及其類似物、活性片段基因連接到pFastBac1質(zhì)粒中，構(gòu)建pFastBac1-Serpin-3重組表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)座大腸桿菌DH10，Blu-gal和IPTG誘導(dǎo)后，藍(lán)白篩選獲得轉(zhuǎn)座重組bacmid。轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9，Western blot驗(yàn)證重組Serpin-3在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

收集細(xì)胞，用裂解緩沖液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重懸，超聲破碎后離心得到含有目的蛋白的原料液。直接上樣于抗Serpin-3抗體—sepharose CL-6B為配基的親和層析柱，采用0.2mol/L-3mol/L NaCl的裂解緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，重組蛋白質(zhì)獲得高效表達(dá)，達(dá)到電泳純度。表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)如ID：3所示，純化后的電泳鑒定結(jié)果如圖3A-泳道1。

2.利用pMIB/V5-His-Sf21昆蟲表達(dá)體系獲得重組Serpin-3及其類似物、活性片段

將Serpin-3及其類似物、活性片段基因連接到pMIB/V5-His質(zhì)粒中，構(gòu)建pMIB/V5-His-Serpin-3重組表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)座大腸桿菌DH5，Blue-gal和IPTG誘導(dǎo)后，藍(lán)白篩選獲得轉(zhuǎn)座重組bacmid。轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf21，Western blot驗(yàn)證重組Serpin-3在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

收集細(xì)胞，用裂解緩沖液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重懸，超聲破碎后離心得到含有目的蛋白的原料液。直接上樣于預(yù)先平衡好的金屬離子螯合層析柱，經(jīng)過0.02mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗滌去除大量雜蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)和0.5mol/L咪唑(pH 8.0)分別進(jìn)行洗脫，重組蛋白質(zhì)獲得高效表達(dá)，達(dá)到電泳純度。表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)如ID：3所示，純化后的電泳鑒定結(jié)果如圖3A-泳道2。

實(shí)施例5：

利用酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得重組Serpin-3及其類似物、活性片段

本實(shí)施例列舉描述酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明Serpin-3及其類似物、活性片段基因的構(gòu)建策略和基本方法。

酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略，均為基因工程表達(dá)的常規(guī)、通用的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略。

為使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍，本實(shí)施例以pPIC9K表達(dá)載體、畢赤酵母GS115為代表進(jìn)行描述。

對于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化方法，是采用實(shí)施例1的方法、原理、策略等。

利用常規(guī)、通用的基因工程技術(shù)，將Serpin-3基因連接到pPIC9K表達(dá)載體中，構(gòu)建pPIC9K-His₆-Serpin-3(或pPIC9K-Serpin-3)重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性重組菌中重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切形成線性分子，利用電轉(zhuǎn)化方法將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中與基因組同源重組，經(jīng)過初篩、復(fù)篩及Mut表型鑒定，篩選出陽性重組子，進(jìn)行發(fā)酵及誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)Western blot驗(yàn)證，N末端帶有His₆-tag的重組Serpin-3為分泌型表達(dá)。

將重組菌GS115/pPIC9K-His6-Serpin-3(或GS115/pPIC9K-Serpin-3)接種于50ml BMGY液體培養(yǎng)基中，于30℃，250rpm/min，震蕩培養(yǎng)過夜。3000g、4℃離心5min，收集菌體。用10ml BMMY培養(yǎng)基重懸菌體并開始甲醇誘導(dǎo)表達(dá)6h，重組蛋白以分泌表達(dá)形式存在于培養(yǎng)基中，12,000g、4℃離心4min，得上清液，并以此為純化初始液。

如果表達(dá)產(chǎn)物是His₆-Serpin-3或Serpin-3-His₆，直接將純化初始液上樣于0.05M Tris-HCl(pH 8.0)預(yù)先平衡好的金屬離子螯合層析柱，經(jīng)過0.02mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗滌去除大量雜蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)進(jìn)行洗脫并收獲該洗脫液。該表達(dá)產(chǎn)物為His₆-Serpin-3或Serpin-3-His₆。表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)如ID：3所示，純化后的電泳鑒定結(jié)果如圖3B-泳道1。

如果表達(dá)產(chǎn)物是Serpin-3，采用實(shí)施例1的方法、原理、策略等分離純化獲得重組Serpin-3。

實(shí)施例6：

利用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)獲得重組Serpin-3及其類似物、活性片段

本實(shí)施例列舉描述哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明Serpin-3及其衍生物、類似物、活性片段基因的構(gòu)建策略和基本方法。

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略，均為基因工程表達(dá)的常規(guī)、通用的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略。

為使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍，本實(shí)施例以pCDNA3.0(neo⁺)質(zhì)粒、CHO-K1細(xì)胞為代表進(jìn)行描述。

對于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化方法，是采用實(shí)施例1和實(shí)施例2的方法、原理、策略等。

利用常規(guī)、通用的基因工程技術(shù)，將Serpin-3基因連接到pCDNA3.0(neo⁺)質(zhì)粒中，構(gòu)建pCDNA3.0(neo⁺)-His₆-Serpin-3(或pCDNA3.0(neo⁺)-Serpin-3)重組表達(dá)質(zhì)粒。將其轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞株CHO-K1，對轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞株于5％CO₂培養(yǎng)箱中，37℃貼壁培養(yǎng)72h，收集細(xì)胞及培養(yǎng)液，經(jīng)Western blot驗(yàn)證，N末端帶有His₆-tag的重組Serpin-3得以表達(dá)。

用15ul重組質(zhì)粒pCDNA3.0(neo⁺)-His₆-Serpin-3(或pCDNA3.0(neo⁺)-Serpin-3)轉(zhuǎn)染8ml IMDM medium(含有CHO-K1cell，2X10⁵cell/ml)，于37℃，15％CO₂培養(yǎng)箱中，37℃貼壁培養(yǎng)72h。用0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞2～3min，使細(xì)胞懸浮，收集細(xì)胞。用5ml裂解液(NP40)使細(xì)胞裂解，12,000g、4℃離心5min，得上清液作為純化初始液。

如果表達(dá)產(chǎn)物是His₆-Serpin-3或Serpin-3-His₆，直接將純化初始液上樣于0.05M Tris-HCl(pH8.0)預(yù)先平衡好的金屬離子螯合層析柱，經(jīng)過0.02mol/L咪唑(pH 8.0)分別充分洗滌去除大量雜蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH8.0)進(jìn)行洗脫并收獲該洗脫液。該表達(dá)產(chǎn)物為His₆-Serpin-3或Serpin-3-His₆。表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)如ID：3所示，純化后的電泳鑒定結(jié)果如圖3B-泳道2。

如果表達(dá)產(chǎn)物是Serpin-3，采用實(shí)施例1的方法、原理、策略等分離純化獲得重組Serpin-3。

實(shí)施例7：

Serpin-3及其類似物、活性片段的抗體的獲得

按照常規(guī)、通用的抗體產(chǎn)生的技術(shù)，利用實(shí)施例1、3、4、5獲得的各種天然Serpin-3、重組Serpin-3及其類似物、活性片段作為抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)抗體。

利用常規(guī)、通用的抗體檢測方法，檢測被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛的血清中Serpin-3抗體產(chǎn)生情況。

當(dāng)被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛產(chǎn)生了Serpin-3抗體后，采用常規(guī)、通用的動物血清采集與存儲方法，采集被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛的血清并存儲，該血清可以直接應(yīng)用。

利用常規(guī)、通用的抗體分離純化技術(shù)，如鹽析、各種類型層析介質(zhì)、抗體親和層析介質(zhì)等，從存儲的含有Serpin-3抗體的血清中分離純化不同純度的Serpin-3抗體，直至獲得電泳純或HPLC純的Serpin-3抗體，以適于不同要求的應(yīng)用。

實(shí)施例8：

重組以及天然Serpin-3及其類似物、活性片段的生物活性

為使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍。本實(shí)施例中天然Serpin-3、重組Serpin-3及其衍生物、類似物、活性片段具有相同的生物活性。以柞蠶作為鱗翅目昆蟲的生物活性實(shí)驗(yàn)昆蟲為代表進(jìn)行描述。本專業(yè)技術(shù)人員可以以天然Serpin-3、重組Serpin-3及其類似物、活性片段的生物活性為核心與基礎(chǔ)，進(jìn)一步拓展天然Serpin-3、重組Serpin-3及其類似物、活性片段的應(yīng)用范圍。

1.Serpin-3及其類似物、活性片段對絲氨酸蛋白酶的抑制作用

將天然serpin-3與絲氨酸蛋白酶在25℃條件下孵育10min，隨后加入靶酶相應(yīng)底物，以測定的450nm處吸光度來衡量絲氨酸蛋白酶催化底物的活性，并以此間接考天然serpin-3對絲氨酸蛋白酶的抑制作用。結(jié)果如圖4-A所示，單獨(dú)的緩沖體系、BSA和天然serpin-3對底物無催化作用；絲氨酸蛋白酶可對其進(jìn)行切割，引起吸光度上升；BSA對絲氨酸蛋白酶的催化活性無影響；但在加入天然serpin-3后，絲氨酸蛋白酶對底物的催化作用顯著降低，說明天然serpin-3對絲氨酸蛋白酶的催化活性具有明顯的抑制作用。

為進(jìn)一步考察天然serpin-3是否通過與絲氨酸蛋白酶形成共價復(fù)合物的自殺性形式產(chǎn)生抑制作用，本實(shí)驗(yàn)將兩者按1:16的濃度比混合后，分別于4℃孵育過夜、25℃孵育10min和37℃孵育10min的條件下。利用SDS-PAGE檢測各反應(yīng)條件下，孵育組分分子量的變化情況。如圖4-B所示：在25℃孵育條件下，電泳泳道中檢測到約68KD的新形成蛋白條帶，經(jīng)質(zhì)譜鑒定，該條帶新條帶為兩者形成的共價復(fù)合物。

將利用大腸桿菌表達(dá)體系獲得的重組Serpin-3、重組His₆-Serpin-3、重組Serpin-3-Flag、重組Serpin-3-GST以及利用昆蟲表達(dá)體系、酵母表達(dá)體系、哺乳動物表達(dá)體系獲得的重組Serpin-3、重組His₆-Serpin-3，分別重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4-C、D，上述體系中所獲得的Serpin-3類似物及活性片段均與天然Serpin-3一樣，可顯著抑制絲氨酸蛋白酶的催化活性。

2.Serpin-3體內(nèi)對抗菌肽合成的抑制作用

首先利用RNAi技術(shù)從基因水平封閉Serpin-3的表達(dá)。選取四齡期柞蠶幼蟲，注射預(yù)先合成的Serpin-3 dsRNA(0.2μg/只)約24h后，分為三組分別繼續(xù)注射大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌(2*10⁸cells/ml，10μl)，誘導(dǎo)8h后收取脂肪體并提取RNA后進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)注射dsRNA后，脂肪體幾乎不再表達(dá)Serpin-3mRNA。

在成功封閉Serpin-3的基因后，利用qRT-PCR檢測在不同病原微生物誘導(dǎo)下，柞蠶體內(nèi)抗菌物質(zhì)的表達(dá)情況。結(jié)果如圖5A，在降低Serpin-3表達(dá)的前提下，用金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)柞蠶抗菌肽的表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Gloverin、Moricin、Lysozyme、Ceropin A、attacin、Lebocin以及PPO的表達(dá)量均有顯著上調(diào)，說明Serpin-3能夠顯著抑制柞蠶體內(nèi)多種抗菌肽以及抗菌活性物質(zhì)的合成。

相同實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)在大腸桿菌、白色念珠菌、藤黃微球菌等多種病原菌誘導(dǎo)的情況下，如圖5B、C。

3.Serpin-3及其類似物、活性片段對酚氧化酶原激活系統(tǒng)的抑制作用

按照實(shí)施例8-2方法封閉Serpin-3的基因，考察柞蠶幼蟲在病原菌刺激下體表黑化情況。圖6-A結(jié)果顯示，相較于注射昆蟲生理鹽水與注射dsEGFP的對照組，Serpin-3干擾組幼蟲在混合型微生物誘導(dǎo)情況下，體表更易變黑并有伴死亡現(xiàn)。說明Serpin-3能夠抑制幼蟲的黑化反應(yīng)。

收集Serpin-3 dsRNA干擾后四齡期柞蠶血淋巴，以微生物典型病原體相關(guān)分子模式(laminarin，LTA和LPS)替代不同類型的微生物，誘導(dǎo)刺激柞蠶幼蟲，考察血淋巴中酚氧化酶(PO)的活力。結(jié)果顯示，Serpin-3基因封閉后血淋巴中PO的活性顯著增強(qiáng)(圖6-B)，結(jié)合上述黑化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明Serpin-3在體內(nèi)對柞蠶pro-PO系統(tǒng)具有負(fù)向調(diào)控作用。

體外實(shí)驗(yàn)考察Serpin-3及其類似物、活性片段對不同病原體誘導(dǎo)的柞蠶pro-PO系統(tǒng)的影響。首先通過體外酚氧化酶活性實(shí)驗(yàn)考察天然Serpin-3、重組Serpin-3、重組His₆-Serpin-3、重組Serpin-3-Flag、重組Serpin-3-GST對酚氧化酶原激活系統(tǒng)的抑制作用：以重組His₆-Serpin-3為例，將不同類型重組蛋白分別與血淋巴混合后，分別加入六種病原菌刺激激活血淋巴中的pro-PO系統(tǒng)，通過檢測PO活力判定pro-PO系統(tǒng)的激活情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6-C)顯示，單純重組蛋白對血淋巴PO系統(tǒng)沒有明顯的激活作用，但與六種病原菌(大腸桿菌，藤黃微球菌，枯草桿菌，白色念球菌，酵母菌，金黃色葡萄球菌)刺激激活的PO活力相比，重組蛋白的存在對病原體激活的PO系統(tǒng)具有明顯的抑制作用。相同實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)在不同類型的微生物典型病原體相關(guān)分子模式刺激下的PO系統(tǒng)中(圖6-D)。利用重組Serpin-3、重組Serpin-3-Flag、重組Serpin-3-GST也可獲得相同實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)施例8：

天然、重組Serpin-3以及其類似物、活性片段及其抗體的應(yīng)用

為使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍，本實(shí)施例以Serpin-3的生物活性為代表進(jìn)行描述，Serpin-3類似物、活性片段也具有相同的生物活性。同時也以柞蠶作為鱗翅目昆蟲的生物活性實(shí)驗(yàn)昆蟲為代表進(jìn)行描述。本專業(yè)技術(shù)人員可以以Serpin-3及其類似物、活性片段及其抗體的生物活性為核心與基礎(chǔ)，進(jìn)一步拓展Serpin-3及其類似物、活性片段及其抗體的應(yīng)用范圍。

1.Serpin-3及其類似物、活性片段抑制絲氨酸蛋白酶的活性

如實(shí)施例8中所描述，Serpin-3及其類似物、活性片段可以顯著抑制絲氨酸蛋白酶的活性，且不易產(chǎn)生耐藥性，可以作為制備腫瘤、胃炎、胰腺炎、癌癥等疾病的治療及其保健藥物的應(yīng)用。

2.Serpin-3及其類似物、活性片段抑制抗菌肽的產(chǎn)生

如實(shí)施例8中所描述，Serpin-3及其類似物、活性片段可以抑制昆蟲產(chǎn)生抗菌肽，基于此，能夠通過提高Serpin-3及其類似物、活性片段的含量，提高柞蠶的抗病能力。與此同時，利用Serpin-3及其類似物、活性片段的抗體封閉Serpin-3，能夠顯著提高昆蟲體內(nèi)多種抗菌肽的表達(dá)，基于此，可從產(chǎn)生抗菌肽的昆蟲體內(nèi)制備相應(yīng)的抗菌肽，該抗菌肽可以用于醫(yī)藥領(lǐng)域。

3.Serpin-3及其類似物、活性片段抗體的應(yīng)用

針對實(shí)施例6獲得的Serpin-3及其衍生物、類似物、活性片段作的抗體，利用免疫學(xué)以及分子生物學(xué)等常規(guī)、通用技術(shù)、方法等，通過Serpin-3及其衍生物、類似物、活性片段的抗體，用于鱗翅目昆蟲樣品的Serpin-3免疫檢測。同樣，也適用于從鱗翅目昆蟲分離純化制備Serpin-3過程中的免疫檢測跟蹤分析以及樣品的定性、定量檢測分析。此方面的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)在上述的天然、重組Serpin-3及其衍生物、類似物、活性片段分離純化制備過程中的實(shí)施例應(yīng)用。

如實(shí)施例8中所描述，Serpin-3及其類似物、活性片段可以抑制昆蟲產(chǎn)生抗菌肽，而利用Serpin-3及其類似物、活性片段的抗體封閉Serpin-3，能夠顯著提高昆蟲體內(nèi)多種抗菌肽的表達(dá)?；诖?，可從產(chǎn)生抗菌肽的昆蟲體內(nèi)制備相應(yīng)的抗菌肽，該抗菌肽可以用于醫(yī)藥領(lǐng)域。

Serpin-3及其類似物、活性片段的抗體，通過與Serpin-3及其類似物、活性片段的結(jié)合而屏蔽了Serpin-3及其類似物、活性片段原有的生物活性?；谶@種結(jié)合屏蔽作用原理可以廣泛應(yīng)用。