本發(fā)明屬于基因工程抗體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種特異性結(jié)合腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物8的單克隆抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物(TEM8)是腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物(tumor endothelial markers，TEMs)中的一種，最初分別在腫瘤血管形成和體外正常血管形成過(guò)程中的內(nèi)皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。TEM8是一種由564個(gè)氨基酸殘基組成的具有完整跨膜螺旋的I型跨膜蛋白，胞外有大約300個(gè)氨基酸，包括一個(gè)約200個(gè)氨基酸組成的vWA結(jié)構(gòu)域和近膜的一個(gè)功能未知的Ig樣結(jié)構(gòu)域。其中v WA結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)相互作用，TEM8的vWA結(jié)構(gòu)域具有典型的Ⅰ結(jié)構(gòu)域特征：一個(gè)NAD結(jié)合的Rossmann折疊，這一結(jié)構(gòu)是由個(gè)α﹣螺旋圍繞著中央的一個(gè)六層的β﹣折疊組成，在α﹣螺旋和β﹣折疊之間創(chuàng)造了一個(gè)疏水核心。目前對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)域的了解相當(dāng)有限，只知道其由23個(gè)氨基酸殘基組成，比一般的跨膜蛋白的跨膜區(qū)多兩個(gè)殘基，此外TEM8還有一個(gè)非常特殊的胞質(zhì)尾。

在研究腫瘤血管形成相關(guān)基因的表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)TEM8在鼠和人的各種腫瘤血管細(xì)胞表面或者腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)量均有上調(diào)。起初發(fā)現(xiàn)TEM8表達(dá)于結(jié)腸癌內(nèi)皮細(xì)胞中，而在周?chē)＝M織中表達(dá)微乎其微，隨后在結(jié)腸癌組織的血管中也檢測(cè)到TEM8蛋白，后來(lái)TEM8還被發(fā)現(xiàn)在許多不同類(lèi)型的人類(lèi)腫瘤(包括膀胱癌、結(jié)腸癌、食管癌和肺癌等)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)增加，而在正常組織的血管中沒(méi)有表達(dá)或表達(dá)很少。這些研究都表明TEM8可以成為治療腫瘤的新靶點(diǎn)。

腫瘤是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康的疾病，除了早期的化療外，其余主要依靠抗體類(lèi)的藥物，目前大多數(shù)藥物針對(duì)的靶點(diǎn)是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體，除了價(jià)格昂貴，療效也很難達(dá)到預(yù)期。針對(duì)靶點(diǎn)TEM8的抗體將會(huì)是一個(gè)新的治療途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種特異性結(jié)合TEM8的單克隆抗體，以及含有該抗體的藥物組合物或試劑、試劑盒或芯片，在檢測(cè)腫瘤發(fā)生，發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的用途。

本發(fā)明的特異性結(jié)合TEM8的單克隆抗體對(duì)TEM8具有特異性結(jié)合。

經(jīng)檢測(cè)，本發(fā)明的特異性結(jié)合TEM8的單克隆抗體與TEM8重組蛋白結(jié)的結(jié)合活性的EC50值為32.42ng/ml，與TEM8過(guò)表達(dá)細(xì)胞結(jié)合，EC50值為133ng/ml。

本發(fā)明的特異性結(jié)合TEM8的單克隆抗體，其氨基酸序列區(qū)由重鏈和輕鏈中的高度可變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3，以及連接序列和框架區(qū)組成，其中重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO.1、SEQ ID N0.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，和/或其輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，重鏈和輕鏈中的高度可變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3是與TEM8結(jié)合的關(guān)鍵部位，框架區(qū)可在結(jié)合所需的三維結(jié)構(gòu)不受影響的條件下被其他序列置換。

在某些優(yōu)選例中，一個(gè)單克隆抗體包含如下內(nèi)容的可變區(qū)：一個(gè)包含了如SEQ ID NO.12的重鏈可變區(qū)，其含有CDR1(SEQ ID NO.1)、CDR2(SEQ ID NO.2)和CDR3(SEQ ID NO.3)，和一個(gè)包含了如SEQ ID NO.13的輕鏈可變區(qū)，其含有CDR1(SEQ ID NO.4)、CDR2(SEQ ID NO.5)，CDR3(SEQ ID NO.6)。

可變區(qū)CDR的變體與上述CDR區(qū)除了有至多6個(gè)氨基酸取代的不同外基本上是一致的(例如，1、2、3、4或5個(gè)氨基酸取代)，在該單克隆抗體的CDR區(qū)具有與TEM8結(jié)合活性。

在其它實(shí)施方案中，抗體可包含：a)一個(gè)重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID NO.12相比有至多6個(gè)氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6個(gè)取代；和b)一個(gè)輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID NO.8相比有至多6個(gè)氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6個(gè)氨基酸取代。目標(biāo)抗體可能包含這些取代中的任何一個(gè)或其組合。

擁有這些取代位置中任一個(gè)的抗體和擁有所有取代位置的抗體同樣具有結(jié)合TEM8的活性。氨基酸取代可同時(shí)存在于框架區(qū)和CDR區(qū)，或單獨(dú)出現(xiàn)在框架區(qū)或CDR區(qū)。因此，在某些優(yōu)選例中，重鏈可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO.13相比可能有最多6個(gè)氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6個(gè)取代，和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO.8相比可能有最多6個(gè)氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6個(gè)取代。

在一些抗體中，氨基酸取代可能分布在多個(gè)CDR區(qū)。因此，重鏈可變區(qū)的多個(gè)CDR區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO.12相比可能有至多6個(gè)氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6個(gè)取代，和輕鏈可變區(qū)的多個(gè)CDR區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO.13相比可能有至多6個(gè)氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6個(gè)取代。

在特殊的優(yōu)選例中，抗體可能包含a)一個(gè)重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID NO.12一致和b)一個(gè)輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID NO.13一致。

在特殊的優(yōu)選例中，抗體可能包含a)一個(gè)重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID NO.12至少有95％的一致性和b)一個(gè)輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID NO.13至少有95％的一致性。因此，目標(biāo)抗體可能包含a)一個(gè)重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID NO.12至少有約95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性和b)一個(gè)輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與SEQ ID NO.13至少有約95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。

在特殊的優(yōu)選例中，抗體可能包含a)一個(gè)重鏈，其氨基酸序列與SEQ ID NO.16一致和b)一個(gè)輕鏈，其氨基酸序列與SEQ ID NO.17一致。

在特殊的優(yōu)選例中，抗體可能包含a)一個(gè)重鏈，其氨基酸序列與SEQ ID NO.9至少有95％的一致性和b)一個(gè)輕鏈，其氨基酸序列與SEQ ID NO.10至少有95％的一致性。因此，目標(biāo)抗體可能包含a)一個(gè)重鏈，其氨基酸序列與SEQ ID NO.16至少有約95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性和b)一個(gè)輕鏈，其氨基酸序列與SEQ ID NO.17至少有約95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。除了上面所描述的氨基酸取代，目標(biāo)抗體可能在重鏈或輕鏈的兩端有附加的氨基酸。例如，目標(biāo)抗體在重鏈和/或輕鏈的C或N末端分別可能包含至少1、2、3、4、5或6或更多的附加氨基酸。在某些實(shí)施例中，目標(biāo)抗體可能比這里所描述的示范性氨基酸短，其主要區(qū)別為在重鏈和輕鏈的兩端分別比示范性氨基酸少1、2、3、4、5或6個(gè)氨基酸。

本發(fā)明所述特異性結(jié)合TEM8的單克隆抗體包括具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任意特異性結(jié)合因子，是單價(jià)的或是單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽；如免疫球蛋白亞型：IgG，IgE，IgM，IgD和IgA及其亞型亞類(lèi)，如包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段：Fab、scFv、Fv、dAb、Fd。

本發(fā)明的特異性結(jié)合TEM8的單克隆抗體的制備方法是雜交瘤方法，根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的氨基酸序列人工合成或用PCR法擴(kuò)增，或者采用重組DNA方法，將本發(fā)明公開(kāi)的氨基酸序列連入合適的表達(dá)載體中。

本發(fā)明的特異性結(jié)合TEM8的單克隆抗體的純化采用本領(lǐng)域已知的純化免疫球蛋白分子的任何方法對(duì)其進(jìn)行純化，如：色譜法，包括離子交換色譜、親和色譜、特別是通過(guò)蛋白A對(duì)特異性抗原的親和色譜和其它柱色譜，離心，利用溶解度差異，或通過(guò)任何其它純化蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。

本發(fā)明的特異性結(jié)合TEM8的單克隆抗體可通過(guò)多種方式修飾，如：用DNA重組技術(shù)產(chǎn)生保留原來(lái)抗體特異性的其它抗體或嵌合分子，包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)(參見(jiàn)，EP.A-184187，GB 2188638A或EP.A-239400)，或者對(duì)雜交瘤細(xì)胞或產(chǎn)生抗體的其它細(xì)胞進(jìn)行遺傳突變或其它改變，改變或者不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。

本發(fā)明還提供所述的特異性結(jié)合TEM8的單克隆抗體在制備備用于治療TEM8相關(guān)性疾病藥物中的用途。所述的TEM8相關(guān)性疾病包括膀胱癌、結(jié)腸癌、食管癌和胰腺癌等TEM8過(guò)表達(dá)腫瘤。

本發(fā)明還提供含有特異性結(jié)合TEM8的單克隆抗體的藥物組合物或試劑、試劑盒或芯片。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果是：

本發(fā)明的特異性結(jié)合TEM8的單克隆抗體，與TEM8重組蛋白和TEM8過(guò)表達(dá)細(xì)胞中的TEM8抗原都具有極強(qiáng)的特異性和敏感性，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明的特異性結(jié)合TEM8的單克隆抗體可用于與TEM8相關(guān)性疾病藥物中，如膀胱癌、結(jié)腸癌、食管癌和胰腺癌等，以及包含TEM8的單克隆抗體的藥物組合物或試劑、試劑盒或芯片，采用含有該抗體的試劑盒進(jìn)行TEM8相關(guān)診斷與檢測(cè)，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

此外，本發(fā)明的特異性結(jié)合TEM8的單克隆抗體還可以用于與TEM8相關(guān)的科學(xué)研究，如發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、代謝、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、功能基因組學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的科學(xué)研究、或腫瘤等醫(yī)學(xué)和藥學(xué)的應(yīng)用研究，用于臨床中檢測(cè)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等實(shí)驗(yàn)中。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1中重組表達(dá)的抗人TEM8的嵌合抗體SDS-PAGE的還原電泳圖；

圖2是實(shí)施例3中單克隆抗體的噬菌體與TEM8過(guò)表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合活性即吸光值的檢測(cè)結(jié)果；

圖3是實(shí)施例4的單克隆抗體NMT802和NMT803與TEM8蛋白的結(jié)合活性測(cè)試結(jié)果；

圖4是實(shí)施例4的單克隆抗體NMT802和NMT803與TEM8過(guò)表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合活性測(cè)試結(jié)果；

圖5是實(shí)施例4的流式細(xì)胞儀檢測(cè)NMT802抗體與細(xì)胞膜TEM8結(jié)合活性測(cè)試結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

本實(shí)施例通過(guò)雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備鼠源特異性結(jié)合TEM8單克隆抗體，有關(guān)實(shí)驗(yàn)方案參見(jiàn)文獻(xiàn)(Ed Harlow,David Lane.Antibody:A laboratory manual.1988)，具體按照以下步驟進(jìn)行：

首先通過(guò)基因合成技術(shù)合成TEM8單克隆抗體序列的TEM8全長(zhǎng)基因(SEQ ID NO.20)，將TEM8全長(zhǎng)基因通過(guò)HindIII和XbaI兩個(gè)酶切位點(diǎn)的克隆入PCDNA3.1(Invitrogen)，轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒進(jìn)入CHO-K1(ATCC No.CCL-60)細(xì)胞株，經(jīng)過(guò)G418(GIBCO)加壓篩選，獲得TEM8穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞株；

用1×10⁷個(gè)TEM8穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞，對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行腹腔注射，首次免疫后，分別在第14d和第35d，用1×10⁷個(gè)細(xì)胞腹腔注射對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，第56d用1×10⁶個(gè)對(duì)BALB/c小鼠靜脈注射進(jìn)行最終免疫，4天后取脾臟進(jìn)行融合；

將鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞(ATCC No.CRL-1581)按數(shù)量比5：1比例融合，在96孔板(Corning)中以HAT(GBICO)培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞篩選，所得細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒定篩選；

鑒定篩選過(guò)程分為兩個(gè)步驟：

①將重組TEM8蛋白(來(lái)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司)固定化于96孔酶聯(lián)免疫吸附板(Costar)上，加入克隆表達(dá)上清孵育1h后，用PBST洗滌3次，使用羊抗鼠IgG抗體-HRP(Jackson Immuno)鑒定具有TEM8結(jié)合活性細(xì)胞克隆上清，從而獲得可與TEM8直接結(jié)合的陽(yáng)性克?。?/p>

②隨后將步驟①中的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)移入24孔板(Corning)培養(yǎng)，以獲得更多的表達(dá)產(chǎn)物，將TEM8穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞株接種于96孔板(Corning)上過(guò)夜培養(yǎng)，加入陽(yáng)性克隆表達(dá)上清共同孵育1h，再用PBS洗滌3次，使用EU標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Perkin Elmer)進(jìn)行檢測(cè)，從而鑒別出能夠結(jié)合細(xì)胞表面TEM8的陽(yáng)性克隆；

將所篩選的陽(yáng)性克隆的雜交瘤細(xì)胞裂解，提取mRNA后逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，以此cDNA為模板，采用PCR方法分別擴(kuò)增出鼠IgG抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)核酸序列，對(duì)重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)進(jìn)行分析，其編碼的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO.1的親本序列(TSGMGVG)、SEQ ID NO.2的親本序列(WWDDVKRYYPALKS)和SEQ ID NO.3的親本序列(IGYDWFPY)、輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO.4的親本序列(KASQNVGIAVA)、SEQ ID NO.5的親本序列(SASNRYT)和SEQ ID NO.6的親本序列(QQYRSYPLT)；

然后，通過(guò)序列末端互補(bǔ)的方法，拼接重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)與其對(duì)應(yīng)的人源抗體的恒定區(qū)序列，將全長(zhǎng)的嵌合抗體的重鏈和輕鏈片段，均包含信號(hào)肽，分別克隆入PCDNA3.1(Invitrogen)質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染輕、重鏈質(zhì)粒至293C18細(xì)胞株(ATCC No.CRL-10852)，培養(yǎng)7天后，用Protein A(GE)純化上清，最終獲得重組表達(dá)的抗人TEM8的嵌合抗體，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的重鏈和SEQ ID NO.8所示的輕鏈，SDS-PAGE還原蛋白電泳分析抗體如圖1所示，其中：重鏈分子量約55KD，輕鏈分子量約30KD。

實(shí)施例2

本實(shí)施例是將實(shí)施例1中制備的鼠源特異性結(jié)合TEM8單克隆抗體人源化，具體按照以下步驟進(jìn)行：

分析鼠源抗體序列，與IMGT的人胚系(germ line)基因比對(duì)，最終確定IGKV1-39*02,IGKV1-13*02和IGKV1-8*01分別為輕鏈FR1,FR2和FR3的人源化框架序列，確定IGHV2-70*06,IGHV2-5*02和IGHV2-26*01為重鏈FR1,FR2和FR3的人源化框架序列，通過(guò)CDR-grafting，將重鏈和輕鏈的CDR并置到構(gòu)架序列，構(gòu)建人源化抗體，稱(chēng)為NMT801，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，輕鏈可變區(qū)如SEQ ID NO.10所示。

實(shí)施例3

本實(shí)施例是對(duì)實(shí)施例2中的NMT801抗體進(jìn)行親和力篩選，基因合成NMT801抗體的scfv片段，如SEQ ID NO.11所示，并將scfv連接到PCOMB3噬菌體質(zhì)粒中，分析鼠源抗體CDR的DNA序列，確定可變區(qū)CDR中的突變熱點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物序列，將突變熱點(diǎn)位點(diǎn)所在的引物位置設(shè)計(jì)為NNS，使之編碼任意的氨基酸，以NMT801抗體scfv為模板，PCR擴(kuò)增scfv抗體庫(kù)，將scfv的抗體庫(kù)，通過(guò)sfiI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建到PCOMB3噬菌體質(zhì)粒中，構(gòu)建二級(jí)抗體庫(kù)，然后通過(guò)噬菌體展示進(jìn)行高親和力抗體篩選，具體步驟如下：

a.通過(guò)電轉(zhuǎn)化，將含scfv的抗體庫(kù)的噬菌體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到TG1中，經(jīng)過(guò)37度，220rpm，1h的恢復(fù)后，將helper phage加入到剩余的菌液中，另加入Ampicillin，37度，220rpm，1h，2500rpm x5min離心去上清，用2x YT-AK吹懸菌泥，37度，220rpm過(guò)夜培養(yǎng)；

b.包被抗原：用包被緩沖液稀釋TEM8蛋白，混勻加入到免疫管中，4度包被過(guò)夜；

c.重組噬菌體收集：上述過(guò)夜培養(yǎng)菌液，2500rpm x5min離心，收集上清10ml，加入2ml PEG/NaCl，混勻放置冰上30-60min，10000g×20min離心，去上清，用2x YT溶解噬菌體庫(kù)；

d.封閉：免疫管用PBS洗兩次，加入封閉液，室溫1h；另外，取等體積封閉液與噬菌體庫(kù)混合，室溫封閉10-15min；

e.孵育噬菌體庫(kù)：免疫管用PBS洗2次，加入封閉好的噬菌體庫(kù)，37度培養(yǎng)箱2-3h；

f.洗脫：取100TG1菌液(前一天接種)到10ml2x YT中，37度，220rpm培養(yǎng)到A600值0.4-0.5。用PBST洗滌免疫管8次，再用PBS洗2次,加入5ml對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的菌液，37度,220rpm,1h；

g.OUTPUT:稀釋上述菌液10-1,10-2，分別取100ul涂平板。

h.INPUT:取稀釋10-2,10-4,10-6的重組噬菌體庫(kù)各1ul，加入到100ul對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的菌液中，37度,220rpm,1h，然后將感染的菌液涂平板；

i.下－輪篩選：取200ul helper phage加入到5ml洗脫后的菌液中，同時(shí)加入5ul Ampicillin，37度，220rpm，1h，2500rpm x5min離心去上清，用10ML 2x YT-AK吹懸菌泥，37度，220rpm過(guò)夜培養(yǎng)，重復(fù)步驟b-h。

經(jīng)過(guò)三輪篩選，挑選單克隆抗體，通過(guò)噬菌體ELISA方法，檢測(cè)phage活性，具體如下：

a.包被TEM8蛋白，0.5ug/ml，4度過(guò)夜；

b.PBST洗兩次，加入50ul phage上清和50ul 1％BSA，25℃，1h；

c.PBST洗三次，加入100ul 1:10000稀釋的anti-M13-Ab-HRP，25℃，1h。；

d.PBST洗三次，加入100ul預(yù)熱的TMB,25℃，10min；

e.加入50ul 1M H2SO4中止反應(yīng)，OD450檢測(cè)吸光值。

挑選陽(yáng)性單克隆抗體，通過(guò)噬菌體與TEM8過(guò)表達(dá)細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)單克隆抗體的細(xì)胞結(jié)合活性，具體如下：

a.用胰酶消化TEM8過(guò)表達(dá)細(xì)胞，200gx5min；

b.棄上清，用1％BSA重懸細(xì)胞，25℃，封閉20min；

c.50ul phage上清和50ul 1％BSA，25℃，1h；

d..細(xì)胞鋪板，2500rpmx5min；

e.棄上清，用封閉好的phage重懸細(xì)胞，100ul/well，rt，1h；

f.PBS洗兩次，加入100ul 1:10000稀釋的anti-M13-Ab-HRP，rt，1h；

g.PBST洗兩次，加入100ul預(yù)熱的TMB,25℃，10min；

h.加入50ul 1M H2SO4中止反應(yīng)，OD450檢測(cè)吸光值。

結(jié)果如圖2所示，顯示出通過(guò)細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)，挑選五個(gè)細(xì)胞結(jié)合克隆體，分別是clone 3,clone 4,clone 5,clone 6,clone 7，并進(jìn)行測(cè)序，共鑒定出2株序列不同的親和力成熟單克隆抗體，來(lái)自clone 3的抗體命名為NMT802，另外，clone 4,clone 5,clone 6,clone 7序列一致，抗體命名為NMT803。其中，NMT802的重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，輕鏈可變區(qū)如SEQ ID NO.13所示，NMT803的重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，輕鏈可變區(qū)如SEQ ID NO.15所示。另外，構(gòu)建NMT802和NMT803的全長(zhǎng)抗體，NMT802的重鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，NMT802的重鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示。將NMT802和NMT803表達(dá)質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)293C18細(xì)胞株(ATCC No.CRL-10852)，用Protein A(GE)純化上清，獲取純化抗體。

實(shí)施例4

本實(shí)施例是對(duì)單克隆抗體的活性進(jìn)行測(cè)定，具體按照以下步驟進(jìn)行：

A：與重組TEM8蛋白結(jié)合活性測(cè)定

將TEM8蛋白包被于96孔酶聯(lián)免疫吸附板(Costar)上，然后將1:4系列稀釋實(shí)施例3中的純化抗體加入包被TEM8蛋白板的孔中，加入鼠抗人IgG抗體-HRP(Jackson Immuno)，顯色進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示如圖3，所篩選的單克隆抗體NMT802和NMT803與TEM8蛋白的直接結(jié)合EC50分別為32.42ng/ml和5.441ng/ml。

B：與TEM8過(guò)表達(dá)細(xì)胞結(jié)合活性測(cè)定

將PD1過(guò)表達(dá)細(xì)胞鋪板于黑色96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜，1％BSA封閉，37度，孵育1小時(shí)，抗體5ug/ml起始，3倍稀釋?zhuān)?濃度，100ul/孔，25度孵育1小時(shí)，PBS洗一次，然后，加入anti-human-EU，50ng/ml，每孔100ul，25度反應(yīng)0.5小時(shí)，PBS洗一次，最后，加入熒光增強(qiáng)液，激發(fā)光337nm/發(fā)射光620nm讀數(shù)。結(jié)果顯示如圖4所示，所篩選的單克隆抗體NMT802和NMT803與TEM8過(guò)表達(dá)細(xì)胞結(jié)合EC50分別為133ng/ml和764.7ng/ml。

C：采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗體與細(xì)胞膜TEM8的結(jié)合活性

取1×10⁶個(gè)細(xì)胞，PBS洗一次，加入1％BSA封閉，冰上1小時(shí)，加入TEM8抗體，冰上孵育1小時(shí)，PBS洗兩次，加入FITC-鼠抗人IgG二抗，冰上孵育1小時(shí)。PBS洗兩次，用500ul PBS吹懸，采用BD流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗體與細(xì)胞膜TEM8結(jié)合水平，結(jié)果如圖5顯示，NMT802抗體能夠特異結(jié)合細(xì)胞膜TEM8，空白CHO-K1作為陰性對(duì)照，NMT802抗體不與CHO-K1結(jié)合。

實(shí)施例5

在實(shí)施例1～4所披露的特異性結(jié)合TEM8的單克隆抗體的基礎(chǔ)上，所得到的特異性結(jié)合TEM8的單克隆抗體的藥物組合物或試劑、試劑盒或芯片，在用于治療或檢測(cè)TEM8相關(guān)性疾病藥物中的用途。

SEQUENCE LISTING

<110> 江蘇諾邁博生物醫(yī)藥科技有限公司

<120> 一種特異性結(jié)合腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物8的單克隆抗體及其應(yīng)用

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<170> PatentIn version 3.5

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Arg

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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 20

<211> 1695

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 20

atggctaccg ccgaaagaag ggctctgggc attggattcc agtggctcag cctcgccaca 60

ctcgtgctga tttgcgctgg ccaaggcgga agaagagaag acggcggccc cgcttgctat 120

ggaggattcg acctgtactt catcctggat aagagcggct ccgtgctcca ccactggaac 180

gagatttact acttcgtcga gcagctggcc cacaaattta tcagccccca gctgaggatg 240

tccttcatcg tcttcagcac caggggcacc acactgatga agctgacaga ggatagggag 300

caaattaggc agggcctcga agagctgcaa aaggtcctgc ccggcggcga cacctacatg 360

cacgaaggct tcgagagggc tagcgagcag atctattacg aaaataggca aggctacaga 420

accgccagcg tcatcatcgc cctcaccgat ggagaactgc acgaggacct cttcttctac 480

agcgaaaggg aggccaatag gtccagggac ctgggagcca ttgtgtactg cgtgggagtc 540

aaggacttca acgaaaccca gctcgccaga atcgccgaca gcaaggacca cgtgttccct 600

gtgaatgacg gcttccaggc cctccaggga atcatccaca gcattctgaa gaagagctgc 660

attgagatcc tggccgccga acccagcaca atttgcgccg gcgagagctt ccaggtcgtg 720

gtcaggggaa atggcttcag acatgccaga aacgtcgaca gagtgctgtg cagcttcaag 780

atcaacgaca gcgtcaccct gaacgagaag cccttttccg tcgaggatac ctacctgctg 840

tgtcctgccc ctatcctgaa ggaggtgggc atgaaagccg ccctccaggt gagcatgaac 900

gacggactga gcttcatcag cagctccgtc atcatcacca ccacacactg tagcgatggc 960

agcatcctcg ccatcgctct gctgatcctc tttctgctgc tcgccctggc cctcctctgg 1020

tggttctggc ctctctgctg caccgtgatc atcaaggaag tgcctcctcc ccccgccgag 1080

gaaagcgaag aggaggatga cgacggcctc cctaagaaga agtggcctac agtggacgct 1140

agctactacg gcggaagggg cgtcggcgga atcaagagga tggaggtgag gtggggagag 1200

aaaggctcca cagaggaggg cgctaagctg gagaaggcca agaatgccag agtgaagatg 1260

cccgagcagg agtacgagtt ccccgagcct agaaacctga acaacaatat gaggaggccc 1320

tccagcccta ggaaatggta ctcccccatc aaaggaaagc tcgacgccct gtgggtgctc 1380

ctgagaaagg gctacgacag ggtgagcgtg atgagacctc aacccggaga caccggcagg 1440

tgtatcaact tcacaagggt caagaacaat cagcccgcta aatatcccct caacaacgcc 1500

tatcacacca gctcccctcc tcctgccccc atctacaccc ctcctcctcc tgctcctcat 1560

tgccctcccc ctcctcctag cgctcccaca ccccctattc ctagccctcc ttccaccctg 1620

cctccccctc ctcaagctcc tcctcccaac agagcccctc ctcctagcag gcctcctccc 1680

agaccttccg tgtag 1695