本發(fā)明涉及一種人類程序性死亡受體配體1（PD-L1）的抗體，具體涉及一種針PD-L1的單克隆抗體或抗體片段。

背景技術(shù)：

程序性死亡配體1（PD-L1）在慢性傳染病，懷孕，組織移植，自身免疫性疾病和癌癥的過程中起著免疫抑制的作用。PD-L1通過與程序性死亡受體1（PD-1）相結(jié)合來調(diào)控免疫系統(tǒng)的應(yīng)答。PD-1主要表達(dá)在T細(xì)胞，B細(xì)胞和單核細(xì)胞的表面。PD-L1也可以通過與它的另外的受體B7-1相互作用來下調(diào)T細(xì)胞的功能。PD-L1/ PD-1信號(hào)通路的激活能下調(diào)T細(xì)胞的活性和細(xì)胞因子的分泌，抑制免疫系統(tǒng)的抗癌活性。PD-L1在很多癌癥組織中都有很高的表達(dá)，比如膀胱癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，肺癌，黑色素瘤，卵巢癌，唾液腺癌，胃癌，甲狀腺癌等。PD-L1在癌細(xì)胞中的過表達(dá)有可能與加速癌細(xì)胞的侵襲和很低的預(yù)后有關(guān)?？谷说腜D-L1單克隆抗體可以有效的與人的PD-L1結(jié)合，阻斷PD-L1介導(dǎo)的信號(hào)通路，從而激活人體的免疫系統(tǒng)，達(dá)到治療癌癥或者其他相關(guān)疾病的目的。

目前針對PD-L1受體PD-1的單抗藥，如Keytruda（默沙東研發(fā)的藥物，第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)的PD-1抑制劑）、Opdivo（百時(shí)美施貴寶研發(fā)的藥物，PD-1抑制劑）和Atezolizumab（羅氏研發(fā)的藥物，PD-L1抑制劑）已經(jīng)上市，并且在多種癌癥的治療中表現(xiàn)出了顯著的治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種針對PD-L1的單克隆抗體或抗體片段，該抗體或抗原與其結(jié)合片段能夠高特異性的與人PD-L1結(jié)合，能夠提高淋巴細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-2（IL-2），增強(qiáng)免疫系統(tǒng)。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種針對PD-L1的單克隆抗體或抗體片段，該抗體或抗體片段包含：重鏈和輕鏈，所述的抗體片段為抗原與所述的抗體結(jié)合的片段。

其中，所述的重鏈和輕鏈包括可變區(qū)，所述的可變區(qū)包括互補(bǔ)決定區(qū)。

其中，所述重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3分別用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示；所述輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3分別用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示。

其中，所述的HCDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO：3或該序列內(nèi)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)氨基酸被其他氨基酸簡單置換的SEQ ID NO：3。

其中，所述的HCDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO：4或該序列內(nèi)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)氨基酸被其他氨基酸簡單置換的SEQ ID NO：4。

其中，所述的HCDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO：5或該序列內(nèi)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)氨基酸被其他氨基酸簡單置換的SEQ ID NO：5。

其中，所述的LCDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO：6或該序列內(nèi)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)氨基酸被其他氨基酸簡單置換的SEQ ID NO：6。

其中，所述的LCDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO：7或該序列內(nèi)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)氨基酸被其他氨基酸簡單置換的SEQ ID NO：7。

其中，所述的LCDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO：8或該序列內(nèi)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)氨基酸被其他氨基酸簡單置換的SEQ ID NO：8。

所述的重鏈可變區(qū)氨基酸序列包括SEQ ID NO：1或選自SEQ ID NO：1中的氨基酸組成的至少80%同源性的氨基酸序列。

所述的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列包括SEQ ID NO：2或選自SEQ ID NO：2中的氨基酸組成的至少80%同源性的氨基酸序列。

所述的抗體或抗體片段以2×10^-9M 或更低的K_D與人PD- L1結(jié)合，并且與人PD-L2結(jié)合不顯著或不結(jié)合。

所述的抗體或抗體片段為：嵌合抗體，人源化抗體，全人源抗體，或選自以下的抗體片段：Fab、F（ab’）₂、Fv、dAb和scFv。

所述的全人源抗體為IgG1、IgG2或IgG4全長抗體中的任意一種。

所述的抗體或抗體片段的重鏈可變區(qū)由選自SEQ ID NO：9中的核苷酸序列編碼；所述的抗體或抗體片段的輕鏈可變區(qū)由選自SEQ ID NO：10中的核苷酸序列編碼。

一種含有所述的核苷酸序列的表達(dá)載體。

一種含有所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。

所述的針對PD-L1的全人源單克隆抗體或抗體片段在制備免疫偶聯(lián)物或其組合物中的用途，所述的免疫偶聯(lián)物由治療劑與所述的抗體或抗原與其結(jié)合片段共價(jià)結(jié)合；所述的組合物由所述的免疫偶聯(lián)物和藥學(xué)上可用載體組合。

所述的治療劑包括：細(xì)胞毒劑、放射性同位素或免疫抑制劑。

所述的針對PD-L1的全人源單克隆抗體或抗體片段在制備抗腫瘤藥物或其組合物中的用途。

所述的腫瘤包括：骨癌，肺癌，皮膚癌，頭頸癌，乳腺癌，子宮癌，卵巢癌，輸卵管癌，子宮內(nèi)膜癌，宮頸癌，陰道癌，前列腺癌，睪丸癌，陰莖癌，膀胱癌，輸尿管癌，腎癌，腎盂癌，結(jié)腸癌，直腸癌，胃癌，食道癌，胰腺癌，小腸癌，甲狀腺癌，甲狀旁腺癌，腎上腺癌，淋巴瘤，軟組織肉瘤，惡性黑色素瘤，慢性或急性白血病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的任意一種或兩種以上；所述的皮膚癌為鱗狀細(xì)胞癌；所述的淋巴瘤為霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或T細(xì)胞淋巴瘤；所述的慢性或急性白血病為急性髓細(xì)胞淋巴癌，慢性髓細(xì)胞淋巴癌，急性淋巴細(xì)胞癌或慢性淋巴細(xì)胞癌；所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤為神經(jīng)膠質(zhì)瘤或垂體腺瘤。

所述的針對PD-L1的全人源單克隆抗體或抗體片段在制備抗傳染病的藥物或其組合物中的用途，所述的傳染病包括：由病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲中任意一種或兩種以上引起的傳染病；

其中，所述的病毒包括：HIV、肝炎病毒、流感病毒、皰疹病毒、腺病毒、蟲媒病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、細(xì)小病毒、痘苗病毒、人類嗜T細(xì)胞病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和蟲媒病毒腦炎病毒中的任意一種或兩種以上。

其中，所述的細(xì)菌包括：分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、奈瑟氏菌、克雷伯氏菌、變形菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團(tuán)桿菌、白喉?xiàng)U菌、沙門氏菌、芽孢桿菌、霍亂菌、破傷風(fēng)菌、肉毒桿菌和鼠疫桿菌中的任意一種或兩種以上；所述的葡萄球菌為金黃色葡萄球菌，所述的鏈球菌為肺炎鏈球菌；所述的奈瑟氏菌為腦膜炎球菌或淋球菌，所述的假單胞菌為綠膿桿菌，所述的芽孢桿菌為炭疽桿菌。

其中，所述的真菌包括：假絲酵母、新型隱球菌、曲霉屬、毛霉屬(如)、申克孢子絲菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌和夾膜組織胞漿菌中的任意一種或兩種以上；所述的假絲酵母為白假絲酵母、克魯斯假絲酵母、光滑假絲酵母或熱帶假絲酵母，所述的曲霉屬為煙曲霉或黑曲霉，所述的毛霉屬為毛霉、犁頭霉或根霉。

其中，所述的寄生蟲包括：溶組織內(nèi)阿米巴、結(jié)腸小袋纖毛蟲、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴、利什曼原蟲、賈第蟲、隱孢子蟲、卡氏肺囊蟲、瘧原蟲、果氏巴貝蟲、布氏錐蟲、克氏錐蟲、杜氏利什曼原蟲、鼠弓形體、巴西日圓線蟲；所述的賈第蟲為蘭伯賈第蟲，所述的瘧原蟲為間日瘧原蟲。

所述的針對PD-L1的全人源單克隆抗體或抗體片段在制備抗炎癥性疾病的藥物或其組合物中的用途，所述的炎癥性疾病指由于淋巴細(xì)胞免疫下調(diào)所導(dǎo)致的炎癥性疾病。

所述的炎癥性疾病包括：扁平苔蘚癬。

本發(fā)明提供的一種針對PD-L1的單克隆抗體或抗原與其結(jié)合片段，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明的抗體和抗體片段與人PD-L1的高親和力結(jié)合，而且與人PD-L2不結(jié)合或不顯著結(jié)合，表明了本發(fā)明的抗體和抗體片段的特異性高；

本發(fā)明的抗體和抗體片段在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中能增強(qiáng)IL-2分泌的能力，增強(qiáng)免疫應(yīng)答；

本發(fā)明的抗體和抗體片段阻斷了PD-L1 與PD-1受體結(jié)合，刺激抗體應(yīng)答的能力，逆轉(zhuǎn)了調(diào)節(jié)T細(xì)胞的抑制狀態(tài)，從而使其處于激活狀態(tài)。

附圖說明

圖1為實(shí)驗(yàn)例1中篩選PD-L1抗原結(jié)果的條形圖。

圖2為實(shí)驗(yàn)例4中本發(fā)明的抗體與人PD-L1結(jié)合程度圖。

圖3為實(shí)驗(yàn)例5中本發(fā)明的抗體與人PD-L1結(jié)合的親和力曲線圖。

圖4為實(shí)驗(yàn)例6中本發(fā)明的抗體對淋巴細(xì)胞分泌IL-2的影響曲線圖。

具體實(shí)施方式

定義

“免疫應(yīng)答”是指免疫相關(guān)細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或粒細(xì)胞等）在收到抗原刺激之后，產(chǎn)生的一系列的信號(hào)傳遞過程，以及由此產(chǎn)生的免疫相關(guān)的生物大分子（如產(chǎn)生抗體、細(xì)胞因子或補(bǔ)體等）導(dǎo)致選擇性損傷、破壞或從人體中清除侵入的病原體、被病原體感染的細(xì)胞或組織、癌細(xì)胞或在自身免疫或病理性炎癥情況下的正常人細(xì)胞或組織。

“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑”是指信號(hào)從一個(gè)細(xì)胞的一部分向一個(gè)細(xì)胞的另一部分傳送中起作用的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間的生化關(guān)系。

“細(xì)胞表面受體”包括能夠接收信號(hào)和跨過細(xì)胞質(zhì)膜傳播這種信號(hào)的分子和分子復(fù)合物。本發(fā)明所述的PD-L1受體是一種細(xì)胞表面受體。

“抗體”是指包含通過二硫鍵互相連接在一起的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結(jié)合部分?？贵w包括完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段或單鏈抗體。

“重鏈”由重鏈可變區(qū)（VH）和重鏈恒定區(qū)組成。

“重鏈恒定區(qū)”由三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3組成。

“輕鏈”由輕鏈可變區(qū)（VL）和輕鏈恒定區(qū)（CL）組成。

“輕鏈恒定區(qū)”由一個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。

“重鏈可變區(qū)”和“輕鏈可變區(qū)”可進(jìn)一步再分為高變區(qū)，稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)，CDR散布在被稱為“構(gòu)架區(qū)”(FR)的更加保守的區(qū)域中。每個(gè)VH和VL均由三個(gè) CDR和四個(gè)FR組成，它們從氨基端向羧基端以如下順序排列：FR1， CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4，重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有可與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

“恒定區(qū)”可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，該宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(C1q)。

“抗原結(jié)合部分”是指保留與抗原(如PD-L1)特異性結(jié)合的能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。已證明抗體的抗原結(jié)合功能可由全長抗體的片段來行使?！翱乖Y(jié)合部分”中所包括的結(jié)合片段包括：(1)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(2)F(ab’) ₂片段，即包含在鉸鏈區(qū)（重鏈CHl和CH2功能區(qū)之間的區(qū)域）通過二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的雙價(jià)片段；(3)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(4)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(5)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段； (6)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH由單獨(dú)的基因編碼，但它們可以利用重組方法連接在一起，能夠制成一條蛋白質(zhì)鏈，其中VL和VH區(qū)配對構(gòu)成單價(jià)分子稱為單鏈Fv (即scFv)，這種單鏈抗體也包括在術(shù)語“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。這些抗體片段用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)獲得，并用與完整抗體相同的方法對這些片段的實(shí)用性進(jìn)行篩選。

“分離的抗體”是指基本不含特異性結(jié)合其它抗原的抗體(如本發(fā)明中所述與PD-L1特異性結(jié)合的分離的抗體，其基本不含與除PD-L1以外的抗原特異性結(jié)合的其他抗體)。但是，與PD-L1特異性結(jié)合的分離的抗體與來自其他物種的PD-L1分子（其他抗原）等可能具有交叉反應(yīng)性。分離的抗體基本不含其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)物質(zhì)。

“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指由單一分子組成的抗體分子制劑。單克隆抗體組合物表現(xiàn)出對特定表位（被抗原受體特異性識(shí)別的抗原部分）的特異性結(jié)合和親和性。

“人抗體”包括具有如下可變區(qū)的抗體，在該可變區(qū)中，框架區(qū)和CDR區(qū)都源自人種系免疫球蛋白序列。而且，如果該抗體含有恒定區(qū)，則恒定區(qū)也源自人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可包含并非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(如通過體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。但是，本文使用的術(shù)語“人抗體”不包括其中源自另一哺乳動(dòng)物種系（如小鼠種系）的CDR序列被移植到人構(gòu)架序列上的抗體。

“人單克隆抗體”是指表現(xiàn)單一結(jié)合特異性的抗體，其構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。

“重組人抗體”包括通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，例如：(1)從將人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動(dòng)物(如小鼠)或由該動(dòng)物制備的雜交瘤中分離的抗體；(2)從轉(zhuǎn)化表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞（如轉(zhuǎn)染瘤）中分離的抗體；(3)從重組組合人抗體文庫中分離的抗體；(4)通過將人免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任何其他方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這些重組人抗體具有構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。但是在某些實(shí)施方案中，這些重組人抗體可以經(jīng)歷體外誘變，或者當(dāng)使用人免疫球蛋白（Ig）序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)經(jīng)歷體內(nèi)體細(xì)胞誘變，因此重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列盡管是源自人種系VH和VL序列并與之相關(guān)的序列，但可能不是體內(nèi)天然存在于人抗體集合的所有組成成分中。

“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類型(如IgM或IgG1)。

“識(shí)別抗原的抗體”和“抗原特異性抗體”能夠與術(shù)語“與抗原、特異性結(jié)合的抗體”互換使用。

“人抗體衍生物”是指人抗體的任何修飾形式（如抗體和其它試劑或抗體的偶聯(lián)物）。

“人源化抗體”是指其中來源于另外一種哺乳動(dòng)物種系（如小鼠種系）的CDR序列被移植到人構(gòu)架序列上的抗體，在人構(gòu)架序列內(nèi)也可以進(jìn)行其它的構(gòu)架區(qū)修飾。

“嵌合抗體”是指其中可變區(qū)序列來源于一個(gè)物種而恒定區(qū)序列來源于另一個(gè)物種的抗體（如其中可變區(qū)序列來源于小鼠抗體而恒定區(qū)序列來源于人抗體的抗體）。

“與人PD-L1特異性結(jié)合”的抗體是指以1×10^-8摩爾（M）更低的K_D與人 PD-L1結(jié)合的抗體。

“ka”是指特定抗體-抗原相互作用的結(jié)合，“kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離，“K_D”是指解離常數(shù)，它是由kd與ka的比值獲得(即kd/ka)，用摩爾濃度(M)表示?？贵w的K_D值能用本領(lǐng)域建立的常規(guī)方法測定，測定抗體K_D的一種優(yōu)選方法為表面等離振子共振法，優(yōu)選使用生物傳感器系統(tǒng)。

IgG抗體的“高親和力”是指抗體對于靶抗原的 K_D為10^-8M或更低，但是對于其他抗體同種型來說，“高親和力”結(jié)合可能不同。

“調(diào)控序列”包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和控制抗體基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其他表達(dá)控制元件。

“受試者”包括任何人或非人類動(dòng)物，“非人類動(dòng)物”包括所有脊椎動(dòng)物（如非人靈長類動(dòng)物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類動(dòng)物、爬行類動(dòng)物等）。

“有效劑量”或“有效量”指可對受試者產(chǎn)生功能或活性的且可被受試者所接受的量。

“藥學(xué)上可接受的載體”是適用于受試者而無過度不良反應(yīng)（如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng)）的，即具有合理的效益風(fēng)險(xiǎn)比的載體。

現(xiàn)在結(jié)合以下附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明。

本發(fā)明提供了一種針對PD-L1的單克隆抗體或抗體片段，該抗體或抗體片段包含：重鏈和輕鏈，抗體片段為抗原與抗體結(jié)合的片段。重鏈和輕鏈包括可變區(qū)，所述的可變區(qū)包括互補(bǔ)決定區(qū)。

其中，重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3分別用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3分別用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示。HCDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO：3或保守修飾的SEQ ID NO：3，HCDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO：4或保守修飾的SEQ ID NO：4，HCDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO：5或保守修飾的SEQ ID NO：5，LCDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO：6或保守修飾的SEQ ID NO：6，LCDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO：7或保守修飾的SEQ ID NO：7，LCDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO：8或保守修飾的SEQ ID NO：8。

本發(fā)明還提供了針對PD-L1的單克隆抗體或抗體片段的制備方法，為了表達(dá)抗體或其抗體片段，可通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA，并將該DNA插入到表達(dá)載體中，使得該DNA與轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控序列有效連接。選擇與所用的表達(dá)宿主細(xì)胞相匹配的表達(dá)載體和表達(dá)調(diào)控序列，抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可被插入到分開的載體中，通過插入到已經(jīng)編碼期望的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，使得VH區(qū)段與載體中的CH區(qū)段有效連接，而VL區(qū)段與載體中的CL區(qū)段有效連接，可以利用本發(fā)明的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)產(chǎn)生任意抗體同種型的全長抗體基因。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)，包括調(diào)控序列的選擇，要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇，以及期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，主要取決于轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的調(diào)控序列優(yōu)選能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)的病毒元件，如來源于巨細(xì)胞病毒(CMV)、猴空泡病毒40（SV40）、腺病毒多瘤病毒的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子。

重組表達(dá)載體還可以編碼有利于宿主細(xì)胞分泌抗體鏈的信號(hào)肽，可將抗體鏈基因克隆到載體中，使得信號(hào)肽與該抗體鏈基因的氨基末端連接符合閱讀框，信號(hào)肽可以是免疫球蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽。

為了表達(dá)輕鏈和重鏈，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的各種形式包括常用于將外源DNA導(dǎo)入原核或真核宿主細(xì)胞中的各種技術(shù)，如電穿孔、磷酸鈣沉淀或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等。雖然，在理論上可以在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體或抗體片段，但是優(yōu)選在真核細(xì)胞中，最優(yōu)選在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)該抗體，因?yàn)檎婧思?xì)胞（尤其哺乳動(dòng)物細(xì)胞）比原核細(xì)胞更容易組裝和分泌正確折疊的具有免疫活性的抗體。據(jù)報(bào)道，原核細(xì)胞的表達(dá)抗體基因無法高產(chǎn)率地產(chǎn)生活性抗體。

用于表達(dá)本發(fā)明的抗體的優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括：中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、NSO骨髓瘤細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞（COS）和骨髓瘤細(xì)胞（SP2）。特別地，用于CHO骨髓瘤細(xì)胞的另一種優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)是公開的pFUSE表達(dá)系統(tǒng)，此系列表達(dá)載體是Invivogen公司推出一組抗體表達(dá)載體，可以用來表達(dá)各種全長的抗體或者抗體片段。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí)，通過將宿主細(xì)胞培養(yǎng)足以使抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)，或更優(yōu)選地，培養(yǎng)足以使抗體分泌到宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中而產(chǎn)生抗體。

本發(fā)明提供的抗體或抗體片段的制備方法具體如下：

首先，利用本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法，或在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中獲得本發(fā)明的抗體或抗體片段；

其次，在獲得本發(fā)明的單克隆抗體或抗體片段的DNA序列之后，通過基因合成的方式得到該單克隆抗體的重鏈可變區(qū)序列和輕鏈可變區(qū)序列；

然后，通過標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆技術(shù)將這兩段序列分別插入兩個(gè)pFUSE-IgG1抗體表達(dá)載體中，將得到的這兩個(gè)載體同時(shí)轉(zhuǎn)染到293F細(xì)胞中，懸浮培養(yǎng)；

最后，收集上清液，分離純化得到本發(fā)明的抗體或抗體片段。

本發(fā)明還提供了針對PD-L1的單克隆抗體或抗體片段的用途：

（1）作為制備免疫偶聯(lián)物或其組合物的用途

本發(fā)明的抗體或抗體片段能與諸如細(xì)胞毒劑、藥物(如免疫抑制劑) 或放射性毒素等治療劑偶聯(lián)得到偶聯(lián)物，這些偶聯(lián)物在此被稱為“免疫偶聯(lián)物”，包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞毒素的免疫偶聯(lián)物被稱作“免疫毒素”。

細(xì)胞毒劑包括對細(xì)胞有害（如殺傷細(xì)胞）的任何試劑，包括：紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙啶、吐根堿、絲裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、長春新堿、長春堿、秋水仙素、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、嘌呤霉素及其類似物或同系物。

治療劑還包括：抗代謝物(如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、氨烯咪胺（decarbazine）、5-氟尿嘧啶和羥基脲）、烷化劑（如氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀、洛莫司汀、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C和順鉑）、抗生素（如放線菌素D、博來霉素、光輝霉素、安曲霉素、柔紅菌素和阿霉素）及抗有絲分裂劑。

與本發(fā)明抗體或抗體片段偶聯(lián)的治療性細(xì)胞毒劑還包括：倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、阿里他?。ˋuristatin）及其衍生物。

可以利用本領(lǐng)域使用的連接體技術(shù)將細(xì)胞毒素或藥物與本發(fā)明的抗體偶聯(lián)，該連接體包括（但不限于）：腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的連接體，或者在溶酶體區(qū)室內(nèi)易被低pH切割或易被蛋白酶切割的連接體。其中，該蛋白酶是在腫瘤組織中優(yōu)先表達(dá)的蛋白酶，如組織蛋白酶(組織蛋白酶B、C、D)。

本發(fā)明的抗體或抗體片段也可以與放射性同位素偶聯(lián)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性放射性藥物，也被稱作“放射性免疫偶聯(lián)物”。該放射性同位素包括（但不限于）：碘131、銦111、釔90和镥177。制備放射性免疫偶聯(lián)物的方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立，能夠利用類似的方法使用本發(fā)明的抗體或抗體片段與放射性同位素制備放射性免疫偶聯(lián)物。

本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物可用于修飾特定的生物學(xué)反應(yīng)，且藥物部分不應(yīng)理解為局限于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白質(zhì)或多肽，包括（但不限于）：具有酶活性的毒素或其活性片段（如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素）、腫瘤壞死因子、干擾素-γ及生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)物。該生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)物包括（但不限于）：淋巴因子、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）及其他生長因子。

（2）作為制備抗腫瘤藥物或其組合物的用途

PD-L1在正常人細(xì)胞中不表達(dá)，在多種人類腫瘤組織細(xì)胞中高表達(dá)。PD-1與PD-L1的相互作用導(dǎo)致浸潤腫瘤的淋巴細(xì)胞減少，T細(xì)胞受體介導(dǎo)的增殖減少，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃脫。抑制PD-L1與PD-1的局部相互作用可以逆轉(zhuǎn)免疫抑制，當(dāng)PD-L2與PD-1的相互作用也被阻斷時(shí)，效應(yīng)是加合的。因此，PD-L1抗體對PD-L1的阻斷可以增強(qiáng)患者中對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

目前，骨髓移植可以用來治療血液腫瘤等疾病，移植物抗宿主病是這種治療的一種后果，但移植物對腫瘤細(xì)胞的應(yīng)答可以獲得治療性益處，通過利用阻斷PD-L1提高植入了腫瘤特異性T細(xì)胞的供體的有效性。

抗PD-L1抗體可以單獨(dú)使用，以抑制癌性腫瘤的和平共處，或者抗PD-L1抗體可以與其他免疫原性劑、標(biāo)準(zhǔn)癌癥治療或其他抗體聯(lián)合使用。

本發(fā)明的抗體或抗體片段制備的抗腫瘤藥物或其組合物可以治療或預(yù)防的腫瘤為一般對免疫治療有應(yīng)答的腫瘤。上述腫瘤包括（但不限于）：骨癌、皮膚癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰莖癌、睪丸癌、尿道癌、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、食道癌、小腸癌、直腸癌、肛區(qū)癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、腎癌、胃癌、胰腺癌、黑色素瘤、軟組織肉瘤、淋巴瘤、慢性或急性白血病、兒童實(shí)體瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、卡波西肉瘤中任意一種或兩種以上。

其中，黑色素瘤為皮膚或眼內(nèi)惡性黑色素瘤，皮膚癌為表皮狀癌或鱗狀細(xì)胞癌，淋巴瘤為霍奇金淋巴瘤、非何霍奇金淋巴瘤或淋巴細(xì)胞性淋巴瘤，淋巴細(xì)胞性淋巴瘤為T細(xì)胞淋巴瘤，慢性或急性白血病為急性髓細(xì)胞樣白血病、慢性髓細(xì)胞樣白血病、急性成淋巴細(xì)胞性白血病或慢性淋巴細(xì)胞性白血病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤為原發(fā)性CNS淋巴瘤、脊柱腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤。

上述腫瘤還包括：由環(huán)境誘發(fā)的腫瘤（如石棉誘發(fā)的腫瘤）以及轉(zhuǎn)移性癌，特別是表達(dá) PD-L1的轉(zhuǎn)移性癌。

優(yōu)選的，腫瘤包括：黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌中的任意一種或兩種以上。

本發(fā)明的PD-L1抗體還可以與雙特異性抗體聯(lián)合應(yīng)用，該雙特異性抗體可以將表達(dá)Fcα受體或Fcγ受體的效應(yīng)細(xì)胞靶向至腫瘤細(xì)胞，而且可以利用該雙特異性抗體靶向兩種不同的抗原。例如，利用抗Fc受體/抗腫瘤抗原(如Her-2/neu)的雙特異性抗體將巨噬細(xì)胞靶向腫瘤部位，這種靶向可以更有效地激活腫瘤特異性應(yīng)答。利用PD-L1阻斷可以加強(qiáng)這些應(yīng)答的T細(xì)胞，或者可以利用腫瘤抗原和樹突細(xì)胞特異性細(xì)胞表面標(biāo)記的雙特異性抗體結(jié)合將抗原直接遞送至樹突狀細(xì)胞（DC）。

腫瘤通過多種機(jī)制逃避宿主的免疫監(jiān)視，但可以通過滅活腫瘤表達(dá)的免疫抑制性蛋白質(zhì)來克服。每種個(gè)體的抗體可以與抗PD-L1聯(lián)用，來抵抗免疫抑制性蛋白質(zhì)的作用，并且有利于宿主的腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答。

本發(fā)明的抗體或抗體片段也可以與用于激活宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答的其他抗體聯(lián)用。其中，包括DC表面上的分子，這些分子激活DC功能和抗原呈遞；抗CD40抗體，其能夠有效地替代T細(xì)胞輔助活性；對T細(xì)胞共刺激分子（如TNFRSF4 的活化抗體），其能提高T細(xì)胞活化的水平；阻斷陰性共刺激分子（如細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（CTLA-4）、B和T淋巴細(xì)胞衰減蛋白抗體（BTLA））的活性的抗體。

（3）作為制備抗傳染病的藥物或其組合物的用途

本發(fā)明的抗體或抗體片段可以治療和預(yù)防由特定毒素或病原體引起的傳染病。類似于在上述腫瘤中的應(yīng)用，該抗體或抗體片段可以單獨(dú)使用，也可以作為佐劑或與疫苗組合使用，其能夠刺激淋巴細(xì)胞對病原體、毒素和自身抗原的免疫應(yīng)答。

該抗體或抗體片段特別應(yīng)用于目前沒有有效疫苗的病原體或常規(guī)疫苗不完全有效的病原體。病原體包括病毒、衣原體、立克次氏體、鉤端螺旋體、細(xì)菌、真菌和寄生蟲。

其中，病毒包括（但不限于）：HIV、肝炎病毒(甲、乙、丙)、流感病毒、皰疹病毒（如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、CMV和EB）、腺病毒、蟲媒病毒、?？刹《尽⒈遣《?、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、細(xì)小病毒、痘苗病毒、人類嗜T細(xì)胞病毒（HTLV）、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和蟲媒病毒腦炎病毒中的任意一種或兩種以上。

其中，細(xì)菌包括（但不限于）：分枝桿菌、葡萄球菌（如金黃色葡萄球菌）、鏈球菌（如肺炎鏈球菌）、奈瑟氏菌（如腦膜炎球菌和淋球菌）、克雷伯氏菌、變形菌、沙雷氏菌、假單胞菌（如綠膿桿菌）、軍團(tuán)桿菌、白喉?xiàng)U菌、沙門氏菌、芽孢桿菌（如炭疽桿菌）、霍亂菌、破傷風(fēng)菌、肉毒桿菌和鼠疫桿菌中的任意一種或兩種以上。

其中，真菌包括（但不限于）：假絲酵母（如白假絲酵母、克魯斯假絲酵母、光滑假絲酵母和熱帶假絲酵母）、新型隱球菌、曲霉屬（如煙曲霉和黑曲霉）、毛霉屬(如毛霉、犁頭霉和根霉)、申克孢子絲菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌和夾膜組織胞漿菌中的任意一種或兩種以上。

其中，寄生蟲包括（但不限于）：溶組織內(nèi)阿米巴、結(jié)腸小袋纖毛蟲、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴、利什曼原蟲、賈第蟲（如蘭伯賈第蟲）、隱孢子蟲、卡氏肺囊蟲、瘧原蟲（間日瘧原蟲）、果氏巴貝蟲、布氏錐蟲、克氏錐蟲、杜氏利什曼原蟲、鼠弓形體、巴西日圓線蟲。

該抗體或抗體片段尤其應(yīng)用于對抗由HIV引起的感染，在感染過程中HIV為逃逸免疫監(jiān)視呈現(xiàn)改變的抗原。本發(fā)明的抗體或抗體片段能夠阻斷PD-L1的信號(hào)途徑，使這些新的表位被作為外源物識(shí)別時(shí)不受PD-L1的負(fù)信號(hào)影響，從而增強(qiáng)T細(xì)胞的應(yīng)答。

此外，本發(fā)明的抗體或抗體片段可以與其他形式的免疫療法聯(lián)合，如細(xì)胞因子治療(如干擾素、GM-CSF、G-CSF或IL-2)和雙特異性抗體治療，雙特異性抗體治療能增強(qiáng)腫瘤抗原的呈遞。

（4）作為制備抗炎癥性疾病的藥物或其組合物的用途

本發(fā)明的抗體或抗體片段可以治療或預(yù)防慢性炎性疾病，如扁平苔蘚或T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎性皮膚粘膜病。扁平苔蘚表現(xiàn)出免疫功能低下，存在體液免疫紊亂，因此可以通過抗PD-L1抗體增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答治療。

（5）其它用途

機(jī)體會(huì)對腫瘤細(xì)胞或肽疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答，在此過程中會(huì)產(chǎn)生自身反應(yīng)性，抗PD-L1抗體可以增強(qiáng)自身免疫應(yīng)答，因此可以利用本發(fā)明的抗體或抗體片段聯(lián)合多種自身蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)接種方案，以有效地產(chǎn)生對抗這些自身蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答，用于治療與這些自身蛋白質(zhì)相關(guān)的疾病。例如，阿爾茨海默病涉及β-淀粉樣蛋白（Aβ）在腦中沉積，針對Aβ的抗體應(yīng)答能夠清除沉積的Aβ；用于治療變態(tài)反應(yīng)和哮喘的免疫球蛋白E（IgE），或用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。

本發(fā)明的抗體或抗體片段還能夠增強(qiáng)自身抗體對各種激素的應(yīng)答，如增強(qiáng)自身抗體對生殖激素的應(yīng)答可以用于避孕，增強(qiáng)抗體對其它激素或特定腫瘤生長所需的其他可溶性因子的應(yīng)答。

在制備上述“藥物或其組合物”中，“藥物”為包含有效劑量的抗體或抗體片段，或由抗體或抗體片段制備的免疫偶聯(lián)物，“組合物”為抗體或抗體片段、藥學(xué)上可接受的載體和治療劑組合，治療劑包括：疫苗、多特異性或雙特異性抗體，藥學(xué)上可接受的載體包括（但并不限于）：水、鹽水、葡萄糖、緩沖液、乙醇、甘油及其組合。在體內(nèi)或體外施用本發(fā)明的藥物或其組合物的適當(dāng)途徑在本領(lǐng)域中公知，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇，如注射(靜脈或皮下)給藥，使用的適宜劑量取決于受試者的年齡和體重以及抗體組合物的濃度和/或制劑。

本發(fā)明的抗體或抗體片段可以在體外或離體培養(yǎng)的細(xì)胞，或者在受試者體內(nèi)施用，從而增強(qiáng)或上調(diào)免疫應(yīng)答。優(yōu)選的，受試者為需要增強(qiáng)免疫應(yīng)答的人類患者，尤其適合通過增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答治療疾病的患者。為了實(shí)現(xiàn)自身免疫系統(tǒng)抗體的抗原特異性增強(qiáng)，抗PD-L1抗體可以與目標(biāo)抗原一起給藥。

本發(fā)明的抗體或抗體片段還可以與治療劑聯(lián)合用藥，抗體可以在治療劑之前、之后或同時(shí)給藥，或者可以與其他已知治療方法（如抗腫瘤治療中進(jìn)行的放射治療）共同應(yīng)用。抗腫瘤的細(xì)胞毒劑僅在對患者具有毒性或亞毒性的水平時(shí)有效。其中，順鉑以100mg/劑的劑量通過靜脈注射給藥，每4周1次，阿霉素以60-75mg/mL的劑量通過靜脈注射給藥，每21天1次。本發(fā)明的抗體或抗體片段與化療劑共同給藥，由于兩種不同藥物的作用機(jī)理不同，發(fā)揮功能的方式不一樣，因而此種給藥方式能夠解決耐藥性或腫瘤細(xì)胞抗原性改變(這將使它們對抗體沒有反應(yīng)性)引起的問題。

部分材料來源說明于此：

PD-L1蛋白：Human PD-L1/CD274（購自Acrobiosysterms，貨號(hào)為PD1-H82F3）。

全人單鏈抗體的噬菌體抗體庫：構(gòu)建方法見實(shí)驗(yàn)例1（為常州費(fèi)洛斯藥業(yè)科技有限公司構(gòu)建）。

鏈霉親和素磁珠：（購自Invitrogen公司）。

酶聯(lián)免疫微孔板：96半孔低透平底微孔板（購自Corning公司）。

Anti-M13 HRP抗體：（購自賽默飛公司）。

M13輔助噬菌體：（購自Invitrogen公司）。

SOC培養(yǎng)基：（購自上海生工）。

pCGMT噬菌粒載體：（購自Addgene公司）。

XL1-blue細(xì)菌：（購自安捷倫公司，貨號(hào)為200228）。

LB固體培養(yǎng)基平板：將5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g氯化鈉，10g瓊脂粉溶于1L的雙蒸水中，在121℃高溫下高壓滅菌，然后倒在平板上。

顯影液ABTS溶液：（購自賽默飛公司，貨號(hào)為002024）。

Gelred核酸染料：（購自賽默飛公司）。

pFUSE-IgG1表達(dá)載體：（購自 Invivogen公司）。

質(zhì)粒抽提試劑盒：（購自Qiagen公司）。

限制性內(nèi)切酶：（購自Takara公司）。

重組酶：（購自Novoprotein公司）。

293Fectin轉(zhuǎn)染試劑：（購自Invitrogen公司，貨號(hào)為12347500）。

293Freestyle懸浮細(xì)胞：（購自賽默飛公司）。

免疫球蛋白IgG1恒定區(qū)Fc段：（購自南京金斯瑞公司）。

BCA法蛋白定量試劑盒：（購自Pierce，貨號(hào)為23252）。

CBS抗原固定溶液：將1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃溶于1L水中，調(diào)整pH值為9.6。

Anti-Human Fc HRP二抗：（購自賽默飛公司）。

96孔底透板：（購自Corning公司）。

Biacore儀器：（購自GE公司，T200）。

Protein A芯片：（購自GE公司）。

CD4+正選擇試劑盒：（購自DynalBiotech）。

GM-CSF：（購自R&D Biosystems）。

單核細(xì)胞負(fù)選擇試劑盒：（購自MitenyiBiotech)。

Human IL-2 HTRF kit試劑盒：（購自Cisbio公司）。

AlphsLISA試劑盒：（購自PerkinElmer公司，貨號(hào)為AL356C）。

Envision^?多標(biāo)記微孔板檢測儀平臺(tái)：（購自PerkinElmer公司）。

Proxiplate^?微孔板：（購自PerkinElmer公司，貨號(hào)為6008280）。

實(shí)驗(yàn)例1 抗PD-L1抗體的篩選

1. 全人單鏈抗體的噬菌體抗體庫：設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，通過重疊延伸PCR的方式用Linker將重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接起來，得到全長的PCR產(chǎn)物，用SfiI酶切PCR產(chǎn)物和pCGMT噬菌粒載體，將連接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化入XL1-blue感受態(tài)細(xì)胞，然后向感受態(tài)細(xì)胞中加入3mL的SOC培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)1h后，加入終濃度為50μg/mL的氨芐青霉素，10μg/mL的四環(huán)素溶液20mL，37℃振蕩培養(yǎng)2h。然后加入濃度為10¹³/mL的VCSM13輔助噬菌體50uL，室溫孵育1h，中間每隔10min輕搖一次。37℃振蕩培養(yǎng)2h，再加入終濃度為70μg/mL的卡納霉素，30℃過夜培養(yǎng)。離心收集上清，加入濃度為10%的PEG-8000/氯化鈉溶液（PEG即聚乙二醇），置于冰浴1h，8000rpm，4℃離心，棄上清液，用2mL濃度為1%的BSA（牛血清白蛋白）的PBS溶液（磷酸緩沖液）充分溶解沉淀，離心收集上清液，即為全人單鏈抗體的噬菌體抗體庫。

2．抗體篩選

取表達(dá)全人單鏈抗體的噬菌體抗體庫200μL（含有噬菌體1×10¹²個(gè)/mL）與5μg PD-L1抗原混合，室溫孵育30 min后加入50μL的鏈霉親和素磁珠，與抗原結(jié)合的噬菌體被鏈霉親和素磁珠捕獲，未結(jié)合的噬菌體經(jīng)0.5% Tween-20的PBS溶液漂洗后被去除，用鹽酸甘氨酸（pH 2.2）溶液將與磁珠穩(wěn)定結(jié)合的噬菌體洗脫待用。

接種XL1-Blue細(xì)菌200mL，待OD（光密度）達(dá)到0.6后，加入上述洗脫的噬菌體，與XL1-Blue細(xì)菌在37℃靜置30min，菌液涂在氨芐青霉素抗性平板上，第二天洗脫收集氨芐抗性平板上的菌體，在侵染1×10¹²pfu/mL的VCSM13輔助噬菌體后，擴(kuò)增后進(jìn)行下一輪篩選，共進(jìn)行3輪篩選。

將侵染噬菌體的XL1-Blue菌液充分稀釋，然后將此菌液涂布于直徑為15cm抗性為氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，每個(gè)平板上有100-500個(gè)克隆，挑取單克隆抗體，通過噬菌體酶聯(lián)免疫反應(yīng)對淘選后的各輪噬菌體庫進(jìn)行驗(yàn)證。

3．噬菌體酶聯(lián)免疫反應(yīng)

將轉(zhuǎn)染噬菌體的XL1-Blue單克隆菌接種到2mL的96孔細(xì)菌培養(yǎng)板（購自Corning公司）中，加入500μL含有四環(huán)素抗性的SB培養(yǎng)基，200 rpm轉(zhuǎn)速下37℃搖床4-6 h，檢測OD₆₀₀（600nm波長處的吸光值）值接近0.6后，加入1μL的輔助噬菌體，在30℃下?lián)u床過夜，第二天3000g離心取上清待用。

取酶聯(lián)免疫微孔板，包被抗原4℃過夜，第三天，PBST洗脫之后封閉，然后加入上一步制備好的噬菌體上清，室溫孵育2h，PBST再加入Anti-M13 HRP抗體孵育30min，后用PBST洗3次，加入50μL顯影液ABTS。

4．實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖1所示，PD-L1抗原在全人抗體噬菌體展示庫中進(jìn)行篩選，經(jīng)過3輪篩選后，PD-L1抗原酶聯(lián)免疫反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度最高是對照抗原的100多倍，上述對照抗原為免疫球蛋白IgG1恒定區(qū)Fc段（human IgG1-Fc），表明經(jīng)過3輪篩選后能夠表達(dá)與PD-L1抗原特異性結(jié)合抗體的噬菌體不斷的被富集。從第3輪篩選后得到的噬菌體庫中挑取196個(gè)單克隆進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)驗(yàn)證，最后確定酶聯(lián)免疫反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度是對照抗原兩倍以上的單克隆作為陽性單克隆，對陽性單克隆進(jìn)行測序，獲得核苷酸編碼序列，將獲得的序列進(jìn)行比對分析，重復(fù)克隆越多，說明該抗體序列的親和力越強(qiáng)，以此確定有效富集的核苷酸編碼序列。

實(shí)驗(yàn)例2構(gòu)建抗PD-L1全長抗體的pFUSE-IgG1表達(dá)載體

將實(shí)驗(yàn)例1中篩選得到的噬菌體的核苷酸編碼序列為模板，設(shè)計(jì)PCR引物，分別擴(kuò)增本出重鏈可變區(qū)和人IgG1的恒定區(qū)，通過重疊延伸PCR法將重鏈可變區(qū)序列和人的IgG1區(qū)拼接起來，然后通過重組的方法將片段接入pFUSE表達(dá)載體（pFUSE表達(dá)載體通過限制性內(nèi)切酶BamH1和BglII作用于酶切位點(diǎn)）中，由此獲得本發(fā)明的全長抗體重鏈的pFUSE-IgG1表達(dá)載體。同樣，設(shè)計(jì)PCR引物，分別擴(kuò)增本發(fā)明單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)和人Lambda鏈（IgG1的輕鏈）的恒定區(qū)，通過重疊延伸PCR方法將這兩段拼接起來，將拼接的片段重組入pFUSE表達(dá)載體，由此獲得本發(fā)明的全長抗體輕鏈的pFUSE-IgG1表達(dá)載體。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

上述構(gòu)建的全長抗體重鏈的pFUSE-IgG1表達(dá)載體和本發(fā)明的全長抗體輕鏈的pFUSE-IgG1表達(dá)載體，其中重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO：1，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO：2。

實(shí)驗(yàn)例3 抗PD-L1全人源單克隆抗體的制備（表達(dá)和純化）

將293Fectin轉(zhuǎn)染試劑與上述獲得的真核抗體表達(dá)載體按照體積質(zhì)量比為30μL：30μg的比例混合，加入30μL的293Freestyle懸浮細(xì)胞，在125rpm轉(zhuǎn)速下37℃搖床過夜，離心后收集上清，采用HiTrap Protein A HP columns在?KTApurifier100蛋白純化儀上進(jìn)行抗體蛋白純化，最后參照BCA法蛋白定量試劑盒的說明書檢測抗體濃度。

實(shí)驗(yàn)例4 酶聯(lián)免疫反應(yīng)（ELISA）檢測抗PD-L1全人源單克隆抗體與人PD-L1的結(jié)合

96孔底透板的每個(gè)孔中均加入50μL 用CBS抗原固定溶液稀釋的人PD-L1，每個(gè)孔中加入抗原0.05μg，4℃過夜孵育。PBST漂洗三次，加入含牛奶濃度為5%的PBST封閉液，在37℃條件下封閉1h。PBST漂洗三次，加入實(shí)驗(yàn)例3獲得的抗PD-L1全人源單克隆抗體，在37℃條件下孵育1h，漂洗干燥后加入HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的Anti-Human Fc二抗，室溫震蕩孵育30min，用PBS漂洗3次，加入顯影底物ABST溶液，最后使用酶標(biāo)儀讀取數(shù)值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖2所示，橫坐標(biāo)為抗體識(shí)別PD-L1抗原的光吸收值，縱坐標(biāo)為同一抗體識(shí)別對照抗原IgG1-Fc的光吸收值，對照組（human IgG1-Fc）的酶聯(lián)免疫反應(yīng)的OD值在0.2以下，而陽性組（即抗PD-L1全人源單克隆抗體）的OD值在0.4以上，表明PD-L1抗體識(shí)別PD-L1而不識(shí)別human IgG1-Fc。

實(shí)驗(yàn)例5 檢測抗PD-L1全人源單克隆抗體的結(jié)合特異性和結(jié)合動(dòng)力學(xué)特征

采用多循環(huán)動(dòng)力學(xué)的方法檢測抗體與抗原親和力與動(dòng)力學(xué)特征，抗體固定采用捕獲法進(jìn)行，先將抗PD-L1全人源單克隆抗體偶聯(lián)在Protein A芯片上，然后將PD-L1樣品梯度稀釋后流過芯片表面，稀釋的起始濃度為40nM，稀釋倍數(shù)為2倍，共稀釋6個(gè)濃度點(diǎn)，PD-L1就會(huì)被已經(jīng)偶聯(lián)的抗PD-L1全人源單克隆抗體所捕獲，抗原與抗體結(jié)合后信號(hào)被檢測并記錄，最后用再生試劑（pH1.5的甘氨酸溶液）將Protein A芯片表面的抗體和抗原樣品全部洗脫，并進(jìn)行新一輪檢測。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖3所示，每一條線代表不同的PD-L1抗體濃度，PD-L1抗體濃度越高，結(jié)合的越快，信號(hào)越強(qiáng)，說明PD-L1抗體與PD-L1親和力好，在120秒后置換到PBS溶液中，將抗原與抗體解離，通過Biacore檢測證明抗PD-L1全人源單克隆抗體與PD-L1蛋白相互作用，本發(fā)明的抗PD-L1全人源單克隆抗體的K_D為5×10^-10。

實(shí)驗(yàn)例6 檢測抗PD-L1全人源單克隆抗體在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中對細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響

利用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)證明阻斷PD-L1/PD-1途徑對效應(yīng)淋巴細(xì)胞的影響，在存在或不存在抗PD-L1全人源單克隆抗體的情況下檢測該試驗(yàn)中IL-2的分泌。

使用CD4+正選擇試劑盒從PBMC（外周血單個(gè)核細(xì)胞）中純化人CD4+T 細(xì)胞，樹突細(xì)胞的來源為通過1000U/mL IL-4（白細(xì)胞介素-4）和500U/mL GM-CSF培養(yǎng)7天并純化的單核細(xì)胞（單核細(xì)胞用單核細(xì)胞負(fù)選擇試劑盒制備）。每種培養(yǎng)物在200μl總體積中含有10⁵個(gè)純化的人CD4+T細(xì)胞和10⁴個(gè)樹突細(xì)胞。抗PD-L1單克隆抗體以不同的抗體濃度加至每種培養(yǎng)物中。不加抗體或用不具有抗原識(shí)別能力的人源抗體Fc同種型對照抗體作為陰性對照。細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)5天，從每個(gè)培養(yǎng)中取出100μL培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞因子測定。IL-2含量用Human IL-2 HTRF kit試劑盒測定，抗PD-L1全人源單克隆抗體以濃度依賴的方式促進(jìn)IL-2分泌。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖4所示，隨著抗PD-L1全人源單克隆抗體濃度的增加，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測到的IL-2分泌也增加，說明該抗體可以識(shí)別PD-L1配體并阻斷其與PD1結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)T細(xì)胞激活分泌IL-2。

實(shí)驗(yàn)例7檢測抗PD-L1全人源單克隆抗體阻斷PD-L1配體與PD-1的結(jié)合

將待檢測的抗PD-L1全人源單克隆抗體以3倍稀釋倍數(shù)進(jìn)行濃度梯度稀釋，起始濃度點(diǎn)為5μg/μL，共計(jì)稀釋10個(gè)濃度點(diǎn)。檢測反應(yīng)體系分別為待檢樣品抗體蛋白或抑制劑5μL，生物素化PD-1 5μL，組氨酸標(biāo)簽（His-tag）PD-L1 5μL，鏈霉親和素供體珠和受體珠（SA-Donor beads and acceptor beads）混合物5μL，合計(jì)20μL。首先配制1X稀釋液，然后按照說明書將各個(gè)試劑用稀釋液配制，分別為4X組氨酸標(biāo)簽PD-L1(20nM)，4X生物素化PD-1(20nM)，4X抗-6X組氨酸AlphaLISA^?受體珠（Anti-6xHis AlphaLISA ^? Acceptor beads）(40 μg/mL) 和鏈霉親和素標(biāo)記的供體珠（Streptavidin Donor beads）(80 μg/mL)混合液。將上述四種液體按照20μL反應(yīng)體系混合到一起，室溫避光孵育90min，在Envision上讀取在615nm下的數(shù)值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

本發(fā)明抗PD-L1全人源單克隆抗體可以有效抑制PD-1蛋白與其配體PD-L1在體外的結(jié)合，并且這種抑制呈劑量依賴性，隨著抗PD-L1全人源單克隆抗體濃度的提高，PD-1與其配體D-L1的結(jié)合逐步受到抑制，檢測到的抑制常數(shù)IC₅₀為77.57 nmol/L。

綜上所述，本發(fā)明用于提供一種針對PD-L1的單克隆抗體或抗體片段，該抗體或抗體片段能夠高特異性的與人PD-L1結(jié)合，阻斷了PD-L1 與PD-1受體結(jié)合，刺激抗體應(yīng)答的能力，逆轉(zhuǎn)了調(diào)節(jié)T細(xì)胞的抑制狀態(tài)，增強(qiáng)免疫應(yīng)答。

盡管本發(fā)明的內(nèi)容已經(jīng)通過上述優(yōu)選實(shí)施例作了詳細(xì)介紹，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到上述的描述不應(yīng)被認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀了上述內(nèi)容后，對于本發(fā)明的多種修改和替代都將是顯而易見的。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)由所附的權(quán)利要求來限定。

<110> 常州費(fèi)洛斯藥業(yè)科技有限公司

<120> 一種針對PD-L1的單克隆抗體或抗體片段

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Val Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Pro Cys Thr Gly Thr Gly Ser Asn Val Gly Ala Gly

20 25 30

Phe Asp Leu His Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Leu Ser Gly Asn His Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Gly Ser Leu Val Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Arg

85 90 95

Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala

1 5

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Gly Ser Asn Val Gly Ala Gly Phe Asp

1 5

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Ser Gly Asn His

1

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Gln Ser Tyr Asp Thr Arg Leu Ser Gly Pro Val

1 5 10

<210> 9

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caggtacagc tggttcaatc gggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

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<210> 10

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

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