本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體的說，涉及一種黃鱔醛酮還原酶多克隆抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
：醛酮還原酶(Aldo-ketoreductase，AKR)廣泛存在于生物界，是一類依賴于NAD(P)H的分子量在34kDa-37kDa之間的單體還原酶蛋白。現(xiàn)報(bào)道的AKR超家族成員有16個(gè)亞家族共190多個(gè)成員，包括醛糖還原酶、酮還原酶、羥化類固醇脫氫酶、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸還原酶、多元醇脫氫酶、二氫二醇脫氫酶等多種能夠代謝機(jī)體羰基化合物的酶類。在結(jié)構(gòu)上，AKR超家族都包含一個(gè)(α/β)8的桶狀結(jié)構(gòu)、相似的輔酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)高度保守的Asp，Tyr，Lys，His催化四分體。在功能上，AKR不僅在生物體應(yīng)對(duì)外源性或內(nèi)源性羰基化合物解毒過程中具有重要作用，還參與了生物體內(nèi)氧化應(yīng)激、致癌化合物的降解、糖尿病并發(fā)癥及腫瘤發(fā)生等過程。通過輔酶NAD(P)H提供還原力，AKR可以將醛酮類化合物通過加氫的方式還原成相對(duì)應(yīng)的醇類化合物，從而降低毒害作用。其底物包括脂肪類醛酮化合物、芳香類化合物、醛糖、兒茶酚胺、甾類、視黃醛、前列腺素、黃曲霉素等。研究發(fā)現(xiàn)，AKR除了參與機(jī)體的疾病發(fā)生過程，還作為重要的防御酶存在。AKR抑制劑在癌癥及糖尿病并發(fā)癥臨床治療等方面具有重要的意義，目前已成為研究的熱點(diǎn)。相比哺乳動(dòng)物，對(duì)于魚類AKR的研究報(bào)道較少。國(guó)外有學(xué)者研究了苯并芘(BaP)處理羅非魚后其肝組織AKR1A1基因的表達(dá)情況，認(rèn)為羅非魚的AKR1A1可能在BaP解毒過程中具有重要的作用。除此之外，其它魚類的AKR基因及其功能的研究國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道。從黃鱔(Monopterusalbus)中克隆到醛酮還原酶(Eakr)基因，對(duì)其進(jìn)行體外表達(dá)、多克隆抗體制備及抗體檢測(cè)的研究，對(duì)于進(jìn)一步探索魚類醛酮還原酶基因的功能具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，有必要提供一種能制備出大量高質(zhì)量的抗黃鱔Eakr的多克隆抗體的黃鱔Eakr多克隆抗體的制備方法。一種黃鱔Eakr多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：步驟(1)黃鱔Eakr基因的克?。喊凑誘rizol試劑說明書提取黃鱔總RNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，于-80℃保存；根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的AKR基因序列，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得黃鱔Eakr基因cDNA片段；根據(jù)SmartRACE試劑盒說明書，進(jìn)行5’RACE-PCR和3’RACE-PCR擴(kuò)增，獲得黃鱔Eakr基因cDNA片段的5’末端和3’末端，拼接獲得其全長(zhǎng)cDNA序列；黃鱔Eakr基因的核苷酸和氨基酸序列分別如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；步驟(2)黃鱔Eakr基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)黃鱔Eakr基因全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物re-ex-F(5’-GCCGAATTCATGCCTGTGGTTCCCAAAG-3’)和re-ex-R(5’-CCGAAGCTTTTAGCTCCTGTACTCATCGC-3’)，分別在上、下游引物添加了EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)；以黃鱔cDNA為模板，re-ex-F和re-ex-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，回收純化，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得重組表達(dá)載體pET-Eakr；步驟(3)黃鱔Eakr重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化：將步驟(2)得到的重組表達(dá)載體pET-Eakr轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在含有50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至OD值為0.6時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)3h。離心收集菌體，超聲破碎，然后加入5×上樣緩沖液進(jìn)行12％SDS-PAGE電泳檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況；以1％的接種量將能表達(dá)重組蛋白的BL21添加到含有50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，大量培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)；將誘導(dǎo)好的菌液離心，收集菌體超聲波破碎，再離心收集沉淀；將沉淀用平衡緩沖液溶解，收集上清，上樣、結(jié)合、洗脫、透析，獲得純化的黃鱔Eakr重組蛋白；SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化后的黃鱔Eakr重組蛋白；步驟(4)多克隆抗體的制備及Westernblot分析：將步驟(3)純化的黃鱔pET-Eakr重組蛋白作為抗原，對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行8次免疫，按體積比1︰1的比例加入弗氏完全佐劑，采用背部皮下多點(diǎn)注射，免疫劑量為0.2mg；加強(qiáng)免疫選用弗氏不完全佐劑；末次免疫10天后，進(jìn)行全血分離，免疫血清儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆谩Ｌ崛〗?jīng)IPTG誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的pET-Eakr重組菌的融合蛋白進(jìn)行Westernblot，檢測(cè)抗體的特異性；為進(jìn)一步分析黃鱔pET-Eakr多克隆抗體的特異性，利用動(dòng)物組織總蛋白提取試劑盒提取黃鱔肝胰組織、小腸、肌肉和脾臟4種組織的總蛋白；取50μg各組織總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上。用制備的抗血清進(jìn)行1：500倍稀釋后作為一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行多抗的特異性檢測(cè)；步驟(5)免疫組化分析：采用石蠟包埋法包埋黃鱔的小腸、肝胰組織和脾臟,以6μm厚度進(jìn)行切片；常規(guī)脫蠟后，用50μL的H2O2(3％)于37℃孵育10min，阻斷內(nèi)源過氧化物酶；將切片放入檸檬酸鹽緩沖液中并加熱至沸騰，20min后自然冷卻；用10％山羊血清進(jìn)行封閉后加入500倍稀釋的兔抗Eakr抗血清37℃溫育2h，用TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育30min，DAB顯色；蘇木精復(fù)染、脫水透明及樹膠封片。陰性對(duì)照以陰性血清代替一抗；步驟(6)其他魚類Eakr同源蛋白的Westernblot分析：采用動(dòng)物組織總蛋白提取試劑盒提取草魚、黃顙、團(tuán)頭魴、烏鱧和鯽魚肝臟總蛋白，將50μg不同種魚來源的肝臟總蛋白進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜；用自制的兔抗Eakr血清進(jìn)行1：500倍稀釋后作為一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，Westernblot檢測(cè)其他魚類是否存在Eakr同源蛋白；步驟(7)多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定：以純化的重組蛋白為包被抗原，以第一次免疫前采集的兔血清為陰性對(duì)照，將兔抗Eakr抗體進(jìn)行1：200至1：25600倍比稀釋，以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，以TMB為底物顯色液，進(jìn)行間接ELISA分析；以兔抗Eakr抗體OD450nm值與陰性對(duì)照血清OD450nm值的比值≥2時(shí)為陽(yáng)性作為判定標(biāo)準(zhǔn)，制備的兔抗Eakr抗體最大稀釋度作為該抗體的有效效價(jià)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益效果：1)本發(fā)明采用分子生物學(xué)和基因工程的方法，構(gòu)建了黃鱔Eakr基因的重組表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析獲得純化的重組表達(dá)蛋白。2)本發(fā)明的方法制備的黃鱔Eakr多克隆抗體具有很強(qiáng)的特異性，可用于免疫組化、免疫印跡等實(shí)驗(yàn)要求，建立體外免疫分析，為深入研究黃鱔Eakr的功能提供一個(gè)重要工具。3)本發(fā)明制備的黃鱔Eakr多克隆抗體，可用于黃鱔免疫熒光染色激光共聚焦顯微觀察。4)本發(fā)明制備的黃鱔Eakr多克隆抗體，還可用于其他魚類Eakr的免疫檢測(cè)。附圖說明圖1為黃鱔Eakr基因小量表達(dá)和純化重組蛋白SDS-PAGE電泳圖；圖2為黃鱔Eakr重組蛋白的Westernblot檢測(cè)圖；圖3為以兔抗黃鱔Eakr血清為一抗的黃鱔各組織蛋白的Westernblot檢測(cè)圖；圖4為黃鱔小腸，肝胰組織與脾臟的抗血清免疫組化分析對(duì)比組圖；圖5為部分其他魚類醛酮還原酶同源蛋白的Westernblot檢測(cè)圖；圖6為兔抗黃鱔Eakr血清的效價(jià)測(cè)定結(jié)果示意圖。具體實(shí)施方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明實(shí)施方式提供一種黃鱔Eakr多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：步驟1黃鱔Eakr基因的克?。喊凑誘rizol試劑說明書提取黃鱔總RNA，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，cDNA第一鏈的合成根據(jù)SmartRACE試劑盒說明書進(jìn)行，于﹣80℃低溫保存。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已報(bào)道的AKR基因序列進(jìn)行同源比對(duì)，設(shè)計(jì)特異性引物AKR-F(5’-ACATCCAGACCAGCGACCTGCA-3’)和引物oligod(T)(5’-TGCCGAATCTTTTTTTTTTTTTAGC-3’)。以黃鱔cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得黃鱔Eakr基因cDNA片段；特異性引物AKR-F與oligod(T)的核苷酸序列分別如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示。PCR反應(yīng)體系(25μL)PCR反應(yīng)程序：根據(jù)所得黃鱔Eakr基因cDNA片段設(shè)計(jì)特異性引物AKR-GSP5(5’-GTATCTCTTGTCGCTATAGTCCCACCAGTG-3’)和AKR-GSP3(5’-TGTGGGCTGCAGGCTAGGTGTCGC-3’)，特異性引物AKR-GSP5與AKR-GSP3的核苷酸序列分別如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示。按照SmartRACE試劑盒說明書進(jìn)行5’RACE和3’RACE擴(kuò)增，獲得黃鱔Eakr基因cDNA片段的5’末端和3’末端。將黃鱔Eakr基因的5’末端和3’末端進(jìn)行拼接，獲得其cDNA全長(zhǎng)序列。黃鱔Eakr基因的核苷酸和氨基酸序列分別如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。5’RACE-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為(50μL)：組成體積(μL)PCR-gradewater3510×BDAdvantagebuffer2PCRbuffer5dNTPMix(10mM)1μPM5GSP15’-RACE-ReadycDNA2150×BDAdvantage2PolymeraseMix13’RACE-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為(50μL)：組成體積(μL)PCR-gradewater3510×BDAdvantagebuffer2PCRbuffer5dNTPMix(10mM)1μPM5GSP13’-RACE-ReadycDNA2150×BDAdvantage2PolymeraseMix1反應(yīng)條件為：步驟2黃鱔Eakr基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)黃鱔Eakr基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物re-ex-F(5’-GCCGAATTCATGCCTGTGGTTCCCAAAG-3’)和re-ex-R(5’-CCGAAGCTTTTAGCTCCTGTACTCATCGC-3’)，分別在上、下游引物添加了EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)。以黃鱔cDNA為模板，采用引物re-ex-F和re-ex-R擴(kuò)增黃鱔Eakr基因的成熟肽片段。特異性引物re-ex-F與re-ex-R的核苷酸序列分別如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示。PCR反應(yīng)體系(25μL)：反應(yīng)條件為：將PCR產(chǎn)物與重組表達(dá)載體pET-28a同時(shí)進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切，分別用DNA凝膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物，經(jīng)T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有卡那霉素(50μg/mL)的平板上進(jìn)行抗性篩選。挑取陽(yáng)性克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，37℃、220r/m，培養(yǎng)8h后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，采用質(zhì)粒PCR和雙酶切的方法驗(yàn)證重組質(zhì)粒。已成功構(gòu)建重組表達(dá)載體，命名為pET-Eakr。步驟3黃鱔Eakr重組蛋白的表達(dá)和純化：黃鱔Eakr重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：取1ng重組表達(dá)載體pET-Eakr轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布于含50μg/mL的卡那霉素平板上進(jìn)行抗性篩選，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為過夜培養(yǎng)。篩選結(jié)束后轉(zhuǎn)至LB培養(yǎng)基(含卡那霉素50μg/mL)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，200r/min。菌體進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后加添加IPTG至終濃度0.1mmol/L，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時(shí)后離心收集菌體沉淀，超聲波破碎，加入5×上樣緩沖液進(jìn)行12％常規(guī)SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況，重組蛋白分子量為37.7kDa。黃鱔Eakr重組蛋白的純化：將上述經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的菌液按照1：100的比例接種到500mLLB培養(yǎng)基(含卡那霉素50μg/mL)中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，200r/min培養(yǎng)時(shí)間為過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體沉淀，用50mmol/L的PBS(pH8.0)懸浮菌液，進(jìn)行超聲波破碎并收集沉淀部分，用裂解緩沖液(6mol/L鹽酸胍，10mmol/L咪唑，50mmol/LPBSpH＝8.0)洗滌3次。加入適量裂解緩沖液溶解，對(duì)上清液進(jìn)行過濾；濾液用1mL的親和層析鎳柱His-Binding-Resin進(jìn)行純化；純化后的蛋白用不同濃度的鹽酸胍緩沖液進(jìn)行透析復(fù)性，鹽酸胍緩沖液濃度為6、3、1.5、0.5、0.1mol/L，用透析袋濃縮透析液；將收集到的黃鱔Eakr蛋白用BCA法測(cè)蛋白濃度，并用常規(guī)SDS-PAGE法，檢測(cè)重組蛋白的條帶大小，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，黃鱔Eakr重組蛋白為單一條帶，分子量為37.7kDa，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；CK1為陰性對(duì)照；CK2為陽(yáng)性對(duì)照；1為重組質(zhì)粒pET-Eakr小量誘導(dǎo)產(chǎn)物；2為純化的Eakr重組蛋白。步驟4黃鱔Eakr重組蛋白多克隆抗體的制備：將純化的黃鱔Eakr重組蛋白和等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行充分乳化；用背部皮下多點(diǎn)注射法，按0.2mg的免疫量對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，采集保存第一次免疫前新西蘭大白兔的血清。用經(jīng)弗氏不完全佐劑充分乳化的抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每次間隔7天，共注射8次。末次免疫10天后，進(jìn)行全血分離，收集兔抗黃鱔Eakr血清，加入30％甘油，于-20℃分裝保存。將含有空白質(zhì)粒的菌株總蛋白(陰性對(duì)照)、陽(yáng)性菌株總蛋白(陽(yáng)性對(duì)照)和純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上。分別用武漢博士德生物有限公司制備的anti-His(1：2000倍稀釋)及自制的兔抗血清1：500倍稀釋后作為一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行多抗的特異性檢測(cè)。以第一次免疫前采集的兔血清為陰性對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，自制的兔抗Eakr抗血清也可以特異性地和純化的蛋白產(chǎn)生一條特異條帶；在和重組菌總蛋白反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生了一條分子量較小的條帶，可能是過量表達(dá)的雜蛋白產(chǎn)生的非特異性反應(yīng)導(dǎo)致；其中1為重組大腸桿菌BL21(DE3)總蛋白；2為純化的黃鱔Eakr重組蛋白；a為商品anti-His作為一抗；b為用自制的兔抗Eakr血清作為一抗。為進(jìn)一步分析自制的抗血清的特異性，利用動(dòng)物組織總蛋白提取試劑盒提取黃鱔肝胰組織、小腸、肌肉和脾臟4種組織的總蛋白。提取方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。總蛋白提取后取50μg各組織總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上。用制備的抗血清進(jìn)行1：500倍稀釋后作為一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行多抗的特異性檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，來源于肝胰組織、小腸、肌肉和脾臟的總蛋白都可以和自制的兔抗Eakr血清產(chǎn)生特異性的反應(yīng)，而且四種組織里帶型和分子量大小均一致，為37.7kDa。步驟5黃鱔Eakr蛋白的免疫組化分析：采用石蠟包埋法包埋黃鱔的小腸、肝胰組織和脾臟，以6μm厚度進(jìn)行切片。常規(guī)脫蠟后，用50μL的H2O2(3％)于37℃孵育10min，阻斷內(nèi)源過氧化物酶。將切片放入檸檬酸鹽緩沖液中并加熱至沸騰，20min后自然冷卻。用10％山羊血清進(jìn)行封閉后加入500倍稀釋的兔抗黃鱔Eakr血清37℃溫育2h，用TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育30min，DAB顯色。蘇木精復(fù)染、脫水透明及樹膠封片。陰性對(duì)照以實(shí)施例3中，多克隆抗體的制備步驟中的第一次免疫前新西蘭大白兔的血清代替一抗。分析結(jié)果如圖4所示，由免疫組化分析結(jié)果可知，黃鱔Eakr蛋白在黃鱔小腸中的整體分布較為分散，且在腸道內(nèi)壁突出的絨毛根部分布相對(duì)較多，在肝胰組織和脾臟中分布較為集中，主要在肝胰組織和脾臟中的部分細(xì)胞中表達(dá)；其中圖a、c、e為陰性對(duì)照效果圖；b、d、f為經(jīng)過兔抗黃鱔Eakr血清處理的效果圖。而陰性對(duì)照未檢出醛酮還原酶蛋白的表達(dá)。步驟6其他魚類Eakr同源蛋白的Westernblot分析：為驗(yàn)證部分其他魚類體內(nèi)是否存在醛酮還原酶同源蛋白，進(jìn)行了Eakr同源蛋白的Westernblot分析。具體過程如下：用動(dòng)物組織總蛋白提取試劑盒提取草魚、黃顙、團(tuán)頭魴、烏鱧和鯽魚肝臟總蛋白，各取50μg所提取的蛋白進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE純化分離并轉(zhuǎn)膜。以兔抗黃鱔Eakr血清進(jìn)行1：500倍稀釋后作為一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，觀察其是否有特異性反應(yīng)。檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，所檢測(cè)的5種淡水魚的肝臟組織總蛋白都可以特異性的和制備的多抗產(chǎn)生反應(yīng)，且5種魚的醛酮還原酶同源蛋白分子量比較一致，分子量大小為37.7kDa，說明魚類的醛酮還原酶存在于不同物種；其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為草魚；2為黃顙；3為團(tuán)頭魴；4為烏鱧；5為鯽魚。步驟7多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定：為了對(duì)所獲得的多克隆抗體的效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，具體過程如下：以實(shí)施例4中，多克隆抗體的制備步驟中的第一次免疫前新西蘭大白兔的血清為陰性對(duì)照，以最后一次免疫后收集的兔抗黃鱔Eakr血清在1：200至1：25600倍之間稀釋作為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，以TMB作為顯色液，以兔抗黃鱔Eakr血清樣品OD450nm值與陰性對(duì)照血清OD450nm值的比值≥2時(shí)為陽(yáng)性作為判定標(biāo)準(zhǔn)，以制備的兔抗黃鱔Eakr血清最大稀釋度作為該抗體的有效效價(jià)。檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，陽(yáng)性血清的最高稀釋度為1：12800，有效效價(jià)達(dá)到1：6400；其中縱坐標(biāo)為OD450nm吸光值，橫坐標(biāo)為兔抗Eakr血清的稀釋倍數(shù)范圍值；比較對(duì)象為陰性血清與兔抗血清。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益效果：1)本發(fā)明采用分子生物學(xué)和基因工程的方法，構(gòu)建了黃鱔Eakr基因的重組表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析獲得純化的重組表達(dá)蛋白。2)本發(fā)明的方法制備的黃鱔Eakr多克隆抗體具有很強(qiáng)的特異性，可用于免疫組化、免疫印跡等實(shí)驗(yàn)要求，建立體外免疫分析，為深入研究黃鱔Eakr的功能提供一個(gè)重要工具。3)本發(fā)明制備的黃鱔Eakr多克隆抗體，可用于黃鱔免疫熒光染色激光共聚焦顯微觀察。4)本發(fā)明制備的黃鱔Eakr多克隆抗體，還可用于其他魚類Eakr的免疫檢測(cè)。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。<110>長(zhǎng)江大學(xué)<120>一種黃鱔醛酮還原酶多克隆抗體的制備方法<160>8<210>1<211>1320<212>DNA13>黃鱔（Monopterusalbus）<400>1acgttagtctgctgctgttggttcgagcacagcttgtaaggaggacaaacttctttccca60gcccttgtagcaggatgcctgtggttcccaaagtgacactgcctgggggtctggagatct120gtcgggtcctgaatgggatgtggcaggtgtctggtaagcacggggcagtggatcgagcca180aagcagttgaggccatgcaggcctatgtagatgctggtctgaccacattcgacatggcag240acatttatgggcctgcagaggaaatatttgggcagttcaacagcaagctgaagtcctctg300gagatgctgcaccagctgtgcagagtctgaccaaatacgttccacaaccaggaccaatgg360accgcaaggtggtggagaaggcaatacagctctccatgactcggatgcaggtggacagtc420tggactgtgttcagtttcactggtgggactatagcgacaagagatacctggaggcactgg480gacacctgtttgatatgcaacaggagggactcatacgtgagctttccctcactaacttcg540acacacagagactggaggagatcagcaacagaggcatccgcatttccagcaaccaggttc600agtactctgtgattgaccagcgacctgcagtgaagatggaacagttctgtctggccaatg660acatccagctcctcacttatggcactctggctggcggtctgctcacagagcgctatctgg720gcaaggcggagccaaactccaaggcggagctctatactgcctccctctcaagctacaaga780agatgatcgacacttggggtggctggagccttttccaggacctacttgttactttggagg840ctgttgccaggagacacaactgccccatggcctgtgtcgcaacgcgttacgtgctggacc900gccctgcagtgggcggggtcattgtgggctgcaggctaggtgtcgcaaatgcggggcagc960acatcggtgacagtctgcatagctgcagccctgacctgcggttgacagcggaggatctcg1020ctgctatcaaagctgtgacacagcgctccagggacctcatggtgtggattggggactgcg1080gcgatgagtacaggagctaaaggcagaaggggtgaggaatagaggcagagtaaagggaaa1140catgcagcagtcacacatgcaacagaataaaatgcagctgctgctgaaaatcatttcaat1200cctccatttcatttttaattgaatcaaattagtttttgcataaagtctgtagctgttcct1260ctgttacacactataaagaaccaacagcaaattgtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1320<210>2<211>341<212>PRT<213>黃鱔（Monopterusalbus）<400>2MetProValValProLysValThrLeuProGlyGlyLeuGluIleCys151015ArgValLeuAsnGlyMetTrpGlnValSerGlyLysHisGlyAlaVal202530AspArgAlaLysAlaValGluAlaMetGlnAlaTyrValAspAlaGly354045LeuThrThrPheAspMetAlaAspIleTyrGlyProAlaGluGluIle505560PheGlyGlnPheAsnSerLysLeuLysSerSerGlyAspAlaAlaPro65707580AlaValGlnSerLeuThrLysTyrValProGlnProGlyProMetAsp859095ArgLysValValGluLysAlaIleGlnLeuSerMetThrArgMetGln100105110ValAspSerLeuAspCysValGlnPheHisTrpTrpAspTyrSerAsp115120125LysArgTyrLeuGluAlaLeuGlyHisLeuPheAspMetGlnGlnGlu130135140GlyLeuIleArgGluLeuSerLeuThrAsnPheAspThrGlnArgLeu145150155160GluGluIleSerAsnArgGlyIleArgIleSerSerAsnGlnValGln165170175TyrSerValIleAspGlnArgProAlaValLysMetGluGlnPheCys180185190LeuAlaAsnAspIleGlnLeuLeuThrTyrGlyThrLeuAlaGlyGly195200205LeuLeuThrGluArgTyrLeuGlyLysAlaGluProAsnSerLysAla210215220GluLeuTyrThrAlaSerLeuSerSerTyrLysLysMetIleAspThr225230235240TrpGlyGlyTrpSerLeuPheGlnAspLeuLeuValThrLeuGluAla245250255ValAlaArgArgHisAsnCysProMetAlaCysValAlaThrArgTyr260265270ValLeuAspArgProAlaValGlyGlyValIleValGlyCysArgLeu275280285GlyValAlaAsnAlaGlyGlnHisIleGlyAspSerLeuHisSerCys290295300SerProAspLeuArgLeuThrAlaGluAspLeuAlaAlaIleLysAla305310315320ValThrGlnArgSerArgAspLeuMetValTrpIleGlyAspCysGly325330335AspGluTyrArgSer340<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3acatccagaccagcgacctgca22<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>4tgccgaatctttttttttttttagc25<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>5gtatctcttgtcgctatagtcccaccagtg30<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>6tgtgggctgcaggctaggtgtcgc24<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>7gccgaattcatgcctgtggttcccaaag28<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>8ccgaagcttttagctcctgtactcatcgc29當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3