1.一種檢測豬臍帶血豬瘟病毒的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒,其特征在于,包括擴(kuò)增引物和特異性熒光探針,所述擴(kuò)增引物和特異性熒光探針的序列如下所示:
上游擴(kuò)增引物:5’-ATGCCCATAGTAGGACTA-3’,其為SEQ ID NO:1序列;
下游擴(kuò)增引物:5’-CTAGGGTTAAGGTGTGTC-3’,其為SEQ ID NO:2序列;
特異性熒光探針:FAM-5’-CCTCGTCCACATAGCATCTCG-3’-TAMARA,其為SEQ ID NO:3序列,其中,F(xiàn)AM為熒光報(bào)告基因,TAMARA為熒光淬滅基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬臍帶血豬瘟病毒的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒,其特征在于,所述上游擴(kuò)增引物、所述下游擴(kuò)增引物和所述特異性熒光探針的摩爾比為3:3:2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測豬臍帶血豬瘟病毒的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒,其特征在于,所述上游擴(kuò)增引物、所述下游擴(kuò)增引物和所述特異性熒光探針在所述試劑盒中的終濃度均為0.3~0.5μM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬臍帶血豬瘟病毒的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒,其特征在于,所述試劑盒還包括陰性對照、陽性對照、2×熒光定量Mixture。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測豬臍帶血豬瘟病毒的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒,其特征在于,所述陰性對照為無DNA酶的ddH2O;所述陽性對照為含有豬瘟病毒多聚蛋白ORF基因序列的克隆質(zhì)粒pEASY-T1-CSFV-ORF,克隆質(zhì)粒pEASY-T1-CSFV-ORF的終濃度為1.0×105copies/μl~1.0×107copies/μl。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測豬臍帶血豬瘟病毒的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒,其特征在于,所述豬瘟病毒多聚蛋白ORF基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測豬臍帶血豬瘟病毒的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒,其特征在于,所述克隆質(zhì)粒采用以下方法制備得到:利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列擴(kuò)增豬瘟病毒多聚蛋白ORF基因序列,豬瘟病毒多聚蛋白ORF基因序列酶切后與pEASY-T1載體連接,篩選陽性克隆,測序正確的克隆質(zhì)粒命名為pEASY-T1-CSFV-ORF。
8.一種如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的檢測豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的使用方法,其特征在于,包括以下步驟:
(1)使用權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系以20μL計(jì)為:
0.3μM的SEQ ID NO:1所示的上游擴(kuò)增引物:0.6μL;
0.3μM的SEQ ID NO:2所示的下游擴(kuò)增引物:0.6μL;
0.4μM的SEQ ID NO:3所示的特異性熒光探針:0.4μL;
2×熒光定量Mixture:10μL;
RNA模板:2μL;
ddH2O:補(bǔ)足至20μL;
PCR的反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5min;94℃變性15Sec,58℃退火45Sec,62℃延伸2sec,收集熒光,共40個(gè)循環(huán);然后25℃延伸10sec,最后4℃保護(hù),結(jié)束反應(yīng);
(2)結(jié)果分析:
根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定:陰性對照擴(kuò)增無Ct值,陽性對照擴(kuò)增Ct值≤30時(shí),則結(jié)果判定成立;Ct值≤35,則判斷為豬瘟病毒陽性;35<Ct值≤40為可疑,進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn),若重復(fù)檢測結(jié)果仍為35<Ct值≤40,則判斷為豬瘟病毒陰性;無Ct值顯示,則判斷為豬瘟病毒陰性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測豬臍帶血中豬瘟病毒的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的使用方法,其特征在于,所述RNA模板采用以下方法制備得到:
(1)取50-100mg豬臍帶血置1.5ml勻漿器中,加入1ml裂解液充分勻漿,室溫靜置5min;
所述裂解液的成分及配比如下:①鹽酸胍4-6M;②十二烷基磺酸鈉SDS0.1-0.2%;③吐溫20 1-2%;④乙基苯基聚乙二醇NP40 1-2%;
(2)加入0.6ml異丙醇和10μL磁珠,振蕩15s,靜置2min;
(3)將EP管放入磁力架吸附1-2min,棄掉液體;
(4)加入0.5ml異丙醇,將EP管中液體輕輕混勻,室溫靜置10min;
(5)將EP管放入磁力架吸附1-2min,棄掉液體;
(6)加入1ml質(zhì)量百分比濃度為70%的乙醇溶液,輕輕洗滌沉淀;將EP管放入磁力架吸附1-2min,棄掉液體;
(7)晾干,加入適量的DEPC H2O溶解,56℃促溶10~15min;
(8)快速電泳檢測RNA完整性。
10.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的試劑盒在制備檢測豬臍帶血豬瘟病毒的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR試劑中的用途。