本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，主要涉及一種寨卡病毒(ZIKV)特異性檢測(cè)靶序列、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其核酸檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

寨卡病毒(Zika Virus,ZIKV)是一種通過(guò)蚊蟲(chóng)傳播的蚊媒病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬，1947年首次在烏干達(dá)恒河猴中分離出。寨卡病毒感染人類(lèi)引起的臨床表現(xiàn)不特異如低熱，皮疹，結(jié)膜炎，關(guān)節(jié)痛等。在之后的60年里，只在亞洲和非洲部分地區(qū)有散在的人類(lèi)感染寨卡病毒的報(bào)告。2007年，寨卡病毒首次在亞洲和非洲之外的地區(qū)出現(xiàn)并且在西太平洋雅浦島引起流行，隨后迅速擴(kuò)散至太平洋其他國(guó)家。2015年，巴西確認(rèn)第一例本土寨卡病毒病例，并且確認(rèn)病毒在多個(gè)地區(qū)形成流行，同時(shí)，在巴西東北部伴隨有嬰兒小頭畸形發(fā)病率的提高。流行病調(diào)查顯示，嬰兒小頭畸形的發(fā)生與孕婦感染寨卡病毒有關(guān)。2016年1月份，中國(guó)確診第一例輸入性寨卡病毒感染患者。傳播寨卡病毒的蚊種主要為伊蚊，在我國(guó)有埃及伊蚊和白紋伊蚊的廣泛分布。雖然寨卡病毒還沒(méi)有在我國(guó)出現(xiàn)流行，但是隨著國(guó)際交流，旅游等的日益便利頻繁，病毒很有可能會(huì)傳入中國(guó)，甚至引起大流行。特別是全球氣候變暖，使得伊蚊繁殖更多，分布范圍更廣，更加加劇寨卡病毒傳播的可能性。寨卡病毒感染的早期診斷是控制病毒傳播的重要措施。檢測(cè)蚊媒體內(nèi)攜帶寨卡病毒的量，知曉蚊媒對(duì)病毒的感染率、傳播率和擴(kuò)散率對(duì)蚊媒的防控具有關(guān)鍵意義。目前，人群病人診斷的措施有血清學(xué)檢查，抗原測(cè)定，病毒分離和病毒核酸檢測(cè)，抗原抗體檢測(cè)容易與其他黃病毒屬病毒引起交叉反應(yīng)，病毒分離消耗時(shí)間長(zhǎng)。因此，開(kāi)發(fā)一種能早期迅速的從病人和蚊媒中檢測(cè)寨卡病毒的高度靈敏、特異且價(jià)廉、易用的檢測(cè)方法刻不容緩。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明需要解決技術(shù)方案之一是提供一種寨卡病毒特異性核酸檢測(cè)靶序列。

解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案的如下：

構(gòu)建的ZIKV特異性檢測(cè)靶序列,具有SEQ ID NO：1所示堿基組成。

本發(fā)明另一目的是提供一種重組質(zhì)?；蛸|(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或E.coli工程菌菌株。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：

一種包含有上述任一所述ZIKV特異性檢測(cè)靶序列的重組質(zhì)?；蛸|(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；進(jìn)一步以該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)菌E.coli，獲得能用于生產(chǎn)該重組質(zhì)粒的工程菌菌株。

本發(fā)明的另一目的是提供ZIKV特異性核酸檢測(cè)試劑盒。

實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：

一種針對(duì)SEQ ID NO：1的ZIKV特異性核酸檢測(cè)試劑盒，包括有：堿基組成為SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3構(gòu)成的巢式PCR外引物對(duì)，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5構(gòu)成的巢式PCR內(nèi)引物對(duì)，以及由SEQ ID NO：6所示堿基構(gòu)成的逆轉(zhuǎn)錄引物，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8構(gòu)成的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，由SEQ ID NO：9所示堿基構(gòu)成的熒光定量PCR探針。

所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和熒光定量PCR探針的熒光報(bào)告基團(tuán)均為FAM、JOE、ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red中的至少一種；所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和熒光定量PCR探針的熒光淬滅基團(tuán)均為MGB、BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa BlackTMRQ或Lowa BlackTMFQ中的至少一種。

本發(fā)明基于大量深入的ZIKV基因組學(xué)生物信息學(xué)分析，其中結(jié)合部分核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)及功能分析，并進(jìn)行數(shù)次核酸檢測(cè)體系的實(shí)踐性調(diào)校與優(yōu)化，方獲得本發(fā)明的ZIKV核酸檢測(cè)體系。進(jìn)一步為杜絕在核酸檢測(cè)試劑潛存的陽(yáng)性對(duì)照污染問(wèn)題，本發(fā)明在ZIKV檢測(cè)靶片段中經(jīng)過(guò)優(yōu)選的插入位點(diǎn)插入經(jīng)過(guò)人工改造的內(nèi)含子片段mINTRON-T，構(gòu)建了可供ZIKV核酸檢測(cè)用的新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其具有SEQ ID NO：1所示堿基組成。經(jīng)過(guò)測(cè)試，證實(shí)本發(fā)明所構(gòu)建的ZIKV特異性的核酸檢測(cè)試劑盒是有效、可行、敏感特異、價(jià)廉簡(jiǎn)便的能應(yīng)用媒介蚊蟲(chóng)等ZIKV攜帶情況的檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1是PR-out-F(SEQ ID NO：2)和PR-out-R(SEQ ID NO：3)引物對(duì)ZIKV病毒株P(guān)CR擴(kuò)增電泳圖；

其中，Lane 1：擴(kuò)增條帶與預(yù)期大小313bp相符。

圖2是新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pBmRD-T構(gòu)建示意圖；

其中：橫向白色箭頭所示為能檢測(cè)ZIKV特異性巢式PCR外巢引物對(duì)(PR-out-F，SEQ ID NO：2和PR-out-R，SEQ ID NO：3)；黑色箭頭所示為ZIKV特異性?xún)?nèi)巢引物對(duì)(PR-in-F,SEQ ID NO：4和PR-in-R,SEQ ID NO：5)；淺灰色箭頭及黃色小圖形示意為ZIKV特異性qPCR引物和探針(PR-Q-F,SEQ ID NO：7和PR-Q-R,SEQ ID NO：8，PR-Q-Pro,SEQ ID NO：9)；黑色片段示意為ZIKV病毒株擴(kuò)增片段，PCR產(chǎn)物預(yù)期大小為313bp/261bp；深灰色片段示插入人工改造的mINTRON-T序列片段，為50bp的插入子，因而，所構(gòu)建的新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子作為陽(yáng)性參照所擴(kuò)增的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物預(yù)期大小為363bp/311bp。該標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子一方面能較好地檢測(cè)試劑體系的有效性；另一方面，能簡(jiǎn)易地自不同的分子量大小區(qū)分可能因用戶(hù)的操作或環(huán)境因素的影響而出現(xiàn)的來(lái)自陽(yáng)性對(duì)照的潛在污染情況。

圖3是CR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；

其中，A：PR-Insert-F和PR-out-R對(duì)ZIKV病毒株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物Frag A電泳圖，Lane 1：PCR產(chǎn)物如預(yù)期大小236bp，B：PR-out-F和PR-Insert-R對(duì)公司合成的重組質(zhì)粒pUC19--B的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Frag B電泳圖，Lane 1：PCR產(chǎn)物如預(yù)期大小177bp，C：PR-out-F和PR-out-R對(duì)Frag A+Frag B連接產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增電泳圖，Lane 1：PCR產(chǎn)物如預(yù)期大小363bp，D：新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pBmRD-T的雙酶切鑒定，Lane 1：酶切插入子片段如預(yù)期大小436bp(克隆片段363bp+質(zhì)粒片段73bp)，M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量。

圖4是巢式PCR擴(kuò)增pBmRD-T的LOD測(cè)試的電泳圖；

其中，A：PR-out-F和PR-out-R對(duì)pBmRD-T的PCR擴(kuò)增LOD測(cè)試，M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，Lane1-14：新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pBmRD-T梯度稀釋依次為10¹⁰-10⁵copies，2000copies，400copies，80copies，40copies，20copies，10copies，5copies，1copy的外巢PCR擴(kuò)增，可見(jiàn)外巢PCR的LOD為400copies，Lane 15：空白對(duì)照；B：巢式PCR體系對(duì)pBmRD-T的LOD測(cè)試，M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，Lane 1-6：新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pBmRD-T分別稀釋至80copies，40copies，20copies，10copies，5copies，1copy，可見(jiàn)該LOD為5copies，Lane 7-8：空白對(duì)照。

圖5是巢式PCR檢測(cè)體系對(duì)ZIKV病毒株檢測(cè)的擴(kuò)增條件優(yōu)化的電泳圖；

其中A：外巢引物對(duì)(PR-out-F和PR-out-R)的退火溫度條件優(yōu)化，M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，Lane1-6：退火溫度分別為51.4℃，54.6℃，59.9℃，63.1℃，64.5℃，B：內(nèi)巢引物對(duì)(PR-in-F和PR-in-R)的退火溫度條件優(yōu)化，M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，Lane1-6：退火溫度分別為51.4℃，54.6℃，59.9℃，63.1℃，64.5℃。

圖6是實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系對(duì)新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子檢測(cè)的擴(kuò)增曲線(xiàn)，從左到右的曲線(xiàn)代表的標(biāo)準(zhǔn)分子拷貝數(shù)為10⁷-10¹copies/μl，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)孔，曲線(xiàn)呈“S”型，說(shuō)明該試劑盒在10⁷-10¹copies/μl之間，CT值與拷貝數(shù)成線(xiàn)性關(guān)系。

圖7是實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系對(duì)新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性方程為：Y＝-3.387LOG(x)+41.43，相關(guān)系數(shù)R²＝0.996，擴(kuò)增效率為97.4％。其中Y代表Ct值，x代表標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子拷貝數(shù)。

圖8是實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的檢測(cè)極限(LOD)測(cè)試的擴(kuò)增曲線(xiàn)，擴(kuò)增曲線(xiàn)從左到右表示標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pBmRD-T拷貝數(shù)為2000copies/μl、400copies/μl、80copies/μl、20copies/μl、1copy/μl。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子全部表現(xiàn)為擴(kuò)增曲線(xiàn)，為陽(yáng)性數(shù)據(jù)，表明該檢測(cè)體系的檢出限可達(dá)到1copy/反應(yīng)。

圖9是巢式PCR檢測(cè)體系對(duì)不同來(lái)源C6/36培養(yǎng)的ZIKV病毒液的檢測(cè)的電泳圖，

A：對(duì)人工感染ZIKV后的白紋伊蚊是否感染ZIKV的檢測(cè)(為PCR內(nèi)巢擴(kuò)增片段的電泳圖)M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，Lane 1-5：白紋伊蚊佛山株感染ZIKV第1天檢測(cè)結(jié)果，Lane 6-10：白紋伊蚊佛山株感染ZIKV第5天檢測(cè)結(jié)果，Lane 11:空白對(duì)照,Lane 12：實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)白紋伊蚊佛山株(陰性對(duì)照)，Lane 13：標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pBmRD-T陽(yáng)性對(duì)照；B：對(duì)C6/36培養(yǎng)的ZIKV病毒液的檢測(cè)，M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，Lane 1-3：C6/36培養(yǎng)的ZIKV第1，2，3代病毒液外巢，Lane 4-5：空白和陰性對(duì)照，Lane 6-8：C6/36培養(yǎng)的ZIKV第1，2，3代病毒液內(nèi)巢，Lane 9：陰性對(duì)照，Lane 10：標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pBmRD-T陽(yáng)性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一 ZIKV通用特異性核酸檢測(cè)體系生物信息學(xué)篩選與設(shè)定

篩選獲得NCBI收錄的49條ZIKV全長(zhǎng)，其中非洲型16條，亞洲型33條，以MEGA6、DNAMAN等生物信息學(xué)分析軟件進(jìn)行分析，尋找具有ZIKV特異性的保守序列區(qū)域，且排除其他物種如ZIKV宿主人、蚊，其他黃病毒屬病毒核酸序列，等，初步靶向ZIKV檢測(cè)的病毒靶標(biāo)檢測(cè)片段以及引物對(duì)，并以Beacon Designer 7.5、Oligo6等軟件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)，初步設(shè)計(jì)合成后，通過(guò)初步測(cè)試，不斷進(jìn)行檢測(cè)體系尤其是引物序列等微調(diào)，方錨定本發(fā)明ZIKV特異性核酸檢測(cè)體系，其中主要引物對(duì)見(jiàn)表1。

表1：ZIKV核酸檢測(cè)引物、逆轉(zhuǎn)錄引物及其標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子構(gòu)建引物

備注：PR-out-F與PR-out-R為ZIKV巢式PCR檢測(cè)體系的外引物對(duì)，用于檢測(cè)ZIKV時(shí)的預(yù)期片段大小為313bp,PR-in-F與PR-in-R為其內(nèi)引物對(duì)，檢測(cè)ZIKV的預(yù)期片段大小為261bp，PR-Q-F與PR-Q-R為qPCR引物，用于檢測(cè)ZIKV時(shí)的預(yù)期片段大小為107bp；為防止作為陽(yáng)性對(duì)照的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子可能存在的氣溶膠污染，改造設(shè)計(jì)了一段內(nèi)含子序列mINTRON-T，插入ZIKV檢測(cè)靶標(biāo)片段，Overlapping PCR引物對(duì)為PR-Insert-F和PR-Insert-R，因而，檢測(cè)作為陽(yáng)性對(duì)照的新型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子時(shí)，PR-out-F與PR-out-R擴(kuò)增獲得363bp片段，進(jìn)一步的PR-in-F與PR-in-R擴(kuò)增獲得311bp的陽(yáng)性對(duì)照片段，PR-Q-F與PR-Q-R擴(kuò)增獲得157bp的陽(yáng)性對(duì)照片段。

實(shí)施例二 ZIKV病毒分離株靶標(biāo)檢測(cè)片段的制備

(一)ZIKV病毒RNA提取

ZIKV病毒株為本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存于-80℃。采用Viral RNA Mini Kit試劑盒提取病毒RNA，試劑有:carrier-buffer AVE(-20℃),AW1,AW2,AVL,AVE等。主要步驟如下：

1.取AVL 800μl加入至2mlEP管，加入8μl carrier-buffer AVE，輕柔顛倒混勻10次；

2.將200μl病毒液樣本加入至EP管，渦旋15秒，混勻，裂解，室溫放置10min,瞬時(shí)離心；

3.加入800μl無(wú)水乙醇，渦旋15秒充分混勻，瞬時(shí)離心；

4.取630μl上步溶液小心加入至column中；

5.離心8000rpm 1min；

6.可根據(jù)樣本情況重復(fù)第4步；

7.將column放入新2ml無(wú)蓋離心管中；

8.加入500μl buffer AW1；8000rpm離心，1min；將column放入新2ml無(wú)蓋離心管中；

9.加入500μl buffer AW2，14000rpm離心3min；

10.將column放入新的2ml無(wú)蓋離心管中，14000rpm離心1min；

11.將column放在1.5ml離心管中，加入60μl室溫的buffer AVE；室溫放置2min，

8000rpm離心1min。

(二)ZIKV病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄

以PR-rev-1(SEQ ID NO：6,5’-AGCGTGGTGGAAACTCATGGAG-3’)ZIKV特異性的逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行ZIKV病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄。主要試劑：dNTP Mixture(10mM each)，RNase free ddH₂O，5×PrimeScript II Buffer，RNase Inhibitor(40U/μl)，PrimeScript II RTase(200U/μl)，主要步驟如下：

ZIKV特異型逆轉(zhuǎn)錄引物PR-rev-1 1μl+dNTP Mixture(10mM each)1μl+ZIKV-RNA 2μl+RNase free ddH₂O 6μl，65℃保溫5min后，冰上迅速冷卻；再依次加入：

緩慢搖勻后，置于PCR儀42℃30min，70℃15min。

(三)ZIKV病毒靶標(biāo)檢測(cè)片段的PCR擴(kuò)增及切膠純化

用PR-out-F(SEQ ID NO：2)和PR-out-R(SEQ ID NO：3)引物對(duì)，擴(kuò)增上述逆轉(zhuǎn)錄獲得的ZIKV病毒分離株cDNA

PCR擴(kuò)增體系

反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸15s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1，可見(jiàn)獲得預(yù)期大小313bp的目的片段。

(四)新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子Frag B的合成與PCR鑒定

將預(yù)期的新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子Frag B序列交予公司合成，最后公司將該片段克隆至pUC19質(zhì)粒載體,該重組質(zhì)粒命名為pUC19-B。以PR-out-F和PR-Insert-R對(duì)該重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果：PCR鑒定見(jiàn)圖3B，可見(jiàn)Lane 1顯示預(yù)期大小的片段177bp，序列如下：

GGAAAGCTGTGCAGCCTGTGACCCCCCCAGGAGAAGCTGGGAAACCAAGCCTATAGTCAGGCCGAGAACGCCATGGCACGGAAGAAGCCATGCTGCCTGTGAGCCCCTCAGAGGACACTGAGTCAAAAGGTGAGCATGAAGTGAATTTACGAGTGTCTTCATGTATTCTATTTGTGT

實(shí)施例三檢測(cè)ZIKV的新型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其工程菌菌株的構(gòu)建

新型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pBmRD-T的構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖2。如圖所示，所構(gòu)建的新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子作為陽(yáng)性參照所擴(kuò)增的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物預(yù)期大小為363bp/311bp，將有別于本發(fā)明所構(gòu)建的核酸檢測(cè)體系應(yīng)用于ZIKV的病毒標(biāo)本檢測(cè)所獲得病毒靶標(biāo)片段大小313bp/261bp。該標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子一方面能較好地檢測(cè)試劑體系的有效性；另一方面，能簡(jiǎn)易自不同的分子量大小區(qū)分可能因用戶(hù)的操作或環(huán)境因素的影響而出現(xiàn)的來(lái)自陽(yáng)性對(duì)照的潛在污染情況。

人工改造后的內(nèi)含子mINTRON-T采用Overlapping PCR構(gòu)建插入ZIKV病毒株來(lái)源的片段中，大小為50bp，mINTRON-T序列為AGGTGAGCATGAAGTGAATTTACGAGTGTCTTCATGTATTCTATTTGTGT。所設(shè)計(jì)的PR-Insert-F和PR-Insert-R的具體序列見(jiàn)表1。具體插入方案：以PR-Insert-F和PR-out-R擴(kuò)增ZIKV檢測(cè)靶標(biāo)片段獲得Frag A 236bp片段；以PR-out-F和PR-Insert-R擴(kuò)增質(zhì)粒pUC19-B獲得Frag B 177bp片段；進(jìn)一步以PR-out-F和PR-out-R擴(kuò)增FragA和FragB的連接片段，即363bp的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的靶標(biāo)檢測(cè)片段，克隆鑒定后獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其工程菌菌株。具體實(shí)施步驟如下：

1.Frag A和Frag B的PCR擴(kuò)增

以ZIKV檢測(cè)靶標(biāo)片段PCR產(chǎn)物為模板，PR-Insert-F和PR-out-R PCR獲得Frag A 236bp，以公司合成的pUC19-B為模板，PR-out-F和PR-Insert-R PCR獲得Frag B 177bp。

PCR體系：

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s,63℃退火30s,72℃延伸15s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min。取5μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖3A和B，擴(kuò)增獲得預(yù)期236bp和177bp的片段。進(jìn)一步經(jīng)過(guò)切膠純化后的片段Frag A和Frag B應(yīng)用于下一步的連接與擴(kuò)增。

2.Overlapping extension PCR

拼接反應(yīng)體系

反應(yīng)條件如下：98℃預(yù)變性2min；98℃變性10s,68℃退火20s,72℃延伸15s，15個(gè)循環(huán)。

進(jìn)一步大量擴(kuò)增Frag A+Frag B的拼接片段，反應(yīng)體系如下表中所述，反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性2min；98℃變性10s,63℃退火20s,72℃延伸15s，15個(gè)循環(huán),72℃延伸8m。后，取5μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3C，獲得預(yù)期363bp大小的靶檢測(cè)片段。

3.新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pBmRD-T和重組甘油菌T1-pBmRD-T的構(gòu)建與鑒定

對(duì)363bp產(chǎn)物切膠回收純化后連接進(jìn)pEASY-Blunt Cloning Vector，轉(zhuǎn)化Trans1-T1Phage Resistant chemically Competent Cell感受態(tài)細(xì)胞，LB Amp⁺固體培養(yǎng)板培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單克隆菌落接種于LB/Amp+液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌過(guò)夜；以試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)一步以雙酶切和測(cè)序進(jìn)行重組質(zhì)粒的鑒定。結(jié)果：酶切鑒定見(jiàn)圖3D，Lane 1切出預(yù)期大小的片段436bp(克隆片段363bp+質(zhì)粒片段73bp)，雙向測(cè)序驗(yàn)證序列正確，該克隆為陽(yáng)性重組質(zhì)粒pBmRD-T，保存質(zhì)粒pBmRD-T和重組甘油菌T1-pBmRD-T于-80℃?zhèn)溆?。序列如SEQ ID NO：1所示。

實(shí)施例四ZIKV特異性核酸檢測(cè)體系的建立與標(biāo)本測(cè)試

1.巢式PCR檢測(cè)體系的檢測(cè)極限(LOD)測(cè)試

將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pBmRD-T梯度稀釋為10¹⁰-10⁵copies/μl,2000,400,80copy/μl，以PR-out-F和PR-out-R對(duì)pBmRD-T進(jìn)行外巢PCR擴(kuò)增，如圖4A所示外引物對(duì)的LOD為400copies/μl,可檢測(cè)到363bp的預(yù)期大小片段；進(jìn)一步將pBmRD-T分別稀釋至80copies/μl，40copies/μl，20copies/μl，10copies/μl，5copies/μl,1copy/μl以PR-out-F+PR-out-R/PR-in-F+PR-in-R巢式PCR體系進(jìn)行測(cè)試，如圖4B所示LOD可達(dá)5copies/μl，檢測(cè)到311bp預(yù)期大小的靶標(biāo)片段，呈現(xiàn)較高的敏感性。

2.巢式PCR檢測(cè)體系檢測(cè)ZIKV分離株的病毒來(lái)源片段的體系優(yōu)化

模板選用本實(shí)驗(yàn)室自保存的ZIKV病毒株來(lái)源的RNA所逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，PCR擴(kuò)增體系如下：

PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s,59.9-64.9℃退火30s,72℃延伸15s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min。5μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，如圖5A所示：1-5退火溫度分別為59.9℃，61.1℃，62.1℃，63.2℃，64.1℃，64.9℃，不同的退火溫度，均能擴(kuò)增獲得預(yù)期313bp的片段，條帶均很亮且沒(méi)有拖尾，選63℃為后續(xù)檢測(cè)體系中外引物對(duì)擴(kuò)增時(shí)使用的優(yōu)化退火溫度。

進(jìn)一步將外巢擴(kuò)增產(chǎn)物313bp稀釋后作為內(nèi)引物對(duì)擴(kuò)增退火溫度的優(yōu)化，主要步驟如下：

內(nèi)引物對(duì)擴(kuò)增體系：

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s,56.9-64.8℃退火30s,72℃延伸15s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min。5μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，如圖5B所示：1-6退火溫度分別為59.9℃，61.1℃，62.1℃，63.2℃，64.1℃，64.9℃，呈示均能獲得預(yù)期261bp的靶標(biāo)片段，所擴(kuò)增條帶均較亮，選用63℃為后續(xù)檢測(cè)體系內(nèi)引物對(duì)的優(yōu)化退火溫度。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的構(gòu)建

將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pBmRD-T梯度稀釋為10⁷-10¹copies/μl,反應(yīng)體系及條件如下表，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即模板濃度與Ct值之間線(xiàn)性關(guān)系圖如圖7所示。由圖6和圖7可見(jiàn)，該試劑盒的在10⁷copies/μl至10¹copies/μl之間具有很好的線(xiàn)性關(guān)系，同時(shí)該試劑盒擬合的線(xiàn)性方程為：Y＝-3.387LOG(x)+41.43，相關(guān)系數(shù)R²＝0.996，擴(kuò)增效率為97.4％。其中Y代表Ct值，x代表標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子拷貝數(shù)。

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的檢測(cè)極限(LOD)測(cè)試

將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pBmRD-T梯度稀釋為2000copies/μl、400copies/μl、80copies/μl、20copies/μl、1copy/μl，反應(yīng)體系及條件同上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考圖8，由圖8可見(jiàn)，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子全部表現(xiàn)為擴(kuò)增曲線(xiàn)，為陽(yáng)性數(shù)據(jù)，因此通過(guò)該實(shí)驗(yàn)表明該檢測(cè)體系的檢出限可達(dá)到1copy/反應(yīng)。

5.巢式PCR檢測(cè)體系測(cè)試

收集白紋伊蚊佛山株人工感染寨卡病毒后第1天和第5天蚊蟲(chóng)各5只，白紋伊蚊實(shí)驗(yàn)室保種佛山株品系雌蚊1只，C6/36細(xì)胞培養(yǎng)的ZIKV第3，4，5代病毒液，各類(lèi)標(biāo)本均以試劑盒提取標(biāo)本總RNA，以PR-rev-1寨卡病毒特異性逆轉(zhuǎn)錄引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以所構(gòu)建并優(yōu)化的巢式PCR體系進(jìn)行檢測(cè)測(cè)試，如圖9A所示，白紋伊蚊佛山株人工感染寨卡病毒后第1天和第5天蚊蟲(chóng)中有檢出ZIKV陽(yáng)性，檢出預(yù)期261bp(Lane2,3,5,7,8,9)大小的病毒來(lái)源靶標(biāo)片段，而陽(yáng)性參照檢出標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子中設(shè)置的預(yù)期對(duì)照311bp(Lane 13)片段，陰性標(biāo)本和空白對(duì)照均呈陰性。如圖9B所示，C6/36細(xì)胞培養(yǎng)的ZIKV第3，4，5代病毒液都檢測(cè)出陽(yáng)性，檢出預(yù)期外巢313bp(Lane 1-3)內(nèi)巢261bp(Lane 6-8)大小的病毒來(lái)源靶標(biāo)片段，陽(yáng)性參照檢出標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子中設(shè)置的預(yù)期對(duì)照內(nèi)巢311bp(Lane10)片段，陰性標(biāo)本和空白對(duì)照均呈陰性。

6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系測(cè)試

以上述白紋伊蚊佛山株人工感染寨卡病毒后第5天蚊蟲(chóng)，白紋伊蚊實(shí)驗(yàn)室保種佛山株品系雌蚊，C6/36細(xì)胞培養(yǎng)的ZIKV第3代病毒液標(biāo)本的cDNA為樣本，用所構(gòu)建的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè)測(cè)試。各標(biāo)準(zhǔn)品和樣本CT值和拷貝數(shù)如表2所示，各CT值在18-36之間，認(rèn)為所有樣本都出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，即都檢測(cè)出寨卡病毒，其中C6/36細(xì)胞培養(yǎng)的ZIKV第3代病毒液病毒載量約為9.3*10⁵copies。

表2：熒光定量PCR檢測(cè)樣本結(jié)果

以上是針對(duì)本發(fā)明的可行實(shí)施例的具體說(shuō)明，但該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的專(zhuān)利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明的專(zhuān)利范圍中。