本發(fā)明屬于病毒檢測領(lǐng)域，具體涉一種B亞群禽肺病毒疫苗的效檢方法。
背景技術(shù)：
：禽肺病毒(Avianpneumovirus，APV)又稱火雞鼻氣管炎病毒(turkeyRhinotracheitisviru，TRTV)，屬于單鏈負(fù)股RNA病毒。肺病毒引起的疾病最早在火雞上發(fā)現(xiàn)，引起火雞的呼吸道疾病并導(dǎo)致產(chǎn)蛋量下降。APV基因組包含了8個主要的結(jié)構(gòu)蛋白基因，N-P-M-F-M2-SH-G-L。根據(jù)其G蛋白差異和血清學(xué)分析，APV分為A亞型(英國)和B亞型(歐洲大陸)，A亞型和B亞型相似，但是G蛋白只有38％的相似率，這兩個亞型在歐洲廣泛流行。我國主要流行的為B亞型禽肺病毒。目前主要用普通的RT-PCR進(jìn)行檢測，但普通的RT-PCR方法雖然可以定性檢測禽肺病毒核酸的有無，但是不能顯示出病毒量的變化。因此，有必要提供一種能區(qū)分出病毒含量的高低的方法，從而來檢測禽肺病毒疫苗的效價。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種B亞群禽肺病毒疫苗的效檢方法，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明首先提供一種用于B亞群禽肺病毒疫苗效檢的引物組，其序列信息如下：G-S:CCGGGACAAGTATCTCTATGG(SEQIDNO:1)、G-AS:TGTTGACTGTCCTGGATGTAAG(SEQIDNO:2)、作為檢測內(nèi)參基因β-actin的特異性引物，其引物信息如下：Actin-s：ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC(SEQIDNO:3)、Actin-as：GTGGTGCCAGATCTTCTCCA(SEQIDNO:4)；本發(fā)明另一個方面提供一種用于檢測B亞群禽肺病毒疫苗效檢的試劑盒，包含有上述的引物組本發(fā)明的再一個方面是提供一種B亞群禽肺病毒疫苗的效檢方法，具體如下：1)免疫及攻毒：將禽肺病毒疫苗免疫21日齡的SPF雞，滴鼻點眼攻擊禽肺病毒；攻毒5日后，分離組織樣品；2)RNA的提?。悍Q取免疫攻毒組、對照組組織提取RNA；3)熒光定量RT-PCR：用上述的引物進(jìn)行熒光定量RT-PCR，對目的基因進(jìn)行相對定量，從而對疫苗的效果進(jìn)行評價。本發(fā)明提供了一套基于分子方法的B亞群禽肺病毒快速診斷體系，能靈敏、特異、快速、穩(wěn)定、簡便地檢測B亞群禽肺病毒。由于采用了內(nèi)參基因，從而校正上樣量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。能有效地能有效地區(qū)分出病毒含量的高低的方法，從而來檢測禽肺病毒疫苗的效價。附圖說明圖1：樣品G基因和actin基因的溶解曲線圖；圖2：熒光定量RT-PCR的靈敏性試驗圖；其中A1～A9為免疫組，D1～D5為對照組。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。實施例1引物的設(shè)計1、G蛋白引物的設(shè)計本發(fā)明根據(jù)GenBank中禽肺病毒(APV)A、B、C亞群序列以及本實驗室分離的一株B亞型病毒基因序列，進(jìn)行同源性分析后設(shè)計幾對針對B亞型的特異性引物，引物的序列信息如下：G1-S:CCGGGACAAGTATCTCTATGGG1-AS:TGTTGACTGTCCTGGATGTAAGG2-S:GGGACAAGTATCCAGATGGGGG2-AS:GCATAACTGCGATCATGCATATCG3-S:GGCGGAAAATGGATCCTTACATCG3-AS:GGAGTTCCTCTGGGCAGTGGT并設(shè)計了兩對針對內(nèi)參基因β-actin的特異性引物，建立了一種快速檢測不同組織中APVB亞群病毒載量的檢測方法。Actin1-s：ATGTGCAAGGCCGGTTTCGCActin1-as：GTGGTGCCAGATCTTCTCCAActin2-s：TATTGCTGCGCTCGTTGTTGAActin2-as：GGGCTACTCTCAGCTCATTGTA1.1材料與方法1.1病料APV病料由青島易邦生物工程提供。1.2儀器與試劑ABI7500熒光定量PCR儀，北京天恩澤動物柱式RNA提取試劑盒，寶生物PrimeScriptTMRT-PCRKitⅡ，引物由上海生物工程有限公司合成。1.3RNA的提取稱取不同的病料各0.1～0.2g組織放入MagNALyserGreenBeads的離心管中，加10倍體積的生理鹽水，置冰上。將離心管放入中通量組織研磨器，以6000r/min搗碎45秒,迅速放入冰盒中冷卻10分鐘，再重復(fù)2次。按照北京天恩澤動物柱式RNA提取試劑盒提取RNA。1.4反應(yīng)體系的配置2×Buffer10μL引物-S1μL引物-AS1μLROX0.4μLEnzyme-mix0.8μL水4.8μL模板2μL總體積20μL1.5反應(yīng)條件42℃反轉(zhuǎn)錄5分鐘；95℃預(yù)變性10秒；95℃變性5秒；60℃退火延伸35秒，共40個循環(huán)。在每一循環(huán)的延伸結(jié)束時采集熒光信號進(jìn)行熒光定量PCR檢測。2結(jié)果用3對B型G蛋白引物和2對β-actin的特異性引物分別對APV病料進(jìn)行熒光定量RT-PCR，結(jié)果顯示G蛋白的引物(G1-S和G1-AS)和β-actin(Actin1-s和Actin1-as)特異性最好。本發(fā)明還提供一種禽肺病毒B亞群特異性檢測的熒光定量RT-PCR試劑盒，能特異性擴(kuò)增禽肺病毒B亞群G基因的異性引物和維持細(xì)胞基本活動的管家基因β-actin，然后以管家基因的定量結(jié)果為依據(jù)對目的基因進(jìn)行比值校正，求得相對比值即為相對表達(dá)量。實施例2：引物組的效果檢測用熒光定量RT-PCR對IBV、IBDV、NDV、AIVH9、APV病料進(jìn)行檢測。1.引物特異性試驗1.1材料與方法1.1.1病料IBV、IBDV、NDV、AIVH9、APV病料由青島易邦生物工程提供。1.1.2儀器與試劑ABI7500熒光定量PCR儀，北京天恩澤動物柱式RNA提取試劑盒，寶生物PrimeScriptTMRT-PCRKitⅡ，引物由上海生物工程有限公司合成。1.1.3RNA的提取稱取不同的病料各0.1～0.2g組織放入MagNALyserGreenBeads的離心管中，加10倍體積的生理鹽水，置冰上。將離心管放入中通量組織研磨器，以6000r/min搗碎45秒,迅速放入冰盒中冷卻10分鐘，再重復(fù)2次。按照北京天恩澤動物柱式RNA提取試劑盒提取RNA。1.1.4反應(yīng)體系的配置2×Buffer10μL引物-S1μL引物-AS1μLROX0.4μLEnzyme-mix0.8μL水4.8μL模板2μL總體積20μL1.1.5反應(yīng)條件42℃反轉(zhuǎn)錄5分鐘；95℃預(yù)變性10秒；95℃變性5秒；60℃退火延伸35秒，共40個循環(huán)。在每一循環(huán)的延伸結(jié)束時采集熒光信號進(jìn)行熒光定量PCR檢測。1.2結(jié)果用引物G1-S、G1-AS和Actin1-s、Actin1-as對IBV、IBDV、NDV、AIVH9、APV病料進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測，結(jié)果IBV、IBDV、NDV、AIVH9樣品G蛋白檢測均為陰性，而APV病料有特異性很好的擴(kuò)增曲線。2.引物的靈敏性2.1材料與方法2.1.1病料APV病料由青島易邦生物工程提供。2.1.2儀器與試劑ABI7500熒光定量PCR儀，北京天恩澤動物柱式RNA提取試劑盒，寶生物PrimeScriptTMRT-PCRKitⅡ，引物由上海生物工程有限公司合成。2.1.3RNA的提取稱取不同的病料各0.1～0.2g組織放入MagNALyserGreenBeads的離心管中，加10倍體積的生理鹽水，置冰上。將離心管放入中通量組織研磨器，以6000r/min搗碎45秒,迅速放入冰盒中冷卻10分鐘，再重復(fù)2次。按照北京天恩澤動物柱式RNA提取試劑盒提取RNA。2.1.4反應(yīng)體系的配置2×Buffer10μL引物-S1μL引物-AS1μLROX0.4μLEnzyme-mix0.8μL水4.8μL模板2μL總體積20μL2.1.5反應(yīng)條件42℃反轉(zhuǎn)錄5分鐘；95℃預(yù)變性10秒；95℃變性5秒；60℃退火延伸35秒，共40個循環(huán)。在每一循環(huán)的延伸結(jié)束時采集熒光信號進(jìn)行熒光定量PCR檢測。2.2結(jié)果將APV的RNA進(jìn)行10倍系列稀釋，用引物G1-S、G1-AS和Actin1-s、Actin1-as對10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋度的APV-RNA進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測，結(jié)果顯示該引物能很好地檢測到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度的APV-RNA。該結(jié)果說明引物靈敏性好。實施例3：B亞群禽肺病毒疫苗的效檢1、材料與方法1.1毒株禽肺病毒B亞群SHS/B株由青島易邦生物工程分離。1.2SPF雞購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司，購買后在青島易邦動物房負(fù)壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。1.3儀器與試劑ABI7500熒光定量PCR儀，北京天恩澤動物柱式RNA提取試劑盒，寶生物PrimeScriptTMRT-PCRKitⅡ，引物由上海生物工程有限公司合成。1.4免疫與攻毒將禽肺病毒B亞群SHS/B株制備疫苗免疫21日齡的SPF雞，21日后，滴鼻點眼攻擊SHS/B毒株。攻毒5日后，分離肺。1.5RNA的提取稱取免疫攻毒組、對照組0.1～0.2g組織放入MagNALyserGreenBeads的離心管中，加10倍體積的生理鹽水，置冰上。將離心管放入中通量組織研磨器，以6000r/min搗碎45秒,迅速放入冰盒中冷卻10分鐘，再重復(fù)2次。按照北京天恩澤動物柱式RNA提取試劑盒提取RNA。1.6反應(yīng)體系的配置2×Buffer10μL引物-S1μL引物-AS1μLROX0.4μLEnzyme-mix0.8μL水4.8μL模板2μL總體積20μL1.7反應(yīng)條件42℃反轉(zhuǎn)錄5分鐘；95℃預(yù)變性10秒；95℃變性5秒，60℃進(jìn)行退火延伸35秒，共40個循環(huán)。在每一循環(huán)的延伸結(jié)束時采集熒光信號進(jìn)行熒光定量PCR檢測。2、結(jié)果免疫組和對照組肺組織中的病毒含量將免疫組和對照組的肺進(jìn)行熒光定量RT-PCR，從圖2可明顯看出，對照組中病毒含量遠(yuǎn)高于免疫組，可見該方法能有效地檢測疫苗的效力。當(dāng)前第1頁1 2 3