本發(fā)明涉及分子診斷
技術領域：
，特別涉及一種檢測豬臍帶血豬瘟病毒的Taqman實時熒光PCR試劑盒及其用途。
背景技術：
：豬瘟是由豬瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus,CSFV)引起的豬的一種高度接觸性、急性傳染病，主要表現(xiàn)為發(fā)病急，高熱稽留，微循環(huán)血管壁變性及其導致的全身泛發(fā)性小點出血，內(nèi)臟器官中多發(fā)性出血、壞死和梗死，具有很輕的傳染性和較高的致死率。早期通過典型的臨床癥狀及病理變化進行豬瘟診斷，近年來，豬瘟的非典型臨床表現(xiàn)變化比較常見，多呈現(xiàn)母豬繁殖障礙，新生仔豬先天性感染，持續(xù)感染，免疫耐受和無癥狀帶毒等多種形式。給豬瘟的鑒別診斷帶來很大的挑戰(zhàn)。隨著生物技術的發(fā)展，對疾病的檢測可分為病原分離培養(yǎng)，血清學檢測(如ELISA，免疫熒光)和分子生物學檢測技術(PCR方法，熒光定量PCR方法)。目前用于豬瘟病毒的檢測方法有動物接種試驗，病毒分離技術，標記抗體技術，酶聯(lián)免疫吸附試驗和分子生物檢測技術。(1)動物接種試驗中易感豬接種是檢測豬瘟病毒的經(jīng)典方法，但該方法需要較高的生物安全設施，且同時存在試驗動物標準不統(tǒng)一，動物存在個體差異，及潛在的散毒，該方法使用較少。(2)病毒分離采用細胞培養(yǎng)法分離病毒，是試驗室檢測與鑒定豬瘟的標準方法，采集病變典型的可疑組織、血液或臟器，經(jīng)研磨，裂解、差速離心提取病毒，并使用對豬瘟病毒敏感的細胞系如ST，PK-15等細胞進行培養(yǎng)。(3)血清學檢測方法：商用的試劑盒有豬瘟抗體阻斷ELISA方法的檢測，直接免疫熒光抗體法，該方法因其操作簡單，快速，技術可靠，可檢測批量樣品，成本相對較低，很多國家將它作為執(zhí)行豬瘟消滅疾患的法定試驗。但因豬瘟與同屬的牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病病毒存在共同抗原，在基因結構上同源性達60％以上。在血清學檢測上存在交叉反應現(xiàn)象。(4)分子生物學檢測技術：歐盟使用了豬瘟巢式PCR作為國際標準，我國也建立了豬瘟病毒RT-nPCR檢測方法，豬瘟病毒熒光定量RT-PCR檢測方法和豬瘟病毒熒光定量鑒別RT-PCR檢測方法。但國內(nèi)自主研發(fā)的商用的試劑盒還較少。同時普通PCR檢測方法存在易出現(xiàn)假陽性，操作時間長，套式擴增，技術操作要求技術高等的缺陷?，F(xiàn)有技術存在如下不足：①血清學檢測技術對豬群中存在的免疫耐受現(xiàn)象評估較難，相對不能更加有效、直觀和高精準反映豬群的抗體水平；②血樣采集需要多人協(xié)助，且需要特殊設備，采集過程相對比較費時；③豬瘟與同屬的牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病病毒存在共同抗原，在基因結構上同源性達60％以上。在血清學檢測上存在交叉反應現(xiàn)象。分析現(xiàn)有技術存在以上不足的原因，(可能)是因為：①血清學檢測方法是抗原和抗體反應，僅檢測1次無法準確判斷豬群的感染狀況和排毒狀況，豬瘟與同屬的牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病病毒在基因結構上存在60％的同源，存在血清學交叉反應，需進一步的驗證。②血清學檢測抗體，檢測的抗體水平高低無法定量檢測分析，血清學僅能評價機體體液免疫產(chǎn)生的水平；③血清學評估豬群健康度、對無癥狀帶毒和免疫耐受的豬群評估存在技術上的瓶頸；④血清學需要采集前腔靜脈血，血樣采集相對費力、費時、且需要特殊設備輔助，多人協(xié)助導致。豬屬于上皮絨毛胎盤，豬胎盤生理正常的結構即血胎屏障，胎盤屏障的存在使正常的臍帶血內(nèi)不存在任何病原和抗體等大分子物質(zhì)。采用從仔豬臍帶血中檢測CSFV來評價豬瘟的發(fā)病情況，更加科學直接有效。在規(guī)?；i場出現(xiàn)疑似豬瘟的疫情后，目前通常診斷方法是送檢患病豬的病料，包括患豬腸道淋巴結、腸道內(nèi)容物和新鮮糞便，利用普通PCR方法進行檢測，根據(jù)檢測結果，結合該豬場其他情況給出診斷報告并制定疫病防控計劃。但是由于目前所用普通PCR方法操作時間較長，操作過程中容易污染(相對qPCR)，導致診斷結果對豬場疫病防控的指導意義有一定的局限性。在實際生產(chǎn)中，對于疾病的診斷和防控，需要建立一種快速檢測臍帶血豬瘟病毒的方法，不僅可以對母豬疫苗株的安全評價及仔豬疾病的快速準確診斷，及時制定防控計劃，具有十分重要的臨床意義，而且可根據(jù)臍帶血檢測結果評估豬群CSFV野毒感染狀況，開展豬瘟的凈化，達到規(guī)?；i場豬瘟病毒感染為陰性。因此，亟待建立一種可以精準檢測豬臍帶血豬瘟病毒的方法。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提出一種檢測豬臍帶血豬瘟病毒的Taqman實時熒光PCR試劑盒及其用途。該試劑盒具有靈敏度高、特異性好、重復性優(yōu)、檢測結果快速客觀準確等優(yōu)點，具有操作簡便、無應激，直觀、特異、快速和高精準的效果，能同時反映母、仔豬豬瘟病毒帶毒和排毒狀況，評估母豬豬瘟疫苗的免疫效果，側面反映母豬的健康狀況水平，有益于對群體豬瘟病毒感染的凈化和免疫情況的早期預警評判，進一步有助于豬場做好該疾病的預警、防控工作?；谏鲜瞿康模景l(fā)明提供的一種檢測豬臍帶血豬瘟病毒的Taqman實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，包括擴增引物和特異性熒光探針，所述擴增引物和特異性熒光探針的序列如下所示：上游擴增引物：5’-ATGCCCATAGTAGGACTA-3’，其為SEQIDNO:1序列；下游擴增引物：5’-CTAGGGTTAAGGTGTGTC-3’，其為SEQIDNO:2序列；特異性熒光探針：FAM-5’-CCTCGTCCACATAGCATCTCG-3’-TAMARA，其為SEQIDNO:3序列，其中，F(xiàn)AM為熒光報告基因，TAMARA為熒光淬滅基因。合理的引物設計和熒光探針設計是成功應用實時熒光PCR技術的關鍵。引物和探針的特異性對反應有很大影響，如果引物和探針特異性不高，可能在擴增構成中產(chǎn)生非靶標條帶，影響檢測結果的判定。豬瘟病毒與同屬的牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病病毒存在共同抗原，在基因結構上同源性達60％以上，豬瘟病毒為單股RNA型，近些年已經(jīng)發(fā)生變異，所以設計特異性更強的引物和探針難度很大。豬瘟病毒含有唯一ORF，編碼一多聚蛋白，多聚蛋白裂解為4個結構蛋白和7個非結構蛋白，結構蛋白包括C、Erns，E1，E2，非結構蛋白包括Npro，p7，NS4A、NS4B、NS5A、NS5B，本發(fā)明專利引物和探針設計在豬瘟的多聚蛋白ORF基因上，能檢測絕大部分感染豬瘟的豬群。本發(fā)明引物和探針設計在豬瘟病毒多聚蛋白ORF基因上，該引物和探針的特異性強，能夠解決豬瘟病毒與同屬的牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病病毒存在基因交叉的問題，能更特異性的檢測豬瘟病毒。另外，結合豬胎盤的生理結構，豬屬于上皮絨毛胎盤，豬胎盤生理正常的結構即血胎屏障，胎盤屏障的存在使正常的臍帶血內(nèi)不存在任何病原和抗體等大分子物質(zhì)，即使母源抗體(如IgG，12nm)都不能通過此胎盤屏障，所以成熟的CSFV粒子很難直接穿越胎盤屏障感染胎兒，也是一道天然的保護屏障?？傊捎脧淖胸i臍帶血中檢測CSFV多聚蛋白ORF基因來評價母豬豬瘟病毒帶毒和排毒狀況，仔豬在母體內(nèi)感染狀況和反饋母豬的健康狀況，是一種更加科學、直接和有效的診斷豬瘟疾病、評估豬瘟疫苗保護力水平和疾病預警方面的方法之一，在規(guī)模化豬場的豬瘟病的凈化過程中起到更加可靠的技術支撐。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴增引物、所述下游擴增引物和所述特異性熒光探針的摩爾比為3:3:2。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴增引物、所述下游擴增引物和所述特異性熒光探針在所述試劑盒中的終濃度均為0.3～0.5μM。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對照、陽性對照、2×熒光定量Mixture。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述陰性對照為無DNA酶的ddH2O；所述陽性對照為含有豬瘟病毒多聚蛋白ORF基因的克隆質(zhì)粒pEASY-T1-CSFV-ORF，克隆質(zhì)粒pEASY-T1-CSFV-ORF的終濃度為1.0×105copies/μl～1.0×107cop-ies/μl。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述豬瘟病毒多聚蛋白ORF基因的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述克隆質(zhì)粒采用以下方法制備得到：利用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物序列擴增豬瘟病毒多聚蛋白ORF基因序列，豬瘟病毒多聚蛋白ORF基因序列酶切后與pEASY-T1載體連接，篩選陽性克隆，測序正確的克隆質(zhì)粒命名為pEASY-T1-CSFV-ORF。進一步的，本發(fā)明還提供了所述的檢測豬臍帶血豬瘟病毒的Taqman實時熒光PCR試劑盒的使用方法，包括以下步驟：(1)使用所述的實時熒光PCR試劑盒進行PCR擴增時，實時熒光PCR反應體系以20μL計為：0.3μM的SEQIDNO:1所示的上游擴增引物：0.6μL；0.3μM的SEQIDNO:2所示的下游擴增引物：0.6μL；0.2μM的SEQIDNO:3所示的特異性熒光探針：0.8μL；2×熒光定量Mixture：10μL；RNA模板：2μL；ddH2O：補足至20μL；PCR的反應條件為：95℃預變性5min；94℃變性15Sec，58℃退火45Sec，62℃延伸2sec，收集熒光，共40個循環(huán)；然后25℃延伸10sec，最后4℃保護，結束反應；(2)結果分析：根據(jù)擴增結果判定：陰性對照擴增無Ct值，陽性對照擴增Ct值≤30時，則結果判定成立；Ct值≤35，則判斷為豬瘟病毒陽性；35<Ct值≤40為可疑，進行重復檢驗，若重復檢測結果仍為35<Ct值≤40，則判斷為豬瘟病毒陰性；無Ct值顯示，則判斷為豬瘟病毒陰性。在PCR反應體系中加入2×熒光定量Mixture，其包括UNG酶系統(tǒng)，在擴增環(huán)節(jié)可以有效解決擴增污染現(xiàn)象，抗污染能力強等。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述RNA模板采用以下方法制備得到：(1)取50-100mg豬臍帶血置1.5ml勻漿器中，加入1ml裂解液充分勻漿，室溫靜置5min；所述裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS0.1-0.2％；③吐溫201-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP401-2％；(2)加入0.6ml異丙醇和10μL磁珠，振蕩15s，靜置2min；(3)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(4)加入0.5ml異丙醇，將EP管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min；(5)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(6)加入1ml質(zhì)量百分比濃度為70％的乙醇溶液，輕輕洗滌沉淀；將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(7)晾干，加入適量的DEPCH2O溶解，56℃促溶10～15min；(8)快速電泳檢測RNA完整性。本發(fā)明在核酸提取環(huán)節(jié)中，使用鹽酸胍、SDS、吐溫20，NP40，異丙醇和質(zhì)量百分比濃度為70％的乙醇溶液等洗滌，可以有效降低去除溶血的干擾，獲得高質(zhì)量的核酸。更進一步的，本發(fā)明還提供了所述的試劑盒在制備檢測豬臍帶血豬瘟病毒的Taqman實時熒光PCR試劑中的用途。本發(fā)明應用qPCR方法檢測豬瘟病毒的工作原理：由于豬屬于上皮絨毛胎盤，母豬和胎兒獨立血液循環(huán)系統(tǒng)，之間存在血胎盤屏障的緣故，正常的“臍帶血”是不含病原體和抗體物質(zhì)的即無存在任何各種病原的相關的基因片段，因此，可通過檢測“臍帶血”中是否存在豬瘟病毒的多聚蛋白來判斷帶毒不發(fā)病母豬的情況，仔豬不感染豬瘟病毒情況，母豬排毒情況即為陽性等，進而評價母豬的免疫水平及帶毒情況等。具體步驟為：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)RNA提??；(4)qPCR：利用本發(fā)明設計的特異性引物和探針進行qPCR反應；(5)判定結果。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的試劑盒具有以下有益效果：(1)采用本發(fā)明設計的引物和探針所建立的實時熒光PCR方法可對仔豬臍帶血中的豬瘟病毒野毒感染情況做診斷，從而可以評價母豬豬瘟疫苗的保護力，而且可以預測和預警仔豬感染豬瘟病毒野毒的狀況，為疾病防控提供有效的科學依據(jù)。(2)本發(fā)明的的實時熒光PCR方法更能直接，有效、綜合評價疫苗免疫母豬后的效果，與傳統(tǒng)的血清學抗體檢測評估相比更具有優(yōu)勢，克服血清學與牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病毒的交叉反應，該法也是血清學抗體評估疫苗效果的有效的補充，是非常好的疫苗評估質(zhì)量、免疫效果和免疫程序優(yōu)化的有力工具，可進一步推廣和臨床應用。(3)本發(fā)明的實時熒光PCR方法具有特異性強、靈敏度高、廣泛性強、可重復性好等優(yōu)點。該方法檢測過程中需要儀器設備相對簡單，不需要電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)及其分析軟件；檢測過程簡便，檢測時間短，做一次病原檢測僅需要3小時；結果相對可靠，不需要電泳，空氣中氣溶膠相對較少，不易污染；技術操作要求低，可以在基層大量推廣；可以相對容易質(zhì)量控制，易于標準化。(4)本發(fā)明的實時熒光PCR方法避免2次污染，技術操作更簡單，可定量和半定量分析，靈敏性和特異性更高，更加精準開展疾病預警，具有操作簡便、無應激，直觀、特異、快速和高精準的效果。附圖說明圖1為本發(fā)明診斷豬臍帶血豬瘟病毒的流程圖；圖2為本發(fā)明樣品中模板RNA的非變性瓊脂糖電泳圖；其中，M：Marker，泳道1-6：樣品中模板RNA；圖3為本發(fā)明豬瘟病毒多聚蛋白ORF基因序列的擴增電泳圖，其中，M：Marker，泳道1-3：豬瘟病毒多聚蛋白ORF基因序列；圖4為本發(fā)明陽性對照10倍稀釋的梯度標準曲線；圖5為本發(fā)明敏感性檢測結果圖；圖6為本發(fā)明特異性檢測結果圖；圖7為本發(fā)明重復性檢測結果圖。具體實施方式為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結合具體實施例，對本發(fā)明進一步詳細說明。實施例1本發(fā)明檢測豬臍帶血豬瘟病毒的流程圖如圖1所示。具體包括以下步驟：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)RNA提??；(4)實時熒光PCR：利用本發(fā)明設計的特異性引物和探針進行實時熒光PCR反應；(5)判定結果。1.樣品采集(1)取干凈的青霉素瓶和瓶塞，清洗干凈，煮沸滅菌30分鐘，烘干后收集備用；(2)當仔豬出生時，將每頭母豬分娩的所有仔豬的“臍帶血”都擠到一個干凈的青霉素瓶中，每頭仔豬3-5滴即可，將其“臍帶血”擠到青霉素瓶，密封；注意事項：①必須要采集同窩母豬產(chǎn)的所有的仔豬，避免同窩母豬所產(chǎn)仔豬的個體差異造成漏檢；②可以雙人操作，也可以單獨操作，若仔豬臍帶血不便擠出，可以將臍帶剪成幾段再操作即可；③若母豬分娩出現(xiàn)木乃伊，死胎時，同窩仔豬臍帶血重點檢測；④弱仔的臍帶血可以另外單獨再收集一份，重點檢測；(3)臍帶血收集完后蓋好瓶塞，用標簽紙或者醫(yī)用白膠布在青霉素瓶做好標記，注明采集時間、母豬耳號、胎次等信息；(4)將收集的臍帶血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷凍保存，送至實驗室檢測，并附上采集臍帶血樣品的數(shù)量、母豬耳號、需要檢測項目的清單。2.樣品中模板RNA提取臍帶血樣品模板RNA提取步驟如下：(1)取50-100mg豬臍帶血置1.5ml勻漿器中，加入1ml裂解液充分勻漿，室溫靜置5min；裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為0.1-0.2％；③吐溫20，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為1-2％；(2)加入0.6ml異丙醇和10μL磁珠(購自賽默飛公司)，振蕩15s，靜置2min；(3)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(4)加入0.5ml異丙醇，將EP管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min；(5)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(6)加入1ml質(zhì)量百分比濃度為70％的乙醇溶液，輕輕洗滌沉淀；將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(7)晾干，加入適量的DEPCH2O溶解(56℃促溶10～15min)；(8)快速電泳檢測RNA完整性。本發(fā)明在RNA提取環(huán)節(jié)中，使用鹽酸胍、SDS、吐溫20，NP40，異丙醇和質(zhì)量百分比濃度為70％的乙醇溶液等洗滌，可以有效降低去除溶血的干擾，獲得高質(zhì)量的核酸。依據(jù)上述方法提取6份隨機臍帶血樣品總RNA，RNA經(jīng)非變性瓊脂糖電泳后均能形成3條清晰條帶，分別為28S、18S與5.8/5S，條帶間拖帶不明顯，不見明顯蛋白和DNA污染，表明RNA提取完整，結果見圖2。RNA經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測，濃度均能達到0.132μg/μl以上，A260/A280比值均在1.9-2.0之間，表明RNA純度高、完整性好，具體數(shù)據(jù)見表1。表1RNA質(zhì)量檢測結果樣品編號體積(μl)濃度(μg/μl)總量(μg)A260/A280質(zhì)量評價001500.24812.41.93合格002500.23912.01.95合格003500.1628.11.90合格004500.25212.61.94合格005500.1326.61.91合格006500.1638.21.95合格3.引物和熒光探針采用實時熒光PCR方法診斷豬臍帶血豬瘟病毒，其引物和探針設計是關鍵。豬瘟病毒與同屬的牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病病毒存在共同抗原，在基因結構上同源性達60％以上，豬瘟病毒為單股RNA型，近些年已經(jīng)發(fā)生變異，所以設計檢測范圍更廣泛、特異性更強的引物和探針難度很大。發(fā)明人根據(jù)豬瘟病毒的多聚蛋白ORF基因序列設計以下引物和探針。上游擴增引物：5’-ATGCCCATAGTAGGACTA-3’(SEQIDNO:1)；下游擴增引物：5’-CTAGGGTTAAGGTGTGTC-3’(SEQIDNO:2)；特異性熒光探針：FAM-5’-CCTCGTCCACATAGCATCTCG-3’-TAMARA(SEQIDNO:3)，其中，F(xiàn)AM為熒光報告基因，TAMARA為熒光淬滅基因。上述引物和特異性熒光探針由華大基因合成并進行標記，用于擴增豬瘟病毒多聚蛋白ORF基因序列，目的片段為166bp左右，豬瘟病毒多聚蛋白ORF基因的核苷酸序列如下所示。ATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGGAGGGACTAGCCGTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCATGCCCAAGACACACCTTAACCCTAG(SEQIDNO:4)。4.陽性對照質(zhì)粒的構建與制備(1)按照商業(yè)試劑盒操作說明書提取豬瘟病毒RNA；以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2作為特異性引物擴增豬瘟病毒多聚蛋白ORF基因序列，反應條件為：94℃預變性1min；94℃變性15Sec，60℃退火2Sec，62℃延伸20Sec，共45個循環(huán)；然后25℃延伸10sec，最后4℃保護，結束反應。PCR產(chǎn)物于2％的瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定，結果如圖3所示；(2)PCR產(chǎn)物的純化、克隆及序列分析：PCR產(chǎn)物用AXYGEN公司的AxyPrepDNAGelExcractionKit膠回收試劑盒回收，然后酶切后與同樣酶切的pEASY-T1克隆載體進行連接，連接后轉(zhuǎn)化Trans1-T1PhageResistant化學感受態(tài)細胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12h-18h。經(jīng)藍白斑篩選后，用OMEGA公司的PlasmidMiniKit1質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，然后用引物進行擴增和測序，測序后比對成功的克隆質(zhì)粒命名pEASY-T1-CSFV-ORF?？寺≠|(zhì)粒用質(zhì)粒小提試劑盒進行提純，獲得定量標準質(zhì)粒。根據(jù)核酸蛋白檢測儀計測定A260和A280值計算質(zhì)粒濃度，并換算為質(zhì)?？截悢?shù)，克隆質(zhì)粒終濃度為1.0×105copies/μl～1.0×107copies/μl。5.本發(fā)明試劑盒的成分上游擴增引物：5’-ATGCCCATAGTAGGACTA-3’(SEQIDNO:1)；下游擴增引物：5’-CTAGGGTTAAGGTGTGTC-3’(SEQIDNO:2)；特異性熒光探針：FAM-5’-CCTCGTCCACATAGCATCTCG-3’-TAMARA(SEQIDNO:3)，其中，F(xiàn)AM為熒光報告基因，TAMARA為熒光淬滅基因；陽性對照：含有豬瘟病病毒多聚蛋白ORF基因序列的克隆質(zhì)粒pEASY-T1-CSFV-ORF；陰性對照：無DNA酶的ddH2O；2×熒光定量Mixture(含UNG酶系統(tǒng))。6.標準曲線的制作對克隆質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，使其為：108-101copies/μl，每個梯度重復三次進行實時熒光定量PCR。根據(jù)擴增結果制作標準曲線。圖4為本發(fā)明陽性對照10倍稀釋的梯度制作標準曲線圖，其中該標準曲線的參數(shù)如下：斜率：-3.27821，截距：41.16427，相關系數(shù)：0.99965，擴增效率：1.01857。制作標準曲線的相關系數(shù)R2大于0.99，斜率位于-3.1－-3.2之間，PCR擴增效率E位于1.0－1.1之間。7.檢測豬臍帶血豬瘟病毒本發(fā)明的實時熒光PCR反應體系和實時熒光PCR的反應條件如下：(1)實時熒光PCR反應體系以20μL計為：0.3μM的SEQIDNO:1所示的上游擴增引物：0.6μL；0.3μM的SEQIDNO:2所示的下游擴增引物：0.6μL；0.4μM的SEQIDNO:3所示的特異性熒光探針：0.4μL；2×熒光定量Mixture(含UNG酶系統(tǒng))：10μL；RNA模板：2μL；ddH2O：補足至20μL。同時設有陽性對照和陰性對照，陽性對照克隆質(zhì)粒：2μL，其余組分相同；陰性對照無DNA酶的ddH2O：2μL，其余組分相同。在PCR反應體系中加入2×熒光定量Mixture，其包括UNG酶系統(tǒng)，在擴增環(huán)節(jié)可以有效解決擴增污染現(xiàn)象，抗污染能力強等。(2)實時熒光PCR的反應條件95℃預變性1min；94℃變性15Sec，58℃退火45Sec，62℃延伸20Sec，收集熒光，共40個循環(huán)；然后25℃延伸10Sec，最后4℃保護，結束反應。8.結果分析：根據(jù)擴增結果判定：每次試驗的過程都要加入陽性對照及陰性對照。在陰性對照擴增無Ct值，陽性對照擴增Ct值≤30時，則結果判定成立，即陽性結果出現(xiàn)典型的擴增曲線；并且制作的標準曲線如圖4所示，R2大于0.99，斜率位于-3.1－-3.2之間，PCR擴增效率E位于1.0－1.1之間。若Ct值≤35，則判斷為豬瘟病毒陽性，即仔豬臍帶血中感染豬瘟病毒野毒，表明母豬存在排毒現(xiàn)象，疫苗保護力存在一定不足，建議加強免疫接種或調(diào)整免疫程序；若35<Ct值≤40為可疑，進行重復檢驗，若重復檢測結果仍為35<Ct值≤40，則判斷為豬瘟病毒陰性；無Ct值顯示，則判斷為豬瘟病毒陰性；即仔豬臍帶血中沒有感染豬瘟病毒，表明豬瘟疫苗免疫母豬保護力很好，且仔豬無感染豬瘟病毒，疫苗免疫效果和免疫程序很到位。實施例2靈敏度研究以陽性對照克隆質(zhì)粒評價本發(fā)明的試劑盒的靈敏度，將克隆質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，檢測范圍為108-101copies/μl。結果表明，該方法的檢測范圍為108-101copies/μl，在此范圍的豬瘟病毒含量可以得到可靠的結果，即該方法的靈敏度可以檢測到10個拷貝的豬瘟病毒病毒含量的樣品。檢測結果見圖5。實施例3特異性研究為了檢測本發(fā)明試劑盒的特異性，利用本發(fā)明的試劑盒檢測藍耳經(jīng)典株，豬細小病毒，豬輪狀病毒，豬傳染性胃腸炎病毒，豬圓環(huán)病毒，豬偽狂犬病毒，乙型腦炎，豬流行性腹瀉病毒等8種病毒。檢測結果表明：本發(fā)明的試劑盒僅對仔豬臍帶血中豬瘟病毒進行擴增，表明本發(fā)明試劑盒能特異性擴增豬瘟病毒，而不與其它核酸發(fā)生交叉反應。檢測結果見圖6。實施例4重復性研究選用陽性對照克隆質(zhì)粒106、105、104copies/μl，對每個濃度的樣本做3個重復，結果不同核酸濃度的檢測Ct值變異系數(shù)均＜1％，具有較好的重復性。檢測結果見表2和圖7。表2CSFV病毒實時熒光PCR檢測重復性試驗質(zhì)?？截悢?shù)(copies/μl)106105104Ct121.0524.3827.55Ct221.0324.4227.82Ct321.0824.0827.86Ctmean21.0524.2927.74SD0.030.190.17CV(％)0.120.760.61實施例5準確性研究采用本發(fā)明的豬瘟病毒實時熒光PCR試劑盒與普通豬瘟病毒PCR方法對已知陽性和陰性樣品(各10份)進行檢測，同時亦對未知背景的83份臨床仔豬臍帶血進行檢測。(1)陰、陽性樣品(各10份)的驗證使用本發(fā)明的豬瘟病毒實時熒光PCR試劑盒檢測10份陽性樣品，結果均為陽性，檢測10份陰性樣品，結果均為陰性，與普通PCR方法檢測結果一致(見表3)。表3本發(fā)明試劑盒與普通PCR對陰陽性樣品驗證結果(2)未知的臨床臍帶血檢測結果對疑似豬瘟發(fā)病豬場的83份臍帶血樣品進行檢測，結果見表4，其中CSFV實時熒光PCR檢測陽性13份，陰性70份，普通PCR檢測4份陽性，79份陰性。普通PCR檢測的4份陽性，實時熒光PCR檢測亦均為陽性，表明后者檢測靈敏度更高。表4本發(fā)明試劑盒與普通PCR檢測臨床樣品的結果綜上可見，本發(fā)明設計的一對特異性引物和一條熒光探針以及構成的試劑盒可以快速檢測豬臍帶血豬瘟病毒，能夠解決豬瘟病毒與同屬的牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病病毒存在基因交叉的問題，能更特異性的檢測豬瘟病毒，而且該檢測方法簡單、快速、特異性好、靈敏度高、可重復性好，檢測結果真實可靠。所屬領域的普通技術人員應當理解：以上任何實施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開的范圍(包括權利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實施例或者不同實施例中的技術特征之間也可以進行組合，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡明它們沒有在細節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3