本發(fā)明屬于常見病原菌快速檢測領(lǐng)域，涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測三種腸病毒試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)：

腸病毒是一類棲息于人類消化道病毒的總稱，包括小兒麻痹病毒、克沙奇A病毒、克沙奇B病毒、腸病毒等，共67種類型。腸病毒引發(fā)的疾病十分廣泛，不同類型的病毒可能會出現(xiàn)相同的癥狀。典型的癥狀包括皰疹性咽峽炎、手足口病、無菌性腦膜炎，比較嚴(yán)重的癥狀則包括心肌炎、心包膜炎、病毒性腦膜炎、肢體麻痹癥，最終可能導(dǎo)致癱瘓甚至死亡。每年的夏季和秋季是腸病毒爆發(fā)的高峰期，容易侵犯15歲以下兒童。尤其是三歲以下的幼兒，幾乎都沒有腸病毒的抗體，因此是腸病毒的高危人群。

目前，國內(nèi)的檢測試劑盒大都只針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)極易感染的EV-71進(jìn)行檢測，而忽略了同樣具有致病性的腸道病毒，如Cox A16、Cox B3等，且檢測步驟繁瑣，時間較長，特異性差，且需要特定的PCR儀。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測三種腸病毒試劑盒及檢測方法，該試劑盒特異性好，靈敏度高，能夠快速、準(zhǔn)確的檢測三種國內(nèi)常見的腸病毒；檢測方法簡單、易操作。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測三種腸病毒試劑盒，該試劑盒包括根據(jù)腸病毒Cox A16、Cox B3和EV71的VP1基因特異性序列設(shè)計的LAMP引物對，每種腸病毒的引物對都分別包括兩個內(nèi)引物，兩個外引物，以及兩條用于提高擴增效率的環(huán)引物。

其中，Cox A16-VP1引物序列如下：

正向外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

反向外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

正向內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

反向內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

環(huán)引物L(fēng)F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

環(huán)引物L(fēng)B的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

Cox B3-VP1引物序列如下：

正向外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

反向外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

正向內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

反向內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

環(huán)引物L(fēng)F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

環(huán)引物L(fēng)B的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

EV71-VP1引物序列如下：

正向外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

反向外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

正向內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

反向內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

環(huán)引物L(fēng)F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

環(huán)引物L(fēng)B的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

試劑盒內(nèi)包括：

1)LAMP反應(yīng)緩沖液，共23μl，由以下組分組成：

1×Thermopol反應(yīng)緩沖液，4-10U Bst 2.0DNA Polymerase，4-10U M-MuLV Reverse Transcriptase，0.8-1.6mM dNTP，2-14mM Mg²⁺，0.6-1.2M甜菜堿，0.8-1.6μM正反向內(nèi)引物FIP和BIP，0.15-0.3μM正反向外引物F3和B3，0.2-0.6μM正反向環(huán)引物L(fēng)F和LB，1μl指示劑；

2)陽性對照：2μl陽性模板，陽性模板為含有Cox A16、Cox B3及EV71各自VP1基因的質(zhì)粒；

3)陰性對照：2μl ddH₂O；

4)待測樣品檢測管：盛裝2μl待檢測樣品。

1×Thermopol反應(yīng)緩沖液中包括：20mM Tris-HCl、10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、2mM MgSO₄及0.1％Triton X-100；Tris-HCl的pH為8.8。

本發(fā)明還公開了基于上述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測三種腸病毒試劑盒進(jìn)行檢測的方法，包括以下步驟：

1)待檢樣品中腸病毒的提取或腸病毒RNA的提取

取咽拭子或皰滲出液，加入標(biāo)本保存液中，經(jīng)過10,000-12,000rpm，4℃離心10-30min，富集咽拭子或皰滲出液樣本中的腸病毒；或者，利用商業(yè)化試劑盒或傳統(tǒng)方法提取腸病毒RNA；

2)進(jìn)行腸球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)

首先，將提取的病毒RNA置于95-100℃金屬浴中5-10min后，立即置于冰上；然后，在裝有23μL LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2μL待檢模板RNA，并于60-65℃水浴鍋中恒溫擴增45-90min；最后，放入另一個85℃水浴鍋中，5-10min鐘后取出進(jìn)行檢測；

3)顯色檢測

將步驟2)得到的反應(yīng)產(chǎn)物置于500nm藍(lán)光LED透射儀上進(jìn)行檢測，反應(yīng)后溶液呈綠色的為陽性，若呈黃色則為陰性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明根據(jù)腸病毒毒力基因VP1的特異性序列設(shè)計LAMP引物，能夠快速準(zhǔn)確診斷出患者是否感染腸病毒，并能直接區(qū)分是Cox A16、Cox B3和EV71。該試劑盒使用6個區(qū)域4條引物，增強了反應(yīng)的特異性，同時其檢測靈敏度是普通PCR擴增技術(shù)的100倍以上。而且該反應(yīng)可以在恒溫條件下進(jìn)行，操作簡便，不需要昂貴的儀器設(shè)備，成本較低。在病原微生物檢測方面顯示出了極為廣闊的前景，同時本發(fā)明所使用的指示劑直接加在反應(yīng)緩沖體系中，能夠在反應(yīng)前判斷反應(yīng)緩沖液是否失效，反應(yīng)后無需開蓋，避免了氣溶膠引起的核酸污染。本發(fā)明的試劑盒成本低廉，不含有毒試劑，提高了檢測的覆蓋面，從而極大的保護(hù)了實驗室操作人員和患者以及環(huán)境的安全。在檢測EV71的同時，可以檢測如Cox A16、Cox B3等國內(nèi)常見腸病毒，促進(jìn)了腸病毒感染患者的精準(zhǔn)醫(yī)療。

附圖說明

圖1為LAMP檢測Cox A16、Cox B3和EV71的VP1基因引物特異性；

圖2為LAMP檢測Cox A16、Cox B3和EV71的VP1基因靈敏度。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。

本發(fā)明公開的三種腸病毒檢測試劑盒，包括：

a)LAMP反應(yīng)緩沖液，LAMP反應(yīng)緩沖液共23μl，由以下組分組成：1×Thermopol反應(yīng)緩沖液，8U Bst 2.0DNA Polymerase，6U M-MuLV Reverse Transcriptase，dNTP 1.5mM，Mg²⁺8mM，甜菜堿0.8M，正反向內(nèi)引物(FIP和BIP)1.2μM，正反向外引物(F3和B3)0.25μM，正反向環(huán)引物(LF和LB)0.5μM，1μl指示劑；

其中，1×Thermopol反應(yīng)緩沖液中各組分濃度分別為：20mM Tris-HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、2mM MgSO₄和0.1％Triton X-100；

b)陽性對照管：在LAMP反應(yīng)緩沖液的基礎(chǔ)上增加2μl陽性模板，陽性模板為含有Cox A16/Cox B3/EV71各自VP1基因的質(zhì)粒；

c)陰性對照管：在LAMP反應(yīng)緩沖液的基礎(chǔ)上增加2μl ddH₂O；

d)檢測管：在LAMP反應(yīng)緩沖液中加入2μl待檢測樣品；

使用上述試劑盒檢測三種腸病毒，其具體方法依次包括下列步驟：

1)待檢樣品的富集或RNA的提?。?/p>

取咽拭子或皰滲出液，加入標(biāo)本保存液中，經(jīng)過10,000rpm 4℃離心20min富集咽拭子或皰滲出液樣本中的腸病毒，上清中即包含病毒樣本。該病毒樣本可以經(jīng)過100℃水浴15min后立即放入冰上，立即檢測；

或使用陜西脈元生物科技有限公司Total RNA Isolation Kit試劑盒提取純化病毒RNA，經(jīng)過RNA提取試劑盒純化的RNA可以放入-20℃保存，集中進(jìn)行檢測。

2)進(jìn)行腸球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)：

a：將待檢測樣品置于95℃金屬浴中5min，然后立即置于冰上；

b：在裝有23μL LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2μL待檢模板DNA，并于63℃水浴鍋中恒溫擴增60min；

c：放入另一個85℃水浴鍋中，8min鐘后取出進(jìn)行檢測；

3)顯色檢測：

將反應(yīng)產(chǎn)物置于500nm藍(lán)光LED透射儀上進(jìn)行檢測，反應(yīng)后溶液呈綠色的為陽性，若呈黃色則為陰性。

實施例1：本發(fā)明試劑盒的特異性檢

采用發(fā)明中的LAMP引物和試劑盒中的LAMP反應(yīng)緩沖液進(jìn)行特異性檢測，具體方法如下：

以Cox A16(ATCC VR-1022AS/HO)、Cox B3(ATCC VR-1034AR/MK)、EV71(ATCC VR-1432)作為標(biāo)準(zhǔn)病毒株，4株腸病毒(ATCC VR-836，ATCC VR-1077，ATCC VR-755，ATCC VR-360)作為參考病毒株，并選擇其他6株非腸病毒進(jìn)行特異性實驗。所有病毒接種于生長狀況良好的大腸桿菌菌液中，37℃過夜培養(yǎng)。取1ml培養(yǎng)液，使用陜西脈元生物科技有限公司Total RNA Isolation Kit分離純化RNA，然后置于100℃金屬浴中10min，立即置于冰上，作為模板。

取2μl制備好的模板，分別加入到檢測Cox A16、Cox B3和EV71的VP1基因的反應(yīng)管中，63℃反應(yīng)60min。然后85℃反應(yīng)10min，終止反應(yīng)。

反應(yīng)結(jié)果參見圖1圖1中，1:Cox A16標(biāo)準(zhǔn)病毒株ATCC VR-1022AS/HO；2：Cox B3標(biāo)準(zhǔn)病毒株ATCC VR-1034AR/MK；3：EV71標(biāo)準(zhǔn)病毒株ATCC VR-1432；4-7：腸病毒參考病毒株ATCC VR-836、ATCC VR-1077、ATCC VR-755、ATCC VR-360；8：巨細(xì)胞病毒；9：單純皰疹病毒1型；10：單純皰疹病毒2型；11：人皰疹病毒6型；12：人雙?？刹《荆?3：水痘帶狀皰疹病毒；14：ddH₂O。

結(jié)果顯示：本發(fā)明針對Cox A16、Cox B3和EV71的VP1基因所設(shè)計的LAMP引物能夠特異性識別Cox A16、Cox B3和EV71，說明本發(fā)明的試劑盒在檢測過程中不會出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。

實施例2：本發(fā)明試劑盒靈敏度檢測

通過PCR擴增Cox A16、Cox B3和EV71的VP1基因序列，經(jīng)過DNA凝膠回收后，酶切連接到pUC57載體上，然后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過氨芐抗性平板篩選培養(yǎng)后，挑取陽性克隆測序驗證。測序正確的克隆經(jīng)過LB液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，并測定濃度。

將質(zhì)粒濃度梯度稀釋為10ng/μl，1ng/μl，100fg/μl，10fg/μl，1fg/μl，0.1fg/μl，0.01fg/μl，陰性對照組為ddH₂O。

具體操作同實施例1，結(jié)果參見圖2，圖2中，1：10ng/μl；2：1ng/μl；3：100fg/μl；4：10fg/μl；5：1fg/μl；6：0.1fg/μl；7：0.01fg/μl；8:ddH₂O。

結(jié)果顯示，本發(fā)明的引物和LAMP反應(yīng)體系，可以檢測到1fp/μl，在試劑操作中能夠滿足臨床需求，且不會造成漏檢而耽誤病情。

實施例3：臨床樣本檢測

取50例病人咽拭子，進(jìn)行檢測，具體操作同實施例1，結(jié)果表1：

表1

結(jié)果顯示，本發(fā)明的試劑盒能夠快速準(zhǔn)確的檢測三種腸病毒，檢測結(jié)果與RT-PCR擴增的結(jié)果一致，不存在假陽性和漏檢。