本發(fā)明屬于發(fā)酵食品技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一株釀酒酵母及提高稀有皂苷的人參發(fā)酵方法。

背景技術(shù)：

人參營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，具有抗輻射、抗衰老、抗癌等多種功效，其主要有效成分是人參皂苷。人參皂苷的代謝產(chǎn)物更易透過(guò)腸道黏膜，被人體吸收利用，提高了藥效。通過(guò)化學(xué)法、酶法和微生物轉(zhuǎn)化法對(duì)人參皂苷進(jìn)行定向改造，水解其糖苷鍵，減少高含量人參皂苷的糖基數(shù)量，從而制備獲得各種糖基數(shù)量較少的稀有人參皂苷，使人參具有更高的經(jīng)濟(jì)效益。微生物轉(zhuǎn)化具有培養(yǎng)簡(jiǎn)單、種類繁多、酶系豐富的優(yōu)點(diǎn)，并且微生物轉(zhuǎn)化法價(jià)格低廉，副產(chǎn)物少，反應(yīng)條件溫和。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh1明顯提高體外培養(yǎng)神經(jīng)元的活力，具有促進(jìn)周圍神經(jīng)軸突生長(zhǎng)作用，不同劑量的人參皂苷Rh1均能明顯減少結(jié)扎冠狀動(dòng)脈所致大鼠急性心肌缺血引起的心肌梗死面積，揭示了人參皂苷Rh1對(duì)心肌具有保護(hù)作用，能降低缺血引起的心肌損，人參皂苷Rh1無(wú)論在離體或整體條件下均具有抗腫瘤作用。研究表明。人參皂苷Rh2具有抗過(guò)敏、抗腫瘤等生物活性，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等。另外，人參皂苷Rg3具有抑制腫瘤細(xì)胞的粘附、浸潤(rùn)、增殖以及抗腫瘤新生血管的形成，從而也具有顯著的抗腫瘤作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提高人參的稀有皂苷的含量，而提供了一株釀酒酵母及提高稀有皂苷的人參發(fā)酵方法。

一株釀酒酵母，它的保藏編號(hào)為：CCTCC M 2016373；

一株釀酒酵母在提高發(fā)酵人參液稀有皂苷的含量中的應(yīng)用；

提高稀有皂苷的人參發(fā)酵方法，它包括：將保藏編號(hào)為CCTCC M 2016373釀酒酵母的種子發(fā)酵液，按2-4%接種量接種于人參液，發(fā)酵條件為：25-34℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為80-130r/min，發(fā)酵24-60h；所述的人參液為人參加水打漿；

所述的人參液為:選取新鮮人參清洗后晾干，置于高壓滅菌鍋內(nèi)，121℃維持40min，打開(kāi)滅菌鍋取出人參；按人參：水=1：1打漿，121℃，20min滅菌冷藏；

所述的發(fā)酵條件為：27-29℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為90-110r/min，發(fā)酵30-42h；

本發(fā)明提供了一株釀酒酵母及提高稀有皂苷的人參發(fā)酵方法，它包括：將保藏編號(hào)為CCTCC M 2016373釀酒酵母的種子發(fā)酵液，按2-4%接種量接種于人參液，發(fā)酵條件為：25-34℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為80-130r/min，發(fā)酵24-60h；所述的人參液為人參加水打漿。與普通釀酒酵母相比，人參發(fā)酵液中Rg3、Rh1+Rg2、Rh2、R0的含量都有很大的提高。

附圖說(shuō)明

圖1菌株的革蘭氏染色形態(tài)；

圖2 菌株的PCR 擴(kuò)增片段圖譜；

圖3 菌株的同源性比對(duì)數(shù)據(jù)分析；

圖4 人參皂苷的薄層鑒別（1. 混合標(biāo)品，2. Rg1，3. Rg3，4. Rh1，5. Rh2，6. Re，7. Rd，8. Rb1，9. F1，10. F2，11. R0，12. Rf，13. 未發(fā)酵人參液，14. 釀酒酵母標(biāo)準(zhǔn)株CICC 1001發(fā)酵人參液，15. 釀酒酵母CCTCC M 2016373發(fā)酵人參液）；

圖5 HPLC-PDA法測(cè)定的人參皂苷含量。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 菌株的分離與鑒定

（1）菌株的分離

取100μL自制冰葡萄酒（來(lái)源于：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室）涂布于滅菌PDA固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48h后挑取疑似酵母菌單獨(dú)菌落，并進(jìn)行生理生化鑒定及26 SrRNA鑒定，確定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），于2016年7月4日，保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號(hào)武漢大學(xué)校內(nèi)，武漢大學(xué)保藏中心，郵政編碼：430072，編號(hào)為 CCTCC M 2016373；將釀酒酵母 CCTCC M 2016373接種于液體的無(wú)菌PDA培養(yǎng)基，在28℃溫度下培養(yǎng)24h，活化后繼續(xù)傳代兩次，每次接種量為3%，待菌種充分活化后，4℃冷藏待用。

（2）菌株的鑒定

從自制冰葡萄酒中篩選的菌株革蘭氏染色結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性菌，如圖1所示，形態(tài)為球形或卵形；通過(guò)上海申工公司對(duì)菌液進(jìn)行PCR，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，如圖2所示，在500bp至600bp處存在特異性條帶。然后對(duì)擴(kuò)增、純化后的26S rRNA進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)定該序列長(zhǎng)為588bp，該菌株的26S rRNA序列在核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp上進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果如圖3所示，該菌株的26S rRNA 與Saccharomyces cerevisiae strain 21B45 (KR069090.1)的26S rRNA具有較高的同源性，證實(shí)該菌株為釀酒酵母。

實(shí)施例2 利用菌株發(fā)酵提取人參皂苷

（1）人參液的制備

選取新鮮人參清洗后晾干，置于高壓滅菌鍋內(nèi)，121℃維持40min，打開(kāi)滅菌鍋取出人參；按人參：水=1：1打漿，121℃，20min滅菌冷藏。

（2）利用發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵人參液

將實(shí)施例1中獲取的釀酒酵母 CCTCC M 2016373種子發(fā)酵液按3%接種量接種于人參液，進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵條件為：28℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為90r/min，時(shí)間為48h。人參發(fā)酵液凍干成粉末，待用。

（3）人參皂苷的提取

取發(fā)酵人參粉末約1g，精密稱定，置索氏提取裝置中，加三氯甲烷加熱回流3小時(shí)，棄去三氯甲烷溶液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入100ml錐形瓶中，精密加水飽和正丁醇50ml，密塞，放置過(guò)夜，超聲處理（功率250W，頻率50Hz）30分鐘，過(guò)濾，精密稱取濾液25ml，置于蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)?5%甲醇溶液4ml，溶解并轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中，加入95%甲醇稀釋至刻度，搖勻，既得人參皂苷樣品。

實(shí)施例3 人參皂苷含量測(cè)定

（1）薄層色譜法測(cè)定人參皂苷含量

采用實(shí)施例2中的方法，對(duì)未發(fā)酵的人參液和利用標(biāo)準(zhǔn)株CICC1001發(fā)酵的人參液進(jìn)行皂苷提取，將提取的皂苷與上述釀酒酵母 CCTCC M 2016373種子發(fā)酵液提取的皂苷樣品一起點(diǎn)于薄層層析板。點(diǎn)樣步驟：點(diǎn)樣位置為距薄層板底端1cm處，間距為7-8mm，吹干后置于展開(kāi)劑中使其上行展層，展開(kāi)劑是體積比為三氯甲烷：甲醇：水=10:5:1溶液，展層完畢后用10%硫酸溶液噴灑染色，并在烘箱中于105℃加熱5min使皂苷顯色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，釀酒酵母 CCTCC M 2016373發(fā)酵人參液后，其稀有皂苷Rg3、Rh1和R0 的含量顯著增加。

（2）HPLC-PDA法測(cè)定人參皂苷含量

采用實(shí)施例2中的方法，對(duì)未發(fā)酵的人參液、利用標(biāo)準(zhǔn)株CICC1001發(fā)酵的人參液和利用釀酒酵母 CCTCC M 2016373人參發(fā)酵液進(jìn)行皂苷提取，采用二極管陣列檢測(cè)器高效液相法（HPLC-PDA）測(cè)定人參中人參皂苷單體的含量，用Unitary C18色譜柱（4.6mmX250mm，5μm），以乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)梯度洗脫(見(jiàn)表1)，流速為1.3ml/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)203nm，結(jié)果如圖5所示，釀酒酵母 CCTCC M 2016373人參發(fā)酵液中Rg3的含量比未發(fā)酵的人參液提高了2.5倍；Rh1+Rg2的含量比未發(fā)酵的人參液提高了1.5倍；Rh2的含量比未發(fā)酵的人參液提高了1.5倍；R0的含量比未發(fā)酵的人參液提高了9倍且含量高達(dá)0.26%。

<110> 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一株釀酒酵母及提高稀有皂苷的人參發(fā)酵方法

<160> 1

<210> 1

<211> 588

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

gacgggcggc atataaccat tatgccagca tccttgactt acgtcgcagt cctcagtccc 60

agctggcagt attcccacag gctataatac ttaccgaggc aagctacatt cctatggatt 120

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