本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種裂殖壺菌菌體殘渣的利用方法。
背景技術(shù)：
：二十二碳六烯酸(DHA)屬于n-3系列的多不飽和脂肪酸，其是人體自身不能合成但又不可缺少的重要營養(yǎng)素。DHA具有促進(jìn)腦部及視力發(fā)育，提高智力，改善記憶力和視力的作用。DHA的來源路徑主要有兩種，一種來源路徑為傳統(tǒng)深海魚油的提取純化，而深海魚油資源隨季節(jié)變化供應(yīng)受限，產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足市場需求，且近年來，隨著海洋環(huán)境遭到嚴(yán)重污染，致使其安全性無法得到保障。基于深海魚油的以上弊端，人們已經(jīng)逐漸將注意力轉(zhuǎn)移到一些低等海洋微生物，如破囊壺菌(Thraustochytrium)、裂殖壺菌(Schizochytrium)、寇氏隱甲藻(Crythecodiniumcohnii)等都能在體內(nèi)合成DHA。由于海洋微生物具有生長繁殖速度快、油脂含量高、且易于進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)等特點，成為發(fā)酵工業(yè)上規(guī)?；a(chǎn)DHA的首選方式?，F(xiàn)目前，微生物法獲取DHA油脂的主要來源是利用裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)，通過對裂殖壺菌菌體的大量積累，然后對其進(jìn)行機(jī)械破壁或者酶解破壁處理后，獲得富含DHA的油脂。因為裂殖壺菌體內(nèi)所含油脂僅占菌體總質(zhì)量的30-60％，從而在獲取大量DHA油脂的同時，致使裂殖壺菌菌體殘渣得到大量的堆積。裂殖壺菌菌體殘渣中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括少量的碳源、豐富的有機(jī)氮源以及其他微量元素等。菌體殘渣的堆積，一方面不利于DHA發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展，且對環(huán)境造成一定的污染。為此，研究者進(jìn)行了有關(guān)裂殖壺菌菌體殘渣的應(yīng)用研究，如中國專利CN102965396A公開了一種含正己烷的裂殖壺菌菌體殘渣的應(yīng)用，通過對正己烷萃取后的裂殖壺菌菌體殘渣與稻草共發(fā)酵產(chǎn)沼氣，從而實現(xiàn)菌體殘渣的再利用。但該應(yīng)用附加值較低，對DHA發(fā)酵產(chǎn)業(yè)本身技術(shù)的升級貢獻(xiàn)較小。另外，裂殖壺菌菌體殘渣與稻草共發(fā)酵產(chǎn)生沼氣后，剩余的殘渣混合物仍存在堆積的問題，對環(huán)境仍有一定程度的污染。盡管現(xiàn)有技術(shù)CN200910063369.6公開了一種重復(fù)利用高山被孢霉菌粕制備花生四烯酸的方法，但是高山被孢霉為絲狀真菌，生長周期長，利用高山被孢霉菌粕充當(dāng)培養(yǎng)基中發(fā)酵氮源的處理過程極為復(fù)雜。首先，發(fā)酵完成后的高山被孢霉菌體需要進(jìn)行過濾收集菌體，隨后，又需要對其進(jìn)行膨化、粉碎處理，菌體經(jīng)粉碎后，還需要進(jìn)行酶解處理后才能用于發(fā)酵培養(yǎng)，該技術(shù)工藝復(fù)雜、處理繁瑣，成本過高，且對于提取花生四烯酸油脂后菌體中殘余的非極性溶劑問題未進(jìn)行表述，從而致使該技術(shù)不適用于工業(yè)化(例如100L發(fā)酵規(guī)模)應(yīng)用。基于裂殖壺菌與高山被孢霉菌生物特性的本質(zhì)區(qū)別、及后續(xù)發(fā)酵工藝的顯著差異，CN200910063369.6所示的技術(shù)方案難以為裂殖壺菌菌渣的再利用提供技術(shù)參照。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種裂殖壺菌菌體殘渣的利用方法，能夠充分利用裂殖壺菌菌體殘渣中的多種營養(yǎng)物質(zhì)，盡可能實現(xiàn)裂殖壺菌菌體殘渣應(yīng)用的高附加值。本發(fā)明通過對經(jīng)過酶法破壁處理并經(jīng)三相分離技術(shù)提取油脂后的菌體進(jìn)行再利用，將其直接應(yīng)用到裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，充當(dāng)部分發(fā)酵氮源，用于裂殖壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)。在本發(fā)明中，裂殖壺菌為球狀真菌，生長速度快，發(fā)酵周期短。裂殖壺菌在被應(yīng)用于充當(dāng)發(fā)酵氮源的處理過程及工藝極為簡單，僅需要經(jīng)過酶解破壁，再利用三相分離技術(shù)提取出DHA油脂后，剩余的裂殖壺菌菌體殘渣即可直接用于發(fā)酵培養(yǎng)基中。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：第一方面，本發(fā)明提供一種裂殖壺菌菌體殘渣作為裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分的用途。優(yōu)選地，所述組成成分具體指作為氮源成分。優(yōu)選地，所述裂殖壺菌菌體殘渣具體為DHA油脂經(jīng)提取后產(chǎn)生的裂殖壺菌殘留物。更具體地，所述裂殖壺菌菌體殘渣是裂殖壺菌菌體經(jīng)酶解破壁、再利用三相分離技術(shù)提取出DHA油脂后產(chǎn)生的裂殖壺菌殘留物。第二方面，本發(fā)明提供一種含有裂殖壺菌菌體殘渣的裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基，含裂殖壺菌菌體殘渣液的體積濃度為5-20％；其中，所述裂殖壺菌菌體殘渣液中裂殖壺菌菌體殘渣的質(zhì)量濃度為30-50％。上述參數(shù)的限定不會改變發(fā)酵體系的粘度和整體性質(zhì)，且對裂殖壺菌的發(fā)酵結(jié)果無不良影響，因此，含裂殖壺菌菌體殘渣液的體積濃度為5-20％；其中，所述裂殖壺菌菌體殘渣液中裂殖壺菌菌體殘渣的質(zhì)量濃度為30-50％。優(yōu)先地，根據(jù)裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳碳氮比及裂殖壺菌菌體殘渣中和酵母粉中有機(jī)氮的含量，當(dāng)向培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為30-50％的裂殖壺菌菌體殘渣液5-20％時，相應(yīng)的，此時，培養(yǎng)基中酵母粉濃度則降為原先濃度的20-60％。優(yōu)選地，所述裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基的組分包括：葡萄糖40.0-80.0g/L，酵母粉xg/L，MgSO4·7H2O0.2-1.0g/L，KH2PO40.5-2.0g/L，(NH4)2SO40-5.0g/L，NaNO31.0-5.0g/L，Na2SO42.0-10.0g/L，壺菌菌體殘渣液在裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基所占的體積百分?jǐn)?shù)為5-20％(v/v)；其中，x＝(5.0-15.0)*(20-60)％。第三方面，本發(fā)明提供一種用所述裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行裂殖壺菌發(fā)酵的方法，將裂殖壺菌的種子液接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)，即可。優(yōu)選地，所述種子液的接種量為所述發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5-10％。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述種子液的接種量為所述發(fā)酵培養(yǎng)基體積的8％。經(jīng)過一系列接種量的優(yōu)化實驗，當(dāng)種子液接種量為8％時，此時發(fā)酵培養(yǎng)過程中的延遲期最短，發(fā)酵周期也因此變?yōu)樽疃蹋野l(fā)酵結(jié)束后獲取的DHA含量及產(chǎn)量均為最高，因此做此優(yōu)選方案。優(yōu)選地，所述種子液是將裂殖壺菌接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得；其中，所述種子培養(yǎng)基包括組分如下：葡萄糖20.0-40.0g/L，酵母粉5.0-10.0g/L，牛肉膏0-3.0g/L，蛋白胨2-8.0g/L，MgSO4·7H2O0.2-1.0g/L，KH2PO40.2-1.0g/L，海水晶5.0-20.0g/L與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：本發(fā)明的優(yōu)點在于處理簡便，簡單易行。通過裂殖壺菌菌體殘渣的再利用，可節(jié)約培養(yǎng)基中原有發(fā)酵氮源酵母粉的用量，且對裂殖壺菌的發(fā)酵生長及DHA產(chǎn)量無影響，從而在實現(xiàn)裂殖壺菌菌體殘渣的再利用的同時，也節(jié)約了裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)DHA的發(fā)酵成本，實現(xiàn)了裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)DHA產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展，實現(xiàn)了該產(chǎn)業(yè)的技術(shù)升級，也實現(xiàn)了對環(huán)境的保護(hù)。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明方法的具體實現(xiàn)步驟為：(1)將低溫凍存的裂殖壺菌種活化培養(yǎng)成裂殖壺菌種子液；活化培養(yǎng)所采用的種子培養(yǎng)基可以采用現(xiàn)有技術(shù)提供的各種組分，其優(yōu)選的組分(g/L)為：葡萄糖20.0-40.0，酵母粉5.0-10.0，牛肉膏0-3.0蛋白胨2-8.0，MgSO4·7H2O0.2-1.0，KH2PO40.2-1.0，海水晶5.0-20.0。(2)將所述裂殖壺菌種子液按照體積百分比5％-10％(優(yōu)選8％)接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基可以采用現(xiàn)有技術(shù)提供的各種組分，發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選的組分(g/L)為：葡萄糖40.0-80.0，酵母粉5.0-15.0，MgSO4·7H2O0.2-1.0，KH2PO40.5-2.0，(NH4)2SO40-5.0，NaNO31.0-5.0，Na2SO42.0-10.0。(3)結(jié)束發(fā)酵后，對裂殖壺菌菌體進(jìn)行富集處理。(4)對富集后的裂殖壺菌菌體進(jìn)行破壁處理，裂殖壺菌菌體破壁的方法可以是酶法破壁，用于裂殖壺菌破壁的酶可以是堿性蛋白酶、纖維素酶及果膠酶的一種或者幾種。(5)對破壁處理后的裂殖壺菌菌體進(jìn)行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分離技術(shù)，得到富含二十二碳六烯酸的油脂進(jìn)行甲酯化后的氣相檢測分析，可以得到DHA的含量。(6)DHA油脂提取完成后，將剩下的裂殖壺菌菌體殘渣用自來水進(jìn)行稀釋，充當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)，且裂殖壺菌菌體殘渣液中水的含量不得高于50-70％(質(zhì)量含量)，使剩余菌體殘渣的質(zhì)量濃度為30％-50％，并直接添加至下一批用于培養(yǎng)裂殖壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，用于裂殖壺菌的培養(yǎng)。剩余菌體殘渣，可以充當(dāng)發(fā)酵氮源，直接用于下一批次的裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，且添加量為發(fā)酵液體積的5％-20％。同時，發(fā)酵培養(yǎng)基中原先的發(fā)酵氮源酵母粉濃度降至先前濃度的20％-60％。(7)添加有裂殖壺菌菌體殘渣的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)裂殖壺菌后，裂殖壺菌經(jīng)過菌體的富集、破壁及提取DHA油脂后，剩下的裂殖壺菌菌體殘渣可繼續(xù)循環(huán)使用，充當(dāng)下一批裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)。其中，步驟(3)、(4)均可以采用現(xiàn)有技術(shù)的方案，在此不再贅述。本發(fā)明的方法適用于各種裂殖壺菌菌體殘渣，為了更加清楚的對
發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行解釋說明，下述實施例使用了專利CN104450809A(專利申請?zhí)枮镃N201410667537.3，發(fā)明名稱為一種促進(jìn)裂殖壺菌油脂中DHA合成的方法)中披露的裂殖壺菌，該專利中披露了如下菌株“裂殖壺菌(Schizochytriumsp)S056,于2013年9月29日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCM2013459”,下述實施例闡述本發(fā)明裂殖壺菌菌體殘渣的利用方法；但需要說明的是，本發(fā)明的實施對象是裂殖壺菌菌體殘渣，利用的是裂殖壺菌菌體的蛋白構(gòu)成屬性、將其充當(dāng)?shù)?，所以菌株的具體種類并不局限于CN104450809A中所述的具體菌株。實施例1-4分別提供了本發(fā)明技術(shù)方案在三角瓶搖床級別上的具體實現(xiàn)步驟。實施例1(1)在250mL三角瓶中加入50mL種子培養(yǎng)基。接入低溫凍存的裂殖壺菌種，在培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)2天，將低溫凍存的裂殖壺菌種活化成裂殖壺菌種子液；種子培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖20.0，酵母粉5.0，牛肉膏3.0，蛋白胨2.0，MgSO4·7H2O0.2，KH2PO41.0，海水晶5.0。(2)將DHA油脂提取完成后剩下的裂殖壺菌菌體殘渣進(jìn)行稀釋，充當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)，剩余菌體殘渣稀釋的質(zhì)量濃度為30％，并直接添加至下一批用于培養(yǎng)裂殖壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，充當(dāng)發(fā)酵氮源，用于裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，且添加量為發(fā)酵液體積的20％。同時，發(fā)酵培養(yǎng)基中原先的發(fā)酵氮源酵母粉濃度降至先前濃度的20％。發(fā)酵培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖40.0，酵母粉1.0，MgSO4·7H2O0.2，KH2PO42.0，NaNO35.0，Na2SO42.0，質(zhì)量濃度為30％的裂殖壺菌菌體殘渣稀釋液20％；CK(g/L)：葡萄糖40.0，酵母粉5.0，MgSO4·7H2O0.2，KH2PO42.0，NaNO35.0，Na2SO42.0；每種不同的培養(yǎng)基配制3個平行樣，121℃，滅菌25min，冷卻備用；(3)在250mL三角瓶中加入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，將裂殖壺菌以10％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，26℃恒溫培養(yǎng)3天，轉(zhuǎn)速200rpm；(4)連續(xù)培養(yǎng)3天后結(jié)束發(fā)酵，結(jié)束發(fā)酵后，對發(fā)酵液進(jìn)行5000g離心，收集濕菌體并置于恒溫水浴鍋中，在溫度為80℃，菌液pH為10條件下，用堿性蛋白酶進(jìn)行破壁處理，并用磁力攪拌器持續(xù)攪拌，處理時間約5小時，直至菌體破壁完全。(5)對破壁處理后的裂殖壺菌菌體進(jìn)行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分離技術(shù)，得到富含二十二碳六烯酸的油脂進(jìn)行甲酯化后的氣相檢測分析，得到DHA的含量。發(fā)酵結(jié)果如下所示：表1菌體殘渣再利用組和對照組發(fā)酵結(jié)果對比由表1結(jié)果可知，與對照組相比，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的裂殖壺菌菌體殘渣可以很好地替代部分酵母粉，且對發(fā)酵結(jié)果無任何影響。實施例2(1)在250mL三角瓶中加入50mL種子培養(yǎng)基。接入低溫凍存的裂殖壺菌種，在培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)2天，將低溫凍存的裂殖壺菌種活化成裂殖壺菌種子液；種子培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖30.0，酵母粉7.0，牛肉膏2.0，蛋白胨5.0，MgSO4·7H2O0.6，KH2PO40.6，海水晶10.0。(2)將DHA油脂提取完成后剩下的裂殖壺菌菌體殘渣進(jìn)行稀釋，充當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)，剩余菌體殘渣稀釋的質(zhì)量濃度為40％，并直接添加至下一批用于培養(yǎng)裂殖壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，充當(dāng)發(fā)酵氮源，用于裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，且添加量為發(fā)酵液體積的10％。同時，發(fā)酵培養(yǎng)基中原先的發(fā)酵氮源酵母粉濃度降至先前濃度的40％。發(fā)酵培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖60.0，酵母粉4.0，MgSO4·7H2O0.6，KH2PO41.2，(NH4)2SO43.0，NaNO33.0，Na2SO46.0，質(zhì)量濃度為40％的裂殖壺菌菌體殘渣稀釋液10％；CK(g/L)：葡萄糖60.0，酵母粉10.0，MgSO4·7H2O0.6，KH2PO41.2，(NH4)2SO43.0，NaNO33.0，Na2SO46.0；每種不同的培養(yǎng)基配制3個平行樣，121℃，滅菌25min，冷卻備用；(3)在250mL三角瓶中加入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，將裂殖壺菌以8％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，26℃恒溫培養(yǎng)3天，轉(zhuǎn)速200rpm；(4)連續(xù)培養(yǎng)3天后結(jié)束發(fā)酵，結(jié)束發(fā)酵后，對發(fā)酵液進(jìn)行5000g離心，收集濕菌體并置于恒溫水浴鍋中，在溫度為60℃，菌液pH為5-7條件下，用纖維素酶進(jìn)行破壁處理，并用磁力攪拌器持續(xù)攪拌，處理時間約5小時，直至菌體破壁完全。(5)對破壁處理后的裂殖壺菌菌體進(jìn)行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分離技術(shù)，得到富含二十二碳六烯酸的油脂進(jìn)行甲酯化后的氣相檢測分析，得到DHA的含量。發(fā)酵結(jié)果如下所示：表2菌體殘渣再利用組和對照組發(fā)酵結(jié)果對比由表2結(jié)果可知，裂殖壺菌菌體殘渣的添加應(yīng)用，可以很好地充當(dāng)發(fā)酵有機(jī)氮源被裂殖壺菌利用，且對DHA的最終產(chǎn)量基本無影響。實施例3(1)在250mL三角瓶中加入50mL種子培養(yǎng)基。接入低溫凍存的裂殖壺菌種，在培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)2天，將低溫凍存的裂殖壺菌種活化成裂殖壺菌種子液；種子培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖40.0，酵母粉10.0，蛋白胨8.0，MgSO4·7H2O1.0，KH2PO40.2，海水晶20.0。(2)將DHA油脂提取完成后剩下的裂殖壺菌菌體殘渣進(jìn)行稀釋，充當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)，剩余菌體殘渣稀釋的質(zhì)量濃度為50％，并直接添加至下一批用于培養(yǎng)裂殖壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，充當(dāng)發(fā)酵氮源，用于裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，且添加量為發(fā)酵液體積的5％。同時，發(fā)酵培養(yǎng)基中原先的發(fā)酵氮源酵母粉濃度降至先前濃度的60％。發(fā)酵培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖80.0，酵母粉9.0，MgSO4·7H2O1.0，KH2PO40.5，(NH4)2SO45.0，NaNO31.0，Na2SO410.0，質(zhì)量濃度為50％的裂殖壺菌菌體殘渣稀釋液5％；CK(g/L)：葡萄糖80.0，酵母粉15.0，MgSO4·7H2O1.0，KH2PO40.5，(NH4)2SO45.0，NaNO31.0，Na2SO410.0；每種不同的培養(yǎng)基配制3個平行樣，121℃，滅菌25min，冷卻備用；(3)在250mL三角瓶中加入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，將裂殖壺菌以10％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，26℃恒溫培養(yǎng)3天，轉(zhuǎn)速200rpm；(4)連續(xù)培養(yǎng)3天后結(jié)束發(fā)酵，結(jié)束發(fā)酵后，對發(fā)酵液進(jìn)行5000g離心，收集濕菌體并置于恒溫水浴鍋中，在溫度為50℃，菌液pH為5條件下，用果膠酶進(jìn)行破壁處理，并用磁力攪拌器持續(xù)攪拌，處理時間約5小時，直至菌體破壁完全。(5)對破壁處理后的裂殖壺菌菌體進(jìn)行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分離技術(shù)，得到富含二十二碳六烯酸的油脂進(jìn)行甲酯化后的氣相檢測分析，得到DHA的含量。發(fā)酵結(jié)果如下所示：表3菌體殘渣再利用組和對照組發(fā)酵結(jié)果對比發(fā)酵碳源生物量(g/L)油脂含量(％)DHA含量(％)DHA產(chǎn)量(g/L)對照組35.4±1.348.4±1.238.3±0.96.56±0.74菌體殘渣再利用組36.2±0.748.1±0.938.5±0.36.70±0.35由表3結(jié)果可知，通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加裂殖壺菌菌體殘渣，裂殖壺菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，與對照組相比，發(fā)酵結(jié)果基本一致。實施例4(1)在250mL三角瓶中加入50mL種子培養(yǎng)基。接入低溫凍存的裂殖壺菌種，在培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)2天，將低溫凍存的裂殖壺菌種活化成裂殖壺菌種子液；種子培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖35.0，酵母粉8.0，牛肉膏1.5，蛋白胨6.0，MgSO4·7H2O0.8，KH2PO40.8，海水晶15.0。(2)將DHA油脂提取完成后剩下的裂殖壺菌菌體殘渣進(jìn)行稀釋，充當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)，剩余菌體殘渣稀釋的質(zhì)量濃度為35％，并直接添加至下一批用于培養(yǎng)裂殖壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，充當(dāng)發(fā)酵氮源，用于裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，且添加量為發(fā)酵液體積的15％。同時，發(fā)酵培養(yǎng)基中原先的發(fā)酵氮源酵母粉濃度降至先前濃度的50％。發(fā)酵培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖70.0，酵母粉6.0，MgSO4·7H2O0.8，KH2PO41.5，(NH4)2SO44.0，NaNO32.0，Na2SO48.0，質(zhì)量濃度為35％的裂殖壺菌菌體殘渣稀釋液15％；CK(g/L)：葡萄糖70.0，酵母粉12.0，MgSO4·7H2O0.8，KH2PO41.5，(NH4)2SO44.0，NaNO32.0，Na2SO48.0；每種不同的培養(yǎng)基配制3個平行樣，121℃，滅菌25min，冷卻備用；(3)在250mL三角瓶中加入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，將裂殖壺菌以10％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，26℃恒溫培養(yǎng)3天，轉(zhuǎn)速200rpm；(4)連續(xù)培養(yǎng)3天后結(jié)束發(fā)酵，結(jié)束發(fā)酵后，對發(fā)酵液進(jìn)行5000g離心，收集濕菌體并置于恒溫水浴鍋中，在溫度為65℃，菌液pH為8條件下，用堿性蛋白酶、纖維素酶和果膠酶的混合酶系進(jìn)行破壁處理，并用磁力攪拌器持續(xù)攪拌，處理時間約5小時，直至菌體破壁完全。(5)對破壁處理后的裂殖壺菌菌體進(jìn)行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分離技術(shù)，得到富含二十二碳六烯酸的油脂進(jìn)行甲酯化后的氣相檢測分析，得到DHA的含量。發(fā)酵結(jié)果如下所示：表4菌體殘渣再利用組和對照組發(fā)酵結(jié)果對比發(fā)酵碳源生物量(g/L)油脂含量(％)DHA含量(％)DHA產(chǎn)量(g/L)對照組32.1±0.447.6±0.937.8±0.15.78±0.28菌體殘渣再利用組33.4±0.748.1±1.236.9±0.65.93±0.67由表4結(jié)果可知，與對照組相比，裂殖壺菌菌體殘渣可以很好地被裂殖壺菌再利用，且最終DHA產(chǎn)量未受影響。實施例5-6分別提供了本發(fā)明技術(shù)方案在100L中試培養(yǎng)級別上的具體實現(xiàn)步驟。實施例5(1)在250mL三角瓶中加入50mL種子培養(yǎng)基。接入低溫凍存的裂殖壺菌種，在培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)2天，將低溫凍存的裂殖壺菌種活化成裂殖壺菌種子液；將裂殖壺菌種子液按照10％的接種量，接入種子罐中，在通氣量為1.0vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)溫度為25℃的條件下，培養(yǎng)24h，即可轉(zhuǎn)接至100L發(fā)酵培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖20.0，酵母粉5.0，牛肉膏3.0，蛋白胨2.0，MgSO4·7H2O0.2，KH2PO41.0，海水晶5.0。(2)100L發(fā)酵罐中裝液量為70％，將DHA油脂提取完成后剩下的裂殖壺菌菌體殘渣進(jìn)行稀釋，充當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)，剩余菌體殘渣稀釋的質(zhì)量濃度為30％，并直接添加至下一批用于培養(yǎng)裂殖壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，充當(dāng)發(fā)酵氮源，用于裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，且添加量為發(fā)酵液體積的20％。同時，發(fā)酵培養(yǎng)基中原先的發(fā)酵氮源酵母粉濃度降至先前濃度的20％。發(fā)酵罐接種量為10％，轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量為1.0-1.5vvm，26℃恒溫培養(yǎng)2天。發(fā)酵培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖40.0，酵母粉1.0，MgSO4·7H2O0.2，KH2PO42.0，NaNO35.0，Na2SO42.0，質(zhì)量濃度為30％的裂殖壺菌菌體殘渣稀釋液20％；CK(g/L)：葡萄糖40.0，酵母粉5.0，MgSO4·7H2O0.2，KH2PO42.0，NaNO35.0，Na2SO42.0；(3)連續(xù)培養(yǎng)2天后結(jié)束發(fā)酵，結(jié)束發(fā)酵后，對發(fā)酵液進(jìn)行5000g離心，收集濕菌體并置于恒溫水浴中，在溫度為80℃，菌液pH為10條件下，用堿性蛋白酶進(jìn)行破壁處理，并用磁力攪拌器持續(xù)攪拌，處理時間約5小時，直至菌體破壁完全。(4)對破壁處理后的裂殖壺菌菌體進(jìn)行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分離技術(shù)，得到富含二十二碳六烯酸的油脂進(jìn)行甲酯化后的氣相檢測分析，得到DHA的含量。發(fā)酵結(jié)果如下所示：表5100L中試罐中菌體殘渣再利用組和對照組發(fā)酵結(jié)果對比發(fā)酵碳源生物量(g/L)油脂含量(％)DHA含量(％)DHA產(chǎn)量(g/L)對照組28.4±0.643.2±0.536.9±0.14.53±0.23菌體殘渣再利用組27.9±0.244.1±0.336.4±0.74.48±0.37由表5結(jié)果可知，在100L中試發(fā)酵罐中，通過對經(jīng)過酶解處理的裂殖壺菌菌體殘渣的再利用，對裂殖壺菌的發(fā)酵生長無不良影響。實施例6(1)在250mL三角瓶中加入50mL種子培養(yǎng)基。接入低溫凍存的裂殖壺菌種，在培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)2天，將低溫凍存的裂殖壺菌種活化成裂殖壺菌種子液；將裂殖壺菌種子液按照10％的接種量，接入種子罐中，在通氣量為1.0vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)溫度為25℃的條件下，培養(yǎng)24h，即可轉(zhuǎn)接至100L發(fā)酵培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖30.0，酵母粉7.0，牛肉膏2.0，蛋白胨5.0，MgSO4·7H2O0.6，KH2PO40.6，海水晶10.0。(2)100L發(fā)酵罐中裝液量為70％，將DHA油脂提取完成后剩下的裂殖壺菌菌體殘渣進(jìn)行稀釋，充當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)，剩余菌體殘渣稀釋的質(zhì)量濃度為40％，并直接添加至下一批用于培養(yǎng)裂殖壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，充當(dāng)發(fā)酵氮源，用于裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，且添加量為發(fā)酵液體積的10％。同時，發(fā)酵培養(yǎng)基中原先的發(fā)酵氮源酵母粉濃度降至先前濃度的40％。發(fā)酵罐接種量為10％，轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量為1.0-1.5vvm，26℃恒溫培養(yǎng)2天。發(fā)酵培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖60.0，酵母粉4.0，MgSO4·7H2O0.6，KH2PO41.2，(NH4)2SO43.0，NaNO33.0，Na2SO46.0，質(zhì)量濃度為40％的裂殖壺菌菌體殘渣稀釋液10％；CK(g/L)：葡萄糖60.0，酵母粉10.0，MgSO4·7H2O0.6，KH2PO41.2，(NH4)2SO43.0，NaNO33.0，Na2SO46.0；(3)連續(xù)培養(yǎng)2天后結(jié)束發(fā)酵，結(jié)束發(fā)酵后，對發(fā)酵液進(jìn)行5000g離心，收集濕菌體并置于恒溫水浴中，在溫度為60℃，菌液pH為5-7條件下，用纖維素酶進(jìn)行破壁處理，并用磁力攪拌器持續(xù)攪拌，處理時間約5小時，直至菌體破壁完全。(4)對破壁處理后的裂殖壺菌菌體進(jìn)行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分離技術(shù)，得到富含二十二碳六烯酸的油脂進(jìn)行甲酯化后的氣相檢測分析，得到DHA的含量。發(fā)酵結(jié)果如下所示：表6100L中試罐中菌體殘渣再利用組和對照組發(fā)酵結(jié)果對比發(fā)酵碳源生物量(g/L)油脂含量(％)DHA含量(％)DHA產(chǎn)量(g/L)對照組32.1±0.642.6±0.437.2±0.15.09±0.24菌體殘渣再利用組31.5±1.343.8±0.836.4±0.85.02±0.43由表6結(jié)果可知，在100L中試罐水平，裂殖壺菌菌體殘渣的添加應(yīng)用，依然可以很好地充當(dāng)發(fā)酵有機(jī)氮源被裂殖壺菌利用，且對DHA的最終產(chǎn)量基本無影響。實施例7-8分別提供了本發(fā)明技術(shù)方案在10噸生產(chǎn)培養(yǎng)級別上的具體實現(xiàn)步驟。實施例7(1)在250mL三角瓶中加入50mL種子培養(yǎng)基。接入低溫凍存的裂殖壺菌種，在培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)2天，將低溫凍存的裂殖壺菌種活化成裂殖壺菌種子液；將裂殖壺菌種子液按照10％的接種量，依次接入一級、二級種子罐中。其中，一級和二級種子罐培養(yǎng)條件均為：通氣量為1.0vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)24h，二級種培養(yǎng)完成后即可轉(zhuǎn)接至10噸發(fā)酵罐中。種子培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖40.0，酵母粉10.0，蛋白胨8.0，MgSO4·7H2O1.0，KH2PO40.2，海水晶20.0。(2)10噸發(fā)酵罐中裝液量為70％，將DHA油脂提取完成后剩下的裂殖壺菌菌體殘渣進(jìn)行稀釋，充當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)，剩余菌體殘渣稀釋的質(zhì)量濃度為50％，并直接添加至下一批用于培養(yǎng)裂殖壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，充當(dāng)發(fā)酵氮源，用于裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，且添加量為發(fā)酵液體積的5％。同時，發(fā)酵培養(yǎng)基中原先的發(fā)酵氮源酵母粉濃度降至先前濃度的60％。發(fā)酵罐接種量為10％，轉(zhuǎn)速80rpm，通氣量為0.8-1.2vvm，26℃恒溫培養(yǎng)2天。發(fā)酵培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖80.0，酵母粉9.0，MgSO4·7H2O1.0，KH2PO40.5，(NH4)2SO45.0，NaNO31.0，Na2SO410.0，質(zhì)量濃度為50％的裂殖壺菌菌體殘渣稀釋液5％；CK(g/L)：葡萄糖80.0，酵母粉15.0，MgSO4·7H2O1.0，KH2PO40.5，(NH4)2SO45.0，NaNO31.0，Na2SO410.0；(3)連續(xù)培養(yǎng)2天后結(jié)束發(fā)酵，結(jié)束發(fā)酵后，對發(fā)酵液進(jìn)行5000g離心，收集濕菌體并置于恒溫水浴中，在溫度為50℃，菌液pH為5條件下，用果膠酶進(jìn)行破壁處理，并用磁力攪拌器持續(xù)攪拌，處理時間約5小時，直至菌體破壁完全。(4)對破壁處理后的裂殖壺菌菌體進(jìn)行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分離技術(shù)，得到富含二十二碳六烯酸的油脂進(jìn)行甲酯化后的氣相檢測分析，得到DHA的含量。發(fā)酵結(jié)果如下所示：表710噸發(fā)酵罐中菌體殘渣再利用組和對照組發(fā)酵結(jié)果對比由表7結(jié)果可知，通過在10噸發(fā)酵罐上對經(jīng)過酶解處理后的裂殖壺菌菌體殘渣進(jìn)行利用，最終發(fā)酵結(jié)果與對照組無差異，說明該發(fā)明可很好地應(yīng)用于實際生產(chǎn)中。實施例8(1)在250mL三角瓶中加入50mL種子培養(yǎng)基。接入低溫凍存的裂殖壺菌種，在培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)2天，將低溫凍存的裂殖壺菌種活化成裂殖壺菌種子液；將裂殖壺菌種子液按照10％的接種量，依次接入一級、二級種子罐中。其中，一級和二級種子罐培養(yǎng)條件均為：通氣量為1.0vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)24h，二級種培養(yǎng)完成后即可轉(zhuǎn)接至10噸發(fā)酵罐中。種子培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖35.0，酵母粉8.0，牛肉膏1.5，蛋白胨6.0，MgSO4·7H2O0.8，KH2PO40.8，海水晶15.0。(2)10噸發(fā)酵罐中裝液量為70％，將DHA油脂提取完成后剩下的裂殖壺菌菌體殘渣進(jìn)行稀釋，充當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)，剩余菌體殘渣稀釋的質(zhì)量濃度為35％，并直接添加至下一批用于培養(yǎng)裂殖壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，充當(dāng)發(fā)酵氮源，用于裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，且添加量為發(fā)酵液體積的15％。同時，發(fā)酵培養(yǎng)基中原先的發(fā)酵氮源酵母粉濃度降至先前濃度的50％。發(fā)酵罐接種量為10％，轉(zhuǎn)速80rpm，通氣量為0.8-1.2vvm，26℃恒溫培養(yǎng)2天。發(fā)酵培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖70.0，酵母粉6.0，MgSO4·7H2O0.8，KH2PO41.5，(NH4)2SO44.0，NaNO32.0，Na2SO48.0，質(zhì)量濃度為35％的裂殖壺菌菌體殘渣稀釋液15％；CK(g/L)：葡萄糖70.0，酵母粉12.0，MgSO4·7H2O0.8，KH2PO41.5，(NH4)2SO44.0，NaNO32.0，Na2SO48.0；(3)連續(xù)培養(yǎng)2天后結(jié)束發(fā)酵，結(jié)束發(fā)酵后，對發(fā)酵液進(jìn)行5000g離心，收集濕菌體并置于恒溫水浴中，在溫度為65℃，菌液pH為8條件下，用堿性蛋白酶、纖維素酶和果膠酶的混合酶系進(jìn)行破壁處理，并用磁力攪拌器持續(xù)攪拌，處理時間約5小時，直至菌體破壁完全。(4)對破壁處理后的裂殖壺菌菌體進(jìn)行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分離技術(shù)，得到富含二十二碳六烯酸的油脂進(jìn)行甲酯化后的氣相檢測分析，得到DHA的含量。發(fā)酵結(jié)果如下所示：表810噸發(fā)酵罐中菌體殘渣再利用組和對照組發(fā)酵結(jié)果對比發(fā)酵碳源生物量(g/L)油脂含量(％)DHA含量(％)DHA產(chǎn)量(g/L)對照組34.4±0.245.6±0.737.3±0.95.85±0.29菌體殘渣再利用組35.3±0.845.3±1.036.8±0.45.88±0.72由表8結(jié)果可知，在10噸規(guī)模的發(fā)酵罐中，與對照組相比，裂殖壺菌菌體殘渣可以很好地被裂殖壺菌再利用，且最終DHA產(chǎn)量未受影響。本發(fā)明真正意義上實現(xiàn)了裂殖壺菌菌體殘渣的再利用，并節(jié)約了發(fā)酵成本，利于環(huán)境保護(hù)。綜上所述，本發(fā)明通過對酶法處理后的裂殖壺菌菌體殘渣進(jìn)行再利用，將其充當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的部分發(fā)酵氮源，并替換部分酵母粉，可以很好地用于裂殖壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)，且對DHA的最終產(chǎn)量沒有影響，從而很好地實現(xiàn)了菌體殘渣的再利用，也節(jié)約了發(fā)酵成本，該發(fā)明也體現(xiàn)了可持性發(fā)展的理念，對環(huán)境的保護(hù)起到促進(jìn)作用。本發(fā)明能夠充分利用裂殖壺菌菌體殘渣中的多種營養(yǎng)物質(zhì)，盡可能實現(xiàn)裂殖壺菌菌體殘渣應(yīng)用的高附加值。本發(fā)明通過對經(jīng)過酶法破壁處理并經(jīng)三相分離技術(shù)提取油脂后的菌體進(jìn)行再利用，將其直接應(yīng)用到裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，充當(dāng)部分發(fā)酵氮源，用于裂殖壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)。在本發(fā)明中，裂殖壺菌為球狀真菌，生長速度快，發(fā)酵周期短。裂殖壺菌在被應(yīng)用于充當(dāng)發(fā)酵氮源的處理過程及工藝極為簡單，僅需要經(jīng)過酶解破壁，再利用三相分離技術(shù)提取出DHA油脂后，剩余的裂殖壺菌菌體殘渣即可直接用于發(fā)酵培養(yǎng)基中。本發(fā)明方法適用于各種裂殖壺菌的菌體殘渣，如已公開專利CN104450809A中所述菌種，等等，本發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用前景和實用價值。以上對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。當(dāng)前第1頁1 2 3