本發(fā)明涉及一種生防菌株制劑，特別是涉及一種生防菌株制劑和粗毒素的制備方法以及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來棉田雜草嚴(yán)重威脅棉花生產(chǎn)，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，我國(guó)每年因其危害造成皮棉損失約為25.5萬t，均減產(chǎn)14.8％，重者達(dá)50％。近些年來新疆棉田雜草防治以播種前使用土壤封閉劑進(jìn)行土壤封閉為主，有效的控制雜草的爆發(fā)，但其一直未能有效控制惡性雜草田旋花的危害，因?yàn)樘镄▽?duì)化學(xué)除草劑具有天然耐受能力。隨著種植業(yè)結(jié)構(gòu)的不斷調(diào)整、機(jī)械化程度的不斷提高及化學(xué)除草劑的大面積使用，棉田雜草群落結(jié)構(gòu)隨之發(fā)生變化，但田旋花一直是新疆棉田優(yōu)勢(shì)種群，嚴(yán)重制約著新疆棉花早熟、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)及低耗。田旋花(Convolvulus arvensis L.)是一種世界范圍內(nèi)的多年生惡性雜草，被世界糧農(nóng)組織列為世界上危害最為嚴(yán)重的雜草之一，田旋花以根芽及種子進(jìn)行繁殖，每10cm的地下根可產(chǎn)生9-21個(gè)不定根和7個(gè)不定芽，其結(jié)種量大，種皮堅(jiān)硬，抗逆能力強(qiáng)，根部斷開后仍能進(jìn)行生長(zhǎng)。田旋花靠根部與作物爭(zhēng)奪水和養(yǎng)分資源，憑借強(qiáng)有力纏繞能力，與作物爭(zhēng)奪光照和空間資源，一旦進(jìn)入農(nóng)田，農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育嚴(yán)重受阻，最終導(dǎo)致作物品質(zhì)和產(chǎn)量下降。田旋花在棉花吐絮期危害時(shí)，其纏繞棉株棉株，嚴(yán)重影響機(jī)械化采收質(zhì)量。

目前對(duì)棉田中田旋花的防治措施主要以出苗后人工拔除及定向噴施滅生性除草劑為主，人工拔除不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且大大增加了生產(chǎn)成本，定向噴施滅生性除草劑難度較大且極易對(duì)棉株造成藥害，難以大面積的在新疆棉田中應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于，提供一種新型生防菌株制劑和粗毒素的制備方法以及應(yīng)用，所要解決的技術(shù)問題是使其能夠抑制田旋花的生長(zhǎng)，從而更加適于實(shí)用。

本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提出的一種生防菌株制劑的制備方法，包括以下步驟：

1)將活化后的生防菌株接種于種子培養(yǎng)基中，在25-30℃振蕩培養(yǎng)20-30h，得到種子培養(yǎng)液；

2)將所述的種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中在25-30℃振蕩培養(yǎng)5-7天，得到培養(yǎng)后的發(fā)酵液，即為防治田旋花的生防菌株制劑；

其中，所述的生防菌株分離于自然發(fā)病的田旋花葉片。

本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還可采用以下技術(shù)措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。

優(yōu)選的，前述的生防菌株制劑的制備方法，其中所述的種子培養(yǎng)基為：去皮馬鈴薯煮沸濾液180-220g/L，葡萄糖15-20g/L，蒸餾水定容至1L。

優(yōu)選的，前述的生防菌株制劑的制備方法，其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的為：酵母膏15～20g/L，碳水化合物120～150g/L，含氮化合物0.8～2g/L，玫瑰紅0.1～0.5g/L，氯霉素0.08～0.1g/L，蒸餾水定容至1L，pH為7.0～7.5；其中所述的含氮化合物為氯硝胺和可溶性銨鹽中的一種。

優(yōu)選的，前述的生防菌株制劑的制備方法，其中所述的種子培養(yǎng)液和發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)前的發(fā)酵液體積比為2％-5％。

優(yōu)選的，前述的生防菌株制劑的制備方法，其中所述的步驟1)和步驟2)中的振蕩的速度均為150-250r/min。

優(yōu)選的，前述的生防菌株制劑的制備方法，其中所述的碳水化合物為葡萄糖、蔗糖或淀粉。

本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提出的一種生防菌株制劑的應(yīng)用，本發(fā)明所述的生防菌株制劑用于抑制田旋花的生長(zhǎng)。

本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提出的一種生防菌株粗毒素的制備方法，將本發(fā)明所述的培養(yǎng)后的發(fā)酵液離心，收集上清液，將所述的上清液萃取，濃縮，得到生防菌株粗毒素。

本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提出的一種生防菌株粗毒素的應(yīng)用，用甲醇將本發(fā)明所述的生防菌株粗毒素溶解后再用清水配成濃度為50-800mg/L的溶液，將所述的溶液用于抑制田旋花的生長(zhǎng)。

借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明生防菌株制劑和粗毒素的制備方法以及應(yīng)用至少具有下列優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明的生防菌株制劑和粗毒素對(duì)田旋花具有較強(qiáng)的致病力，對(duì)棉花無抑制作用，可以作為一個(gè)田旋花的潛在生防資源，本發(fā)明的生防菌株制劑對(duì)田旋花的致死率為86.87％-91.23％，濃度為400-800mg/L生防菌株粗毒素對(duì)田旋花的抑制作用較高，對(duì)田旋花的致死率為88.00％-96.67％。本發(fā)明制劑和粗毒素的制備方法簡(jiǎn)單，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。

上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并詳細(xì)說明如后。

具體實(shí)施方式

為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效,以下結(jié)合較佳實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提出的生防菌株制劑和粗毒素的制備方法以及應(yīng)用其具體實(shí)施方式、特征及其功效，詳細(xì)說明如后。在下述說明中，不同的“一實(shí)施例”或“實(shí)施例”指的不一定是同一實(shí)施例。此外，一或多個(gè)實(shí)施例中的特定特征或特點(diǎn)可由任何合適形式組合。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提出的一種生防菌株制劑的制備方法，包括以下步驟：

1)將活化后的生防菌株接種于種子培養(yǎng)基中，在25-30℃振蕩培養(yǎng)20-30h，得到種子培養(yǎng)液；

較佳的，本發(fā)明實(shí)施例生防菌株制劑的制備方法中的種子培養(yǎng)基為：去皮馬鈴薯煮沸濾液180-220g/L，葡萄糖15-20g/L，蒸餾水定容至1L；

2)將所述的種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中在25-30℃振蕩培養(yǎng)5-7天，得到培養(yǎng)后的發(fā)酵液，即為防治田旋花的生防菌株制劑；

其中，所述的生防菌株分離于自然發(fā)病的田旋花葉片。

生防菌株從新疆自然發(fā)病的田旋花葉片上分離得到，具體的分離方法為：將自然發(fā)病的田旋花葉片置于無菌水中漂洗3次，在無菌工作臺(tái)上用滅菌濾紙吸取多余水分，用無菌刀取病健交接處組織，置于體積濃度為75％酒精中消毒30s，再置于體積濃度為0.1％的HgCL溶液中30s，再用無菌水漂洗5次，最后置于滅菌濾紙上晾干，置于PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)，用單菌絲分離法純化，將其保存于PDA斜面上。

較佳的，本發(fā)明實(shí)施例生防菌株制劑的制備方法中的發(fā)酵培養(yǎng)基的為：酵母膏15～20g/L，碳水化合物120～150g/L，含氮化合物0.8～2g/L，玫瑰紅0.1～0.5g/L，氯霉素0.08～0.1g/L，蒸餾水定容至1L，pH為7.0～7.5；其中所述的含氮化合物為氯硝胺和可溶性銨鹽中的一種；其中碳水化合物提供碳源，含氮化合物提供氮源。

較佳的，本發(fā)明實(shí)施例菌株制劑的制備方法中的種子培養(yǎng)液和發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)前的發(fā)酵液體積比為2％-5％。

較佳的，本發(fā)明實(shí)施例生防菌株制劑的制備方法的步驟1)和步驟2)中的振蕩的速度均為150-250r/min。

較佳的，本發(fā)明實(shí)施例生防菌株制劑的制備方法中的碳水化合物為葡萄糖、蔗糖或淀粉。

實(shí)施例1

將活化后的生防菌株接種于種子培養(yǎng)基中，在28℃、250r/min培養(yǎng)24h，得到種子培養(yǎng)液，種子培養(yǎng)基配方為：去皮馬鈴薯煮沸濾液200g，葡萄糖20g，蒸餾水定容至1000mL；將20mL的該種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中在25C、180r/min振蕩培養(yǎng)5天，得到培養(yǎng)后的發(fā)酵液，即為防治田旋花的生防菌株制劑，發(fā)酵培養(yǎng)基配方：酵母膏15g，蔗糖120g，氯硝胺0.8g，玫瑰紅0.1g，氯霉素0.08g，蒸餾水定容至1000mL，pH7.0。

實(shí)施例2

將活化后的生防菌株接種于種子培養(yǎng)基中，在25℃、150r/min培養(yǎng)20h，得到種子培養(yǎng)液，種子培養(yǎng)基配方為：去皮馬鈴薯煮沸濾液180g，葡萄糖20g，蒸餾水定容至1000mL；將30mL的該種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中在30C、250r/min振蕩培養(yǎng)7天，得到培養(yǎng)后的發(fā)酵液，即為防治田旋花的生防菌株制劑，發(fā)酵培養(yǎng)基配方：酵母膏16g，淀粉125g，氯化銨1.2g，玫瑰紅0.25g，氯霉素0.09g，蒸餾水定容至1000mL，pH7.0。

實(shí)施例3

將活化后的生防菌株接種于種子培養(yǎng)基中，在30℃、180r/min培養(yǎng)30h，得到種子培養(yǎng)液，種子培養(yǎng)基配方為：去皮馬鈴薯煮沸濾液220g，葡萄糖15g，蒸餾水定容至1000mL；將40mL的該種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中在25℃、220r/min振蕩培養(yǎng)6天，得到培養(yǎng)后的發(fā)酵液，即為防治田旋花的生防菌株制劑，發(fā)酵培養(yǎng)基配方：酵母膏18g，葡萄糖130g，硝酸銨1.8g，玫瑰紅0.5g，氯霉素0.1g，蒸餾水定容至1000mL，pH7.3。

實(shí)施例4

將活化后的生防菌株接種于種子培養(yǎng)基中，在30℃、220r/min培養(yǎng)27h，得到種子培養(yǎng)液，種子培養(yǎng)基配方為：去皮馬鈴薯煮沸濾液210g，葡萄糖18g，蒸餾水定容至1000mL；將50mL的該種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中在25℃、220r/min振蕩培養(yǎng)6天，得到培養(yǎng)后的發(fā)酵液，即為防治田旋花的生防菌株制劑，發(fā)酵培養(yǎng)基配方：酵母膏20g，葡萄糖130g，硫酸銨1.8g，玫瑰紅0.4g，氯霉素0.1g，蒸餾水定容至1000mL，pH7.2。

實(shí)施例5

將活化后的生防菌株接種于種子培養(yǎng)基中，在27℃、220r/min培養(yǎng)28h，得到種子培養(yǎng)液，種子培養(yǎng)基配方為：去皮馬鈴薯煮沸濾液210g，葡萄糖17g，蒸餾水定容至1000mL；將35mL的該種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中在25℃、200r/min振蕩培養(yǎng)6天，得到培養(yǎng)后的發(fā)酵液，即為防治田旋花的生防菌株制劑，發(fā)酵培養(yǎng)基配方：酵母膏17g，淀粉130g，氯化銨1.5g，玫瑰紅0.3g，氯霉素0.09g，蒸餾水定容至1000mL，pH7.1。

實(shí)施例6

將活化后的生防菌株接種于種子培養(yǎng)基中，在27℃、210r/min培養(yǎng)26h，得到種子培養(yǎng)液，種子培養(yǎng)基配方為：去皮馬鈴薯煮沸濾液200g，葡萄糖20g，蒸餾水定容至1000mL；將種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中在25℃、210r/min振蕩培養(yǎng)6天，得到培養(yǎng)后的發(fā)酵液，即為防治田旋花的生防菌株制劑，發(fā)酵培養(yǎng)基配方：酵母膏17g，淀粉125g，碳酸銨1.6g，玫瑰紅0.5g，氯霉素0.1g，蒸餾水定容至1000mL，pH7.5。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例提出一種生防菌株制劑的應(yīng)用，將本發(fā)明的生防菌株制劑用于抑制田旋花的生長(zhǎng)。

將實(shí)施例1-6制備的生防菌株制劑分別用清水稀釋至體積濃度為20％、40％、60％、80％，將上述稀釋后的生防菌株制劑分別接種至3片真葉期田旋花植株和棉花植株上，每個(gè)盆栽接種一種生防菌株制劑，接種量為10mL/盆，每盆15株田旋花，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置四組平行實(shí)驗(yàn)，最終的死亡率為平均死亡率，以棉花植株為對(duì)照。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過上述各稀釋后的生防菌株制接種后的田旋花48h后年葉片失綠枯變，生長(zhǎng)點(diǎn)萎蔫，72h后上述田旋花開始死亡，死亡率如表1所示，同時(shí)，經(jīng)過處理的棉花植株生長(zhǎng)正常，無死亡，無枯萎，說明該制劑對(duì)田旋花的生長(zhǎng)具有抑制作用，且不影響棉花生長(zhǎng)。

表1 72h后田旋花的死亡率(％)

由表1可知，體積濃度為60％-80％的生防菌株制劑對(duì)田旋花的生長(zhǎng)抑制較好，對(duì)田旋花的致死率為86.87％-91.23％。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例還提出一種生防菌株粗毒素的制備方法，將本發(fā)明的發(fā)酵液(即生防菌株制劑)離心，收集上清液，將上清液萃取，濃縮，得到生防菌株粗毒素。

實(shí)施例7

將本實(shí)施例1的生防菌株制劑離心，收集上清液，將上清液萃取，濃縮，得到生防菌株粗毒素。

實(shí)施例8

將本實(shí)施例2的生防菌株制劑離心，收集上清液，將上清液萃取，濃縮，得到生防菌株粗毒素。

實(shí)施例9

將本實(shí)施例3的生防菌株制劑離心，收集上清液，將上清液萃取，濃縮，得到生防菌株粗毒素。

實(shí)施例10

將本實(shí)施例4的生防菌株制劑離心，收集上清液，將上清液萃取，濃縮，得到生防菌株粗毒素。

實(shí)施例11

將本實(shí)施例5的生防菌株制劑離心，收集上清液，將上清液萃取，濃縮，得到生防菌株粗毒素。

實(shí)施例12

將本實(shí)施例6的生防菌株制劑離心，收集上清液，將上清液萃取，濃縮，得到生防菌株粗毒素。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例還提出一種生防菌株粗毒素的應(yīng)用，用甲醇將本發(fā)明的生防菌株粗毒素溶解后再用清水配成濃度為50-800mg/L的溶液，將所述的溶液用于抑制田旋花的生長(zhǎng)。

將實(shí)施例7-12的生防菌株粗毒素用甲醇溶解后再用清水分別稀釋成50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L的粗毒素，上述粗毒素溶液分別接種至3片真葉期田旋花植株上，每個(gè)盆栽接種一種粗毒素，接種量5mL/盆，每盆15株田旋花，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置四組平行實(shí)驗(yàn)，最終的死亡率為平均死亡率。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)：12h后經(jīng)過200mg/L、400mg/L、800mg/L粗毒素溶液處理的田旋花葉片明顯失綠褐變，生長(zhǎng)點(diǎn)嚴(yán)重萎蔫，經(jīng)過50mg/L和100mg/L粗毒素溶液處理的田旋花變化不明顯；72h后400mg/L和800mg/L處理田旋花死亡率較高，對(duì)田旋花的防效較好，72h后經(jīng)過各濃度的粗毒素處理的田旋花的死亡率見表2。

表2經(jīng)過不同濃度生防菌株粗毒素處理的田旋花72h后的死亡率(％)

由表2可知，濃度為50-800mg/L生防菌株粗毒素的致死率為22.08％-96.67％，濃度為400-800mg/L生防菌株粗毒素對(duì)田旋花的抑制作用較高，對(duì)田旋花的致死率為88.00％-96.67％。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。