本發(fā)明涉及多粘芽抱桿菌篩選差異菌領(lǐng)域，具體的是一種提高挑選多粘菌素正向突變菌株機(jī)率的方法。
背景技術(shù)：
硫酸黏桿菌素(Colistin Sulfate)又名黏桿菌素、抗敵素、多黏菌素E，是從多黏芽胞桿菌變種(Bacillus polymyxa var.colistimus)的培養(yǎng)液中提取的一種堿性多肽類抗生素。近十幾年來(lái)，由于藥物殘留和耐藥問(wèn)題對(duì)人類產(chǎn)生的潛在危害日益突出，發(fā)達(dá)國(guó)家相繼禁用了若干種飼用抗生素。硫酸黏桿菌素因內(nèi)服胃腸道不易吸收，不易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、綠膿桿菌等有強(qiáng)大的抗菌作用而引起畜牧獸醫(yī)工作者的關(guān)注。美國(guó)和歐盟將其批準(zhǔn)作為獸藥使用，在日本還被用作飼料添加劑。我國(guó)在20世紀(jì)90年代末由山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)成功研制了硫酸黏桿菌素及其制劑，并于2002年被農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為國(guó)家三類新獸藥。
盡管基因工程技術(shù)已經(jīng)開(kāi)始用于工業(yè)生產(chǎn)高產(chǎn)菌株的構(gòu)建，但是應(yīng)用物理、化學(xué)誘變因了如紫外線、高頻電了流、亞硝基呱等仍然是遺傳育種不可或缺的手段。為了提高誘變后高產(chǎn)菌株的篩選效率，人們?cè)O(shè)計(jì)了各種篩選方案，如川市設(shè)計(jì)了瓊脂塊法，Elander R P.等人提出利用前體及結(jié)構(gòu)類似物抗性的篩選方法，它們?cè)诰N選育中取得了較好的效果。周希貴、戴鵬高等公開(kāi)了一種“粘桿菌素高產(chǎn)菌株的選育” 方法(中國(guó)知網(wǎng))，用亞硝基胍對(duì)多粘類芽胞桿菌(Paenibacilluspolymyxa)AS1 5 4 1進(jìn)行誘變,采用其自身次生代謝產(chǎn)物粘桿菌素進(jìn)行篩選時(shí)正突變率為32.3％，但其篩選方法依舊繁瑣、復(fù)雜，雖然獲得高產(chǎn)菌種的幾率可以進(jìn)一步提高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種簡(jiǎn)捷、易操作、提高挑選多粘菌素正向突變菌株機(jī)率的方法；
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種提高生產(chǎn)多粘菌素菌株正向突變機(jī)率的方法，其特征在于：對(duì)分離平板培養(yǎng)基添加輕質(zhì)碳酸鈣，制備成平板后進(jìn)行低溫冷藏，在分離平板上進(jìn)行菌株培養(yǎng)，依據(jù)單菌落出現(xiàn)的外觀形態(tài)轉(zhuǎn)接到添加有輕質(zhì)碳酸鈣的斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，將斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)完成后的菌苔接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即得正向突變率大于50％的菌株。
進(jìn)一步的技術(shù)方案在于，所述分離平板培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：葡萄糖0.5％-1.5％，酵母粉0.5％-1.5％，牛肉膏0.1％-0.5％，氯化鈉0.1％-0.5％，輕質(zhì)碳酸鈣0.1-0.2％，瓊脂2.2％，水余量；所述分離平板培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基pH6.0-7.2。
進(jìn)一步的技術(shù)方案在于，所述斜面培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：葡萄糖0.5％-1.5％，酵母粉0.5％-1.5％，牛肉膏0.1％-0.5％，氯化鈉0.1％-0.5％，輕質(zhì)碳酸鈣0.1-0.2％，瓊脂2.2％，水余量；所述斜面培養(yǎng)基pH6.0-7.2。
進(jìn)一步的技術(shù)方案在于，所述單菌落分為N(粘稠)型和G(干 癟)型菌落，所述G(干癟)型菌落為高產(chǎn)菌落，可直觀的進(jìn)行操作，易挑選出正向突變菌株。
進(jìn)一步的技術(shù)方案在于，所述的一種提高生產(chǎn)多粘菌素菌株正向突變機(jī)率的方法包括以下步驟：
(1)配制無(wú)菌的含有輕質(zhì)碳酸鈣的的分離平板培養(yǎng)基，在超凈臺(tái)上制成平板，然后在溫度30-35℃的條件下空培3天；
(2)將步驟(1)中空培3天后的分離平板培養(yǎng)基放入冰箱，在2-10℃條件下冷藏6-10天；
(3)使用無(wú)菌水稀釋生產(chǎn)菌株凍存管，選擇稀釋度為10-3-10-8的稀釋液，依次涂布于步驟(2)中冷藏后的分離平板培養(yǎng)基上，在溫度為28-35℃，濕度為30％-60％條件下，培養(yǎng)70h-100h，即得N(粘稠)型和G(干癟)型菌落；
(4)挑取步驟(3)中G(粘稠)型單菌落，劃線涂布于含有輕質(zhì)碳酸鈣的的斜面培養(yǎng)基上，在溫度為28-35℃，濕度為30％-60％條件下，進(jìn)行培養(yǎng)，即得菌苔；
(5)將步驟(4)中的菌苔刮下接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度28.0℃-35.0℃，搖床轉(zhuǎn)速為190rpm的條件下培養(yǎng)20h-38h，即得正向突變率大于50％的菌株。
進(jìn)一步的技術(shù)方案還在于，所述種子培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：蔗糖1％-2％，酵母粉2％-3％，氯化鈉0.1％-0.5％，磷酸二氫鉀0.05％-0.1％，水余量；所述種子培養(yǎng)基pH6.0-7.0。
采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于：本發(fā)明采用對(duì)粘桿菌素產(chǎn)生菌進(jìn)行代謝調(diào)控和固體培養(yǎng)基初始濕度進(jìn)行調(diào)節(jié)相結(jié)合的篩選方法，實(shí)現(xiàn)了多粘菌素高產(chǎn)菌落的直觀可區(qū)分的菌株篩選方法，提高了粘桿菌素篩選中獲得正向突變菌株的機(jī)率，提高了篩選效率。本發(fā)明方法工藝簡(jiǎn)單、易操作。因而可進(jìn)行大規(guī)模的篩選，獲得較多的高產(chǎn)菌株，進(jìn)而降低生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其它方式來(lái)實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開(kāi)的具體實(shí)施例的限制。
下述實(shí)施例中，種瓶種子即正向突變的菌株。
實(shí)施例1
(1)配制無(wú)菌分離平板培養(yǎng)基，在超凈臺(tái)上制成平板，然后在溫度30-35℃的條件下空培3天；分離平板培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：葡萄糖1.0％，酵母粉1.0％，牛肉膏0.5％，氯化鈉0.2％，瓊脂2.2％，水余量，pH6.0-7.2；
(2)使用無(wú)菌水稀釋生產(chǎn)菌株凍存管，選擇稀釋度為10-3-10-8 的稀釋液，依次涂布于步驟(1)中的分離平板培養(yǎng)基上，在溫度為28-35℃，濕度為30％-60％條件下，培養(yǎng)70h-100h，即得菌落；
(3)挑取步驟(2)中單菌落135個(gè)，劃線涂布于135個(gè)斜面培養(yǎng)基上，在溫度為28-35℃，濕度為30％-60％條件下，進(jìn)行培養(yǎng)，即得菌苔；斜面培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：葡萄糖1.0％,酵母粉1.0％，牛肉膏0.5％，氯化鈉0.2％，瓊脂2.2％，水余量，pH6.0-7.2；
(4)將步驟(3)中的菌苔刮下接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度28.-35℃，搖床轉(zhuǎn)速為190rpm的條件下培養(yǎng)20h-38h，即得種瓶種子；種子培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：蔗糖1.5％,酵母粉2％，氯化鈉0.3％，磷酸二氫鉀0.06％，水余量，pH6.0-7.0。
至此，還需要種瓶種子接種發(fā)酵瓶進(jìn)行效價(jià)能力的驗(yàn)證，發(fā)酵方法：將步驟(4)培養(yǎng)好的種瓶種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度28-35℃，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm條件下，搖瓶培養(yǎng)45-50h，發(fā)酵培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：淀粉4％，硫酸按2％，磷酸二氫鉀0.06％，七水硫酸亞鐵0.03％，水余量，pH6.0-7.0；發(fā)酵瓶采用八層紗布；
測(cè)得發(fā)酵瓶效價(jià)和生產(chǎn)原菌株進(jìn)行對(duì)照，高于對(duì)照的菌株有35株，所以正向突變率為35/135＝25.9％。
實(shí)施例2
(1)配制無(wú)菌分離平板培養(yǎng)基，在超凈臺(tái)上制成平板，然后在溫度30-35℃的條件下空培3天；分離平板培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：葡萄糖1.0％,酵母粉1.0％，牛肉膏0.5％，氯化鈉0.2％， 輕質(zhì)碳酸鈣0.1％，瓊脂2.2％，水余量，pH6.0-7.2；
(2)將步驟(1)中空培3天后的分離平板培養(yǎng)基放入冰箱，在2-10℃條件下冷藏6天；
(3)使用無(wú)菌水稀釋生產(chǎn)菌株凍存管，選擇稀釋度為10-2-10-8的稀釋液，依次涂布于步驟(2)中冷藏后的分離平板培養(yǎng)基上，在溫度為28-35℃，濕度為30％-60％條件下，培養(yǎng)70h-100h，即得N(粘稠)型和G(干癟)型菌落；
(4)挑取步驟(3)中G(粘稠)型單菌落128個(gè)菌落，劃線涂布于128個(gè)斜面培養(yǎng)基上，在溫度為28-35℃，濕度為30％-60％條件下，進(jìn)行培養(yǎng)，即得菌苔；斜面培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：葡萄糖1.0％,酵母粉1.0％，牛肉膏0.5％，氯化鈉0.2％，輕質(zhì)碳酸鈣0.1％，瓊脂2.2％，水余量，pH6.0-7.2；
(5)將步驟(4)中的菌苔刮下接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度28-35℃，搖床轉(zhuǎn)速為190rpm的條件下培養(yǎng)20h-38h，即得種瓶種子；種子培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：蔗糖1.5％,酵母粉2％，氯化鈉0.3％，磷酸二氫鉀0.06％，水余量，pH6.0-7.0；
至此，還需要種瓶種子接種發(fā)酵瓶進(jìn)行效價(jià)能力的驗(yàn)證，發(fā)酵方法：將步驟(4)培養(yǎng)好的種瓶種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度28-35℃，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm條件下，搖瓶培養(yǎng)45-50h，發(fā)酵培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：淀粉4％、硫酸按2％、磷酸二氫鉀0.06％、七水硫酸亞鐵0.03％，水余量，pH6.0-7.0；發(fā)酵瓶采用八層紗布；
測(cè)得發(fā)酵瓶效價(jià)和生產(chǎn)原菌株進(jìn)行對(duì)照，高于對(duì)照的菌株有85株，所以正向突變率為85/128＝66.4％。
實(shí)施例3
(1)配制無(wú)菌分離平板培養(yǎng)基，在超凈臺(tái)上制成平板，然后在溫度30-35℃的條件下空培3天；分離平板培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：葡萄糖1.0％,酵母粉1.0％，牛肉膏0.5％，氯化鈉0.2％，輕質(zhì)碳酸鈣0.15％，瓊脂2.2％，水余量，pH6.0-7.2；
(2)將步驟(1)中空培3天后的分離平板培養(yǎng)基放入冰箱，在2-10℃條件下冷藏8天；
(3)使用無(wú)菌水稀釋生產(chǎn)菌株凍存管，選擇稀釋度為10-2-10-8的稀釋液，依次涂布于步驟(2)中冷藏后的分離平板培養(yǎng)基上，在溫度為28-35℃，濕度為30％-60％條件下，培養(yǎng)70h-100h，即得N(粘稠)型和G(干癟)型菌落；
(4)挑取步驟(3)中G(粘稠)型單菌落144個(gè)菌落，劃線涂布于144個(gè)斜面培養(yǎng)基上，在溫度為28-35℃，濕度為30％-60％條件下，進(jìn)行培養(yǎng)，即得菌苔；斜面培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：葡萄糖1.0％,酵母粉1.0％，牛肉膏0.5％，氯化鈉0.2％，輕質(zhì)碳酸鈣0.15％，瓊脂2.2％，水余量，pH6.0-7.2；
(5)將步驟(4)中的菌苔刮下接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度28-35℃，搖床轉(zhuǎn)速為190rpm的條件下培養(yǎng)20h-38h，即得種瓶種子；種子培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：蔗糖1.5％,酵母粉2％，氯化鈉0.3％，磷酸二氫鉀0.06％，水余量，pH6.0-7.0；
至此，還需要種瓶種子接種發(fā)酵瓶進(jìn)行效價(jià)能力的驗(yàn)證，發(fā)酵方法：將步驟(4)培養(yǎng)好的種瓶種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度28-35℃，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm條件下，搖瓶培養(yǎng)45-50h，發(fā)酵培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：淀粉4％、硫酸按2％、磷酸二氫鉀0.06％、七水硫酸亞鐵0.03％，水余量，pH6.0-7.0；發(fā)酵瓶采用八層紗布；
測(cè)得發(fā)酵瓶效價(jià)和生產(chǎn)原菌株進(jìn)行對(duì)照，高于對(duì)照的菌株有85株，所以正向突變率為116/144＝80.6％。
實(shí)施例4
(1)配制無(wú)菌分離平板培養(yǎng)基，在超凈臺(tái)上制成平板，然后在溫度30-35℃的條件下空培3天；分離平板培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：葡萄糖1.0％,酵母粉1.0％，牛肉膏0.5％，氯化鈉0.2％，輕質(zhì)碳酸鈣0.2％，瓊脂2.2％，水余量，pH6.0-7.2；
(2)將步驟(1)中空培3天后的分離平板培養(yǎng)基放入冰箱，在2-10℃條件下冷藏10天；
(3)使用無(wú)菌水稀釋生產(chǎn)菌株凍存管，選擇稀釋度為10-2-10-8的稀釋液，依次涂布于步驟(2)中冷藏后的分離平板培養(yǎng)基上，在溫度為28-35℃，濕度為30％-60％條件下，培養(yǎng)70h-100h，即得N(粘稠)型和G(干癟)型菌落；
(4)挑取步驟(3)中G(粘稠)型單菌落130個(gè)菌落，劃線涂布于130個(gè)斜面培養(yǎng)基上，在溫度為28-35℃，濕度為30％-60％條件下，進(jìn)行培養(yǎng)，即得菌苔；斜面培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成： 葡萄糖1.0％,酵母粉1.0％，牛肉膏0.5％，氯化鈉0.2％，輕質(zhì)碳酸鈣0.2％，瓊脂2.2％，水余量，pH6.0-7.2；
(5)將步驟(4)中的菌苔刮下接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度28-35℃，搖床轉(zhuǎn)速為190rpm的條件下培養(yǎng)20h-38h，即得種瓶種子；種子培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：蔗糖1.5％,酵母粉2％，氯化鈉0.3％，磷酸二氫鉀0.06％，水余量，pH6.0-7.0；
至此，還需要種瓶種子接種發(fā)酵瓶進(jìn)行效價(jià)能力的驗(yàn)證，發(fā)酵方法：將步驟(4)培養(yǎng)好的種瓶種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度28-35℃，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm條件下，搖瓶培養(yǎng)45-50h，發(fā)酵培養(yǎng)基由以下組份及重量百分比組成：淀粉4％、硫酸按2％、磷酸二氫鉀0.06％、七水硫酸亞鐵0.03％，水余量，pH6.0-7.0；發(fā)酵瓶采用八層紗布；
測(cè)得發(fā)酵瓶效價(jià)和生產(chǎn)原菌株進(jìn)行對(duì)照，高于對(duì)照的菌株有85株，所以正向突變率為94/130＝72.3％。
本發(fā)明在原配方的基礎(chǔ)上添加輕質(zhì)碳酸鈣0.1-0.2％，產(chǎn)生優(yōu)化分離平板培養(yǎng)基，為了使孢子在生長(zhǎng)過(guò)程中穩(wěn)定在合適的pH生長(zhǎng)范圍內(nèi)更長(zhǎng)的時(shí)間，利于孢子生長(zhǎng)過(guò)程外觀形態(tài)充分表達(dá)；冰箱冷藏使培養(yǎng)基表面水份緩慢蒸發(fā)，利于孢子的發(fā)芽和菌落的均勻生長(zhǎng)，使菌落形態(tài)出現(xiàn)差異；挑選單菌落，N(粘稠)型和G(干癟)型菌落，G型菌落為高產(chǎn)菌落，從而直觀的進(jìn)行操作，結(jié)果獲得正向突變菌株的機(jī)率得到提高；最好將斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的菌種加入20％甘油保藏到凍存管中，-70℃冰箱保存或液氮冷凍保藏，以進(jìn)一步提高其存活 率，然后可以進(jìn)行后續(xù)的發(fā)酵多次考察使用。
本發(fā)明采用對(duì)粘桿菌素產(chǎn)生菌進(jìn)行代謝調(diào)控和固體培養(yǎng)基初始濕度進(jìn)行調(diào)節(jié)相結(jié)合的篩選方法，實(shí)現(xiàn)了多粘菌素高產(chǎn)菌落的直觀可區(qū)分的菌株篩選方法，提高了粘桿菌素篩選中獲得正向突變菌株的機(jī)率，提高了篩選效率。本發(fā)明方法工藝簡(jiǎn)單、易操作。因而可進(jìn)行大規(guī)模的篩選，獲得較多的高產(chǎn)菌株，進(jìn)而降低生產(chǎn)成本。