本發(fā)明涉及生物防治
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及一株抗多菌靈的哈茨木霉菌株Th-N5及其與低劑量的多菌靈混合防治桑葚白果病的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：桑葚白果病是菌核病的俗稱，又稱桑白果病，屬真菌類病害，是桑果上的主要病害，其對應(yīng)的病原菌有核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum）、桑實杯盤菌（Ciboriashiraiana）、肉阜狀杯盤菌（Ciboriacarunculoides）和核地杖菌（Scleromitulashiraiana）。桑葚白果病傳染性強、傳播快，病情輕則影響桑葚的產(chǎn)量與品質(zhì)，重則致使桑椹無法正常成熟、收獲，導(dǎo)致桑葚大面積減產(chǎn)、顆粒無收，對果桑產(chǎn)業(yè)造成毀滅性災(zāi)害，帶病菌的桑葉嚴(yán)重威脅蠶繭的生產(chǎn)，直接影響桑葚加工產(chǎn)業(yè)與蠶業(yè)生產(chǎn)所需的原料來源，威脅到桑果產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。目前，桑葚白果病的防治主要采用農(nóng)業(yè)綜合防治和化學(xué)防治技術(shù)措施，農(nóng)業(yè)綜合防治主要以減少初侵染源的病原物基數(shù)、切斷病原物的傳播途徑為主，因而防治效果有限?；瘜W(xué)防治主要采用50%多菌靈、70%甲基托布津、40%菌核凈等化學(xué)農(nóng)藥噴霧，但是，長期、大量地使用多菌靈等化學(xué)農(nóng)藥引起病原菌抗藥性增強，導(dǎo)致桑果產(chǎn)品和生態(tài)環(huán)境中化學(xué)農(nóng)藥殘留嚴(yán)重超標(biāo)。哈茨木霉菌（Trichodermaharzianum）是一種重要的植物病害生防治真菌，作為一種活體生物農(nóng)藥，具有不同于現(xiàn)有化學(xué)殺蟲劑的全新作用機理、對環(huán)境無污染、無殘留，可以作為對化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性的桑葚白果病的替代防治藥物。但是，目前已有的哈茨木霉菌菌株對桑葚白果病的防效仍然不是十分理想，而且多數(shù)菌株對其他化學(xué)農(nóng)藥，如多菌靈，不具有抗藥性，阻礙了其與化學(xué)農(nóng)藥混用從而達到顯著提高桑葚白果病防效的目的，限制了其應(yīng)用。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有桑葚白果病防治技術(shù)的缺陷和不足，提供一株抗多菌靈的哈茨木霉菌株Th-N5及其應(yīng)用，所述茨木霉菌株Th-N5對防治桑葚白果病有顯著的效果，而且該哈茨木霉菌株Th-N5對多菌靈有較強的抗藥性，與低劑量的多菌靈混合使用、可徹底控制桑葚白果病，大大減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，解決桑果中的農(nóng)藥殘留問題，同時不污染環(huán)境與農(nóng)田生態(tài)環(huán)境。本發(fā)明的目的是提供一株哈茨木霉菌Th-N5菌株及其在防治桑葚白果病中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供所述菌株Th-N5與低劑量的多菌靈混合防治桑葚白果病的應(yīng)用。本發(fā)明的在再一目的是提供一種防治桑葚白果病的生物制劑，所述制劑包含哈茨木霉菌Th-N5菌株。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案給予實現(xiàn)的。一株抗多菌靈的哈茨木霉菌（Trichodermaharzianum）Th-N5菌株，所述Th-N5菌株于2016年5月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏編號為CCTCCNo:M2016251，分類命名號為：TrichodermaharzianumTh-N5；保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。所述哈茨木霉菌Th-N5分離自廣州地區(qū)被自然侵染的桑葚白果，然后經(jīng)篩選獲得純化菌株，經(jīng)過鑒定屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科。本發(fā)明的哈茨木霉菌Th-N5的形態(tài)特性如下：在PDA培養(yǎng)基上菌落深厚、致密，初期為白色絮狀，后為暗綠色或綠色，背面呈黃色或淺綠色。分生孢子梗從菌絲的側(cè)枝上生出，對生或互生，有2～3次分枝，著生分生孢子的小梗呈瓶形或錐形。菌絲纖細(xì)無色，具分隔，多分枝；分生孢子多為球形、2～2.9×1.9～2.6μm，單孢，在小梗上聚集成球狀。進一步地，所述哈茨木霉菌Th-N5的rDNA-ITS序列如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明所述哈茨木霉菌Th-N5菌株在防治桑葚白果病方面有特效，而且對多菌靈有抗藥性，可與低劑量的多菌靈混合使用，徹底控制桑葚白果病，大大減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，解決桑果中的農(nóng)藥殘留問題，不污染環(huán)境與農(nóng)田生態(tài)環(huán)境。同時可用于防治核盤菌等病原引起的多種植物病害。因此，所述哈茨木霉菌Th-N5菌株在防治桑葚白果病中的應(yīng)用，以及在防治核盤菌引起的多種植物病害方面的應(yīng)用，也都應(yīng)在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。同時，所述哈茨木霉菌株Th-N5與多菌靈混合使用在防治桑葚白果病中的應(yīng)用，以及在防治核盤菌引起的多種植物病害方面的應(yīng)用，也都應(yīng)在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。另外，本發(fā)明還提供了一種從哈茨木霉菌株Th-N5中提取得到的粗毒素。具體地，所述粗毒素的提取方法如下：取哈茨木霉菌Th-N5菌株的孢子，用含有吐溫-80的無菌水配制成孢子懸液，將孢子懸液加入Czapek培養(yǎng)液中培養(yǎng)；然后向培養(yǎng)液中加入乙酸乙酯進行抽提（抽提其中的真菌毒素），得到的有機相濃縮即得到哈茨木霉毒素。更具體地，所述粗毒素的提取方法如下：取哈茨木霉菌Th-N5菌株的孢子用0.05%的吐溫-80無菌水配制成濃度為1×108分生孢子/mL的孢子懸液，然后取2ml加入200ml的Czapek培養(yǎng)液中，在26±1℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)5d，將等體積的乙酸乙酯加入帶有菌絲的培養(yǎng)液中抽提其中的真菌毒素，2天后取有機相濃縮獲得哈茨木霉毒素，將連續(xù)3次抽提濃縮的毒素合并后放入-20℃冷凍備用。另外，一種包含上述的哈茨木霉菌株Th-N5或包含有從該菌株中提取的毒素的防治桑葚白果病的生物制劑也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。優(yōu)選地，所述防治桑葚白果病的生物制劑還包含有0～50mg/L的多菌靈。更優(yōu)選地，所述防治桑葚白果病的生物制劑中含有1～50mg/L的多菌靈和1×105～1×108孢子/ml的哈茨木霉Th-N5孢子懸浮液。更優(yōu)選地，所述生物制劑中含有25～50mg/L的多菌靈和1×107孢子/ml的哈茨木霉菌株Th-N5孢子懸浮液。更優(yōu)選地，所述生物制劑中含有50mg/L的多菌靈和1×107孢子/ml的哈茨木霉菌株Th-N5孢子懸浮液。上述生物制劑在防治桑葚白果病和/或核盤菌引起的其他多種植物病害中的應(yīng)用，也應(yīng)在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明公開的哈茨木霉菌Th-N5是從廣東省廣州地區(qū)被自然侵染的桑葚白果上分離獲得，可有效地防治桑葚白果病。同時，該菌株對多菌靈有較強的抗藥性，與低濃度的多菌靈混合使用可徹底控制桑葚白果病，可大大減少多菌靈等化學(xué)農(nóng)藥的使用量，解決桑果中的農(nóng)藥殘留問題。另外，該菌株為中國本土的菌株，并非從國外引進，能適應(yīng)本地的自然環(huán)境。該哈茨木霉菌是一種生防真菌，作為一種活體生物農(nóng)藥，具有不同于現(xiàn)有化學(xué)殺蟲劑的全新的作用機理、對環(huán)境無污染、無殘留的特征，適應(yīng)了有機食品生產(chǎn)的要求。附圖說明圖1為哈茨木霉菌Th-N5的菌落形態(tài)（10d）；A：菌落正面；B：菌落背面。圖2為哈茨木霉菌Th-N5的菌絲和分生孢子形態(tài)。具體實施方式下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作出進一步地詳細(xì)闡述，所述實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實施例1哈茨木霉菌Th-N5菌株的分離與鑒定1.菌株的分離（1）材料：目標(biāo)菌株分離自廣州地區(qū)桑葚園中被自然侵染的桑葚白果。（2）實驗條件馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：將200g馬鈴薯+20g葡萄糖+17～20g瓊脂粉倒入燒杯中并加入水使總體積為1000ml。經(jīng)高壓滅菌（121℃，30min）。無菌操作條件：所有器皿和用具須經(jīng)高壓滅菌（121℃，30min），接種等操作均在超凈工作臺內(nèi)進行。培養(yǎng)條件：置于26±1℃光照（14L：10D）恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落形成后，轉(zhuǎn)移到PDA斜面，再轉(zhuǎn)入4℃冰箱貯存。（3）菌株的分離利用5%的次氯酸鈉溶液對桑葚白果樣品進行表面消毒，消毒后的樣品在滅菌水中洗滌3次后放入PDA平板中，置于26±1℃恒溫箱中培養(yǎng)，將新產(chǎn)生的菌落或菌絲轉(zhuǎn)移到新的PDA平板上，培養(yǎng)觀察4-7天待形成菌落并產(chǎn)孢后，將初步根據(jù)菌落形態(tài)判斷為哈茨木霉菌的菌落編號為A、B、C、D、E、F共6個菌株，再轉(zhuǎn)入4℃冰箱貯存。2.菌株的形態(tài)學(xué)鑒定形態(tài)學(xué)方面的鑒定：觀察菌株的培養(yǎng)性狀、菌絲、分生孢子和產(chǎn)孢器等特征。哈茨木霉菌在PDA培養(yǎng)基上菌落深厚、致密，初期為白絮狀，后為暗綠色或綠色，背面呈黃色或淺綠色。分生孢子梗從菌絲的側(cè)枝上生出，對生或互生，有2～3次分枝，著生分生孢子的小梗瓶形或錐形。菌絲纖細(xì)無色，具分隔，多分枝；分生孢子多為球形、2～2.9×1.9～2.6μm，單孢，在小梗上聚集成球狀。3、菌株的篩選哈茨木霉菌在遺傳、生態(tài)及生物學(xué)等方面具有多樣性，同種真菌的不同菌株對防治目標(biāo)的致病力差異顯著，菌株不同，其LD50、LT50可相差數(shù)倍至數(shù)十倍。高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株的篩選與獲得是取得較好防治效果的首要前提。以常用的致病力、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率等3個指標(biāo)為篩選菌株的依據(jù)，篩選優(yōu)良的哈茨木霉菌菌株。（1）供試菌株的處理經(jīng)純化后獲得的哈茨木霉菌A、B、C、D、E、F共6個分離株，在PDA平板于26±1℃的恒溫箱（14L：10D）中培養(yǎng)。（2）供試病原菌將核盤菌接入PDA平板中，放置于26±1℃恒溫箱中培養(yǎng)，待產(chǎn)生菌絲后用直徑為5mm的打孔器取新鮮菌絲塊備用。（3）產(chǎn)孢量的測定將6個分離株分別配制成1×106孢子/ml的分生孢子懸液，分別取1ml懸液滴入PDA培養(yǎng)基后涂勻，待1～2d長出菌絲后用直徑為5mm的打孔器取新鮮菌絲塊，接種于PDA平板上，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（L:D=14:10）。每個菌株5次重復(fù)。第8～10d加入0.1%吐溫－80無菌水并收集孢子，在磁力攪拌器上攪拌20分鐘，使孢子充分分散，制成孢子懸浮液，用血球記數(shù)板記數(shù)測定產(chǎn)孢量。6個分離株的產(chǎn)孢量見表1，生長8~10d后，分離株A、E的產(chǎn)孢量與B、C、D分離株之間的產(chǎn)孢量差異顯著，其中E分離株的產(chǎn)孢量最高。表1哈茨木霉菌6個分離株的產(chǎn)孢量（8~10d）分離株產(chǎn)孢量（分生孢子/mL）A4.51±0.07×109aB4.07±0.09×109bcC4.16±0.09×109bD3.69±0.11×109cE4.75±0.16×109aF4.27±0.20×109ab注：表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著（DMRT法）。（4）孢子萌發(fā)率的測定將6個分離株分別培養(yǎng)5d后，用無菌水收集孢子并制成懸液，用載玻片萌發(fā)法試驗。將孢子懸液滴在無菌載玻片上，置于底部鋪有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，在皿內(nèi)滴加3～4滴無菌水保濕（100，RH），培養(yǎng)24h后鏡檢，計算孢子萌發(fā)率（孢子萌發(fā)率%=萌發(fā)的孢子數(shù)/總孢子數(shù)×100%）。每個處理3次重復(fù)。6個分離株中，E分離株與其它分離株之間的分生孢子萌發(fā)率差異顯著（見表2）。其中E分離株的孢子平均萌發(fā)率最高，A分離株的孢子萌發(fā)率最低。表2哈茨木霉菌6個分離株分生孢子萌發(fā)率（24h）分離株孢子數(shù)量萌發(fā)率(%)M±SEA51261.1±0.2cB52381.9±2.2abC61184.7±1.8bD54071.6±1.8bE61389.7±1.0aF79177.0±0.9b注：表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著（DMRT法）。（5）哈茨木霉菌分離株的粗毒素對核盤菌的抑菌率測定將6個分離株的孢子用0.05%的吐溫-80無菌水配制成濃度為1×108孢子/mL的孢子懸液，然后取2ml加入200ml的Czapek培養(yǎng)液中，在26±1℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)5d；將等體積的乙酸乙酯加入帶有菌絲的培養(yǎng)液中抽提其中的真菌毒素，2天后取有機相濃縮獲得哈茨木霉毒素，將連續(xù)3次抽提濃縮的毒素合并后放入-20℃冷凍備用。將8個分離株的粗毒素分別稀釋后加入PDA培養(yǎng)基中配制成濃度為0、5mg/L的PDA平板。將核盤菌接種到PDA平板上，待菌絲長滿平板后取核盤菌的菌絲塊（）放入帶有毒素的PDA平板中央，放置于26±1℃恒溫箱中培養(yǎng)，第24、48h測菌絲生長直徑，計算抑菌率。上述所有試驗數(shù)據(jù)均在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。結(jié)果如表3所示，所有E分離株的抑菌率與其它分離株相比差異顯著，其抑菌率明顯高于其它分離株。在第24、48h時E分離株對核盤菌的抑菌率最強，平均分別為67.8%和64.5%，B分離株的抑菌率較低，為51.6%/49.9%（24/48h）。表3哈茨木霉菌6個分離株的粗毒素對核盤菌的抑菌率注：表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著（DMRT法）。（6）哈茨木霉菌對多菌靈的抗藥性測定將6個分離株分別培養(yǎng)5d后，用濃度為5mg/L多菌靈的無菌水收集孢子并制成懸液，用載玻片萌發(fā)法試驗。將孢子懸液滴在無菌載玻片上，置于底部鋪有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，在皿內(nèi)滴加3～4滴無菌水保濕（100，RH），培養(yǎng)24h后鏡檢，計算孢子萌發(fā)率（孢子萌發(fā)率%=萌發(fā)的孢子數(shù)/總孢子數(shù)×100%）。每個處理3次重復(fù)。將多菌靈加入PDA培養(yǎng)基中配制成濃度為5mg/L的PDA平板。將哈茨木霉菌的孢子涂布到PDA平板上，待菌絲長滿平板后取哈茨木霉菌的菌絲塊（）放入帶有濃度為0、5mg/L多菌靈的PDA平板中央，放置于26±1℃恒溫箱中培養(yǎng)，第24、48h測菌落生長直徑，計算菌絲生長抑制率，抑制率（%）=（（對照區(qū)菌落生長直徑－處理區(qū)菌落生長直徑）/對照區(qū)菌落生長直徑）×100%。上述所有試驗數(shù)據(jù)均在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。結(jié)果如表4所示，多菌靈對E菌株的孢子萌發(fā)率無影響（表2中沒有加入多菌靈時的孢子萌發(fā)率為89.7%），多菌靈對B、C、E分離株菌絲生長抑制率與其它分離株相比差異顯著，多菌靈對B、C、E分離株菌絲生長抑制率明顯低于其它分離株。在第24h時多菌靈對E分離株菌絲生長抑制率最低、為4.6%，多菌靈對A分離株菌絲生長抑制率較高，為13.0%（24h）。表4哈茨木霉菌對多菌靈的抗藥性測定分離株孢子萌發(fā)率（%）M±SE（24h）菌絲生長抑制率（%）M±SE（24h）A57.9±1.5c13.0±0.3aB72.8±0.2b7.8±0.1bC79.8±1.3ab6.8±0.1bD66.5±3.5bc11.5±0.7aE85.6±0.4a4.6±0.2cF65.0±1.1bc9.8±0.2ab注：表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著（DMRT法）。（7）哈茨木霉菌分離株的篩選結(jié)果在篩選優(yōu)良分離株時，抗多菌靈、致病性和產(chǎn)孢量的高低是重要的參考指標(biāo)，孢子萌發(fā)率次之。綜上研究結(jié)果顯示，E分離株與其它分離株之間在抗多菌靈、孢子萌發(fā)率、產(chǎn)孢量和致病性等方面差異顯著。綜合比較各方面的因素，E分離株為最佳分離菌株。4、最佳分離菌株的分子鑒定，以ITS1和ITS4為引物，擴增菌株基因組中的rDNA-ITS序列，然后在GENBANK中進行BLAST比對分析。將分離株接種于Czapek培養(yǎng)液中，于26±1℃、200rpm條件下培養(yǎng)，2～3天后收獲菌絲，采用CTAB法抽提菌絲的基因組DNA，以菌株的基因組DNA為模板，以ITS1（序列如SEQIDNO:2所示）和ITS4（序列如SEQIDNO:3所示）為引物擴增rDNA-ITS區(qū)的序列片段，并測序后進行BLAST比對分析。其中，PCR反應(yīng)體系（25ul）：Taq酶0.25ul、10xbuffer2.5ul、dNTP0.2ul、10umol/L的Primer各1ul、ddH2O19.05ul、DNA模板25ng。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min、共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，回收目標(biāo)DNA片段后連接到pMD18-T載體后送樣測序。對所測序列進行BLAST比對，分析表明，所檢測的序列與GENBANK中哈茨木霉Trichodermaharzianum（Hypocrealixii）的GU934533序列的相似性為99.8%，說明所檢測序列為哈茨木霉菌的序列，該菌株為哈茨木霉菌，序列如SEQIDNO.1所示。經(jīng)過分子鑒定，確定該菌株為哈茨木霉菌（Trichodermaharzianum），屬半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科。將該菌株命名為Th-N5菌株，并于2016年5月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），菌種保藏號為CCTCCNo:M2016251，分類命名號為：TrichodermaharzianumTh-N5；保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。實施例2哈茨木霉菌Th-N5的粗毒素對核盤菌的致病力測定1、生物測定是檢測生防真菌對目標(biāo)病原菌的致死程度和致死速率的有效手段之一，能為綜合評價該真菌的生物防治潛力提供重要的參考依據(jù)。本發(fā)明就所述的哈茨木霉菌Th-N5的粗毒素對核盤菌的致病力進行測定，以篩選在防治時所用的最佳濃度。供試菌株：哈茨木霉菌Th-N5菌株，核盤菌。（1）供試菌株粗毒素和核盤菌菌絲塊的制備取純化后的哈茨木霉菌Th-N5菌株的孢子用0.05%的吐溫-80無菌水配制成濃度為1×108分生孢子/mL的孢子懸液，然后取2ml加入200ml的Czapek培養(yǎng)液中，在26±1℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)5d，將等體積的乙酸乙酯加入帶有菌絲的培養(yǎng)液中抽提其中的真菌毒素，2天后取有機相濃縮獲得哈茨木霉毒素，將連續(xù)3次抽提濃縮的毒素合并后放入-20℃冷凍備用。將核盤菌接入PDA平板中，放置于26±1℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌絲長滿平板后用直徑為5mm的打孔器取新鮮菌絲塊備用。（2）粗毒素對核盤菌抑菌率的測定將粗毒素稀釋后加入培養(yǎng)基中配制成濃度為0、2、4、8、16、32ppm的PDA平板。將核盤菌的菌絲塊（）放入帶有毒素的PDA平板中央，放置于26±1℃恒溫箱中培養(yǎng)，第24、48h后測菌絲生長直徑，計算抑菌率。上述所有試驗數(shù)據(jù)均在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。2、結(jié)果表5為各處理區(qū)粗毒素的抑菌率，結(jié)果表明，隨著粗毒素濃度的增加對核盤菌的抑菌率增加，同一濃度下隨著時間的增加，其對核盤菌的抑菌率減弱。表5不同濃度的Th-N5菌株粗毒素對核盤菌的抑菌率測定濃度（ppm）抑菌率(%)M±SE（24h）抑菌率(%)M±SE（48h）119.1±0.5e17.4±0.9e233.3±2.6d31.6±2.2d453.7±2.6c51.9±1.7c885.2±2.3b82.5±2.6b16100.0±0.0a96.9±0.4a注：表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著（DMRT法）。另外，經(jīng)過測定，哈茨木霉菌Th-N5菌株對桑實杯盤菌（Ciboriashiraiana）、肉阜狀杯盤菌（Ciboriacarunculoides）和核地杖菌（Scleromitulashiraiana）都有較好的抑菌效果。實施例3哈茨木霉菌Th-N5菌株與低濃度多菌靈混合防治桑葚白果病1、方法供試菌株與多菌靈：哈茨木霉菌Th-N5菌株，多菌靈購自廣東省農(nóng)科院植保研究所。（1）供試菌株孢子懸浮液與多菌靈混合液的制備經(jīng)純化后獲得的哈茨木霉菌Th-N5菌株，在PDA平板上放入25±1℃的恒溫箱（14L：10D）中培養(yǎng)5天，加入0.3%吐溫-80的無菌水收集孢子，將孢子懸浮液在磁力攪拌器上攪拌20分鐘，待孢子被打散均勻后，用醫(yī)用紗布過濾去雜質(zhì)，獲得孢子懸浮液，用血球記數(shù)板記數(shù)確定孢子濃度后配成1×107孢子/ml的孢子液備用。將多菌靈加入配成1×107孢子/ml的孢子液中配制成濃度為0、25、50和100mg/L的混合液備用（多菌靈折算為原藥的含量）。（2）哈茨木霉菌Th-N5與低濃度多菌靈混合對桑葚白果病的防治選擇生長和管理水平一致的2年生盆栽桑樹為實驗對象，桑樹品種為大十，將36顆桑樹隨機分成12個小區(qū)，每個小區(qū)3顆樹、小區(qū)四周有4m的保護地帶。試驗共設(shè)7個處理：1）分別為0（清水）、；2）25mg/L/50mg/L/100mg/L的多菌靈；3）1×107孢子/ml的哈茨木霉孢子懸浮液；4）25mg/L的多菌靈+1×107孢子/ml的哈茨木霉孢子懸浮液；5）50mg/L的多菌靈+1×107孢子/ml的哈茨木霉孢子懸浮液。每個處理2次重復(fù)，共12個小區(qū)。每個小區(qū)在桑樹的花期按常規(guī)方法噴霧施藥，統(tǒng)一于2016年3月1日、3月8日、3月15日、3月22日、3月29日、4月5日、4月12日按方案將藥物噴到桑樹的花及附近的枝條上。防治用藥期間氣溫為8～22℃，噴藥當(dāng)天無雨，如噴藥后下雨則雨停后重新噴藥。在5月10日進行桑葚白果病的調(diào)查，每棵樹隨機調(diào)查3根枝條，記錄每根枝條的總果數(shù)和病果數(shù)，計算防治效果。防治效果（%）=（（對照組發(fā)病率－處理組的發(fā)病率）/對照組的發(fā)病率）×100%。上述所有試驗數(shù)據(jù)均在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。2、結(jié)果如表6所示，哈茨木霉菌Th-N5菌株與低濃度多菌靈混合使用，對桑葚白果病的防效可達到100%，實現(xiàn)病害的徹底控制，而且大大降低了化學(xué)農(nóng)藥多菌靈的用量。表6不同處理區(qū)桑葚白果病的防治效果比較處理平均發(fā)病率（%）防治效果（%）0（水）42.2±1.6a25mg/L28.6±1.8b32.2±1.8c50mg/L14.5±0.7c65.6±0.7b100mg/L0.0±0.0d100.0±0.0d1×1077.0±1.6d83.3±1.5ab25+(1×107)2.0±0.3d95.3±1.4a50+(1×107)0.0±0.0d100.0±0.0d注：表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著（DMRT法）。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一株抗多菌靈的哈茨木霉菌株Th-N5及其應(yīng)用<130>2016<160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>622<212>DNA<213>TrichodermaharzianumTh-N5<400>1gttccgtagggtgaacctgcggagggatcattaccgagtttacaactcccaaacccaatg60tgaacgttaccaaactgttgcctcggcgggatctctgccccgggtgcgtcgcagccccgg120accaaggcgcccgccggaggaccaaccaaaactctttttgtataccccctcgcgggtttt180ttataatctgagccttctcggcgcctctcgtaggcgtttcgaaaatgaatcaaaactttc240aacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatg300tgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtatt360ctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccggggggtcggcg420ttggggatcggccctcccttagcgggtggccgtctccgaaatacagtggcggtctcgccg480cagcctctcctgcgcagtagtttgcacactcgcatcgggagcgcggcgcgtccacagccg540ttaaacacccaacttctgaaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaactta600agcatatcaataagcggaggaa622<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2tccgtagggtgaacctgcgg20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3tcctccgcttattgatatgc20當(dāng)前第1頁1 2 3