本發(fā)明涉及微生物、分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一株利用木糖釀酒酵母菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，乙醇的生產(chǎn)主要通過淀粉或者一些農(nóng)作物中的蔗糖，比如玉米、甘蔗和甜菜。出于經(jīng)濟(jì)和環(huán)境方面的考慮，利用農(nóng)業(yè)廢物和其他一些低成本的碳水化合物原料進(jìn)行生物乙醇的生產(chǎn)得到廣泛關(guān)注，包括玉米秸稈、甘蔗渣、麥秸、不可回收利用紙張以及柳枝稷。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)主要由纖維素、半纖維素、果膠和木質(zhì)素組成，主要的糖成分是葡萄糖，但是含有20％的戊糖，比如D-木糖和L-阿拉伯糖。

用木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)生物乙醇近年來獲得了廣泛關(guān)注，因?yàn)楹鸵缘矸酆驼崽菫橹鞯脑舷啾?，這種原料量多且便宜。釀酒酵母，是工業(yè)上利用己糖生產(chǎn)生物乙醇的首選微生物，但是它本身不能利用D-木糖(木質(zhì)纖維素水解液的第二大成分)。在過去的20年里，學(xué)者們對釀酒酵母利用木糖產(chǎn)乙醇進(jìn)行了大量研究，主要集中在對細(xì)菌和真菌木糖利用基因的功能表達(dá)和對PP途徑的操作上，來加強(qiáng)釀酒酵母對木糖的利用和發(fā)酵。

微生物中木糖代謝的途徑有三條，但是目前僅有兩條被引入釀酒酵母中。細(xì)菌通過木糖異構(gòu)酶途徑(XI)將木糖直接轉(zhuǎn)化為5-木酮糖。盡管XI途徑不需要吡啶核酸輔因子，但是許多原核生物的XI(由xylA編碼)在釀酒酵母中表達(dá)后都沒有活性。這可以歸因于許多原因，包括蛋白錯(cuò)誤折疊、翻譯后修飾錯(cuò)誤、不正確的二硫鍵形成、不良的內(nèi)部pH和特定金屬離子的缺失。

絲狀真菌和一些酵母通過一個(gè)包含兩步反應(yīng)的氧化還原途徑來代謝木糖。首先，由XYL1編碼的NAD(P)H依賴型木糖還原酶(XR)將木糖還原成木糖醇；然后，由XYL2編碼的NAD⁺依賴型木糖醇脫氫酶將木糖醇氧化成5-木酮糖。盡管在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)了編碼XR和XDH的同源基因，但是釀酒酵母不能單獨(dú)利用木糖生長。過表達(dá)釀酒酵母自身的醛糖還原酶和木糖醇脫氫酶，雖然菌體能以木糖生長，但是生長速率非常低。在這一內(nèi)源木糖代謝途徑被發(fā)現(xiàn)之前，人們就已經(jīng)開始在釀酒酵母中引入能夠利用木糖的酵母中的木糖代謝途徑。樹干畢赤酵母的XR/XDH途徑在木糖發(fā)酵釀酒酵母的改造中是應(yīng)用最為廣泛的，盡管它有一個(gè)很嚴(yán)重的問題，XR偏好NADPH，XDH嚴(yán)格依賴NAD⁺。輔因子的不平衡導(dǎo)致木糖醇的分泌，使得工程菌碳利用和乙醇產(chǎn)量減少。為此學(xué)者們進(jìn)行了很多嘗試，用了很多方法來緩解輔因子不平衡的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題時(shí)提供一株共利用木糖和葡萄糖的的釀酒酵母重組菌，以提高釀酒酵母發(fā)酵過程中木糖利用率。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述釀酒酵母的構(gòu)建方法。

本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供上述釀酒酵母在發(fā)酵中的應(yīng)用。

一株能共利用木糖和葡萄糖的釀酒酵母基因工程菌，在釀酒酵母菌中導(dǎo)入了來源于熱帶假絲酵母的木糖還原酶XR和木糖醇脫氫酶XDH。

其中，所述的釀酒酵母菌為S.cerevisiae BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)。

其中，所述的木糖還原酶XR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：1所示，所述的木糖醇脫氫酶XDH其核苷酸序列如SEQ ID NO.：2所示。

其中，所述的木糖還原酶XR和木糖醇脫氫酶XDH的基因的啟動(dòng)子為TEF1或PGK1；

所述TEF1啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO.：3所示；

所述PGK1啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO.：4所示；

優(yōu)選木糖還原酶XR的啟動(dòng)子為TEF1啟動(dòng)子，XDH的啟動(dòng)子為PGK1啟動(dòng)子。

其中，所述木糖還原酶XR基因和木糖醇脫氫酶XDH的基因的3’端克隆有終止子，所述終止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.：5所示。

上述能共利用木糖和葡萄糖的釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

用overlap PCR得到包含啟動(dòng)子、目的基因、終止子的DNA片段，將該DNA片段克隆到pYX212質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒；

(2)將步驟(1)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌。

上述能共利用木糖和葡萄糖的釀酒酵母基因工程菌在發(fā)酵中的應(yīng)用。

其中，發(fā)酵培養(yǎng)基中，木糖與葡萄糖的質(zhì)量比例為1:5～5:1，優(yōu)選質(zhì)量比為2：1

其中，發(fā)酵前，種子培養(yǎng)培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為20-24h，轉(zhuǎn)速為200rpm，種子培養(yǎng)基的包括：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，初始pH5.2，溶劑為水；

發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)溫度為30～32℃，培養(yǎng)時(shí)間為40～108h，轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵培養(yǎng)基的組分包括：葡萄糖10～50g/L，木糖10～50g/L，酵母粉10～20g/L，蛋白胨20～30g/L，初始pH5.2～5.5

具體的培養(yǎng)方法如下：用接種環(huán)或槍頭從-80℃保藏的30％甘油管中的單菌落挑取適量接種于5mlYPD液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm培養(yǎng)20～24h，此培養(yǎng)物為一級種子。

一級種子培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)接于裝有100ml YPD液體培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，接種量5～10％，30℃，200rpm培養(yǎng)20～24h，此培養(yǎng)物為二級種子。

二級種子培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的接種。轉(zhuǎn)接于裝有100ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，接種量5～10％。30～32℃，200rpm條件下進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵條件為好氧培養(yǎng)，控制方法為發(fā)酵過程中在500ml錐形瓶瓶口包扎八層紗布。

培養(yǎng)基成分：

種子培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，初始pH5.2。發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖10-50g/L，木糖10-50g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，初始pH5.2。

培養(yǎng)基滅菌條件：115℃，20min。

有益效果：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明在單倍體釀酒酵母菌株BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)中用釀酒酵母內(nèi)源啟動(dòng)子TEF1、PGK1p以表達(dá)載體組成型高拷貝質(zhì)粒pYX212過表達(dá)來源于熱帶假絲酵母的木糖還原酶XR(由XYL1編碼)和木糖醇脫氫酶XDH(由XYL2編碼)，得到能木糖利用菌株XR-pXDH。該方法應(yīng)用常用組成型高拷貝質(zhì)粒pYX212在釀酒酵母菌株中過表達(dá)木糖還原酶XR和木糖醇脫氫酶XDH，能夠?qū)崿F(xiàn)在混糖發(fā)酵過程中提高木糖、葡萄糖共利用過程中木糖的消耗速率。本發(fā)明分子操作簡單，無需經(jīng)過長期的進(jìn)化過程，是解決木糖利用重組釀酒酵母中普遍存在的木糖消耗速率低下問題的一種嘗試。

附圖說明

圖1以啟動(dòng)子TEF1p分別過表達(dá)XR和XDH質(zhì)粒載體圖譜；其中，XR的啟動(dòng)子為TPI1p，終止子為CYCt，XDH的啟動(dòng)子為TPI1p，終止子為CYCt，所用表達(dá)質(zhì)粒為組成型高拷貝質(zhì)粒pYX212。

圖2以啟動(dòng)子TEF1p過表達(dá)XR，以啟動(dòng)子PGK1p過表達(dá)XDH質(zhì)粒載體圖譜；其中，其中，XR的啟動(dòng)子為TPI1p，終止子為CYCt，XDH的啟動(dòng)子為TPI1p，XDH的啟動(dòng)子為PGK1p，終止子為CYCt，所用表達(dá)質(zhì)粒為組成型高拷貝質(zhì)粒pYX212。

圖3 CON，Ctp與XR-XDH以葡萄糖為碳源時(shí)葡萄糖消耗(A)、菌體生長(B)、乙醇產(chǎn)生(C)情況。

圖4 CON，Ctp與XR-XDH以葡萄糖、木糖混合糖為碳源時(shí)葡萄糖、木糖消耗(A)、菌體生長(B)、木糖醇積累(C)、乙醇產(chǎn)生(D)情況。

圖5 XR-XDH與RH-TAL，RH-XK以葡萄糖為碳源時(shí)葡萄糖消耗(A)、菌體生長(B)、乙醇產(chǎn)生(C)情況。

圖6 XR-XDH與RH-TAL，RH-XK以葡萄糖、木糖混合糖為碳源時(shí)葡萄糖、木糖消耗(A)、菌體生長(B)、木糖醇積累(C)情況。

圖7對照菌株CON、XR-XDH與XR-pXDH以葡萄糖為碳源時(shí)葡萄糖消耗(A)、菌體生長(B)、乙醇產(chǎn)生(C)情況。

圖8示對照菌株CON、XR-XDH與XR-pXDH以葡萄糖、木糖混合糖為碳源時(shí)葡萄糖、木糖消耗(A)、菌體生長(B)、木糖醇積累(C)情況。

圖9示XR-pXDH在不同木糖、葡萄糖比例下的木糖消耗(A)、菌體生長(B)、木糖醇積累(C)、乙酸積累(D)情況。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了一種菌株、其制備方法及應(yīng)用，以及該菌株的發(fā)酵方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明以木糖利用釀酒酵母菌株BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)為出發(fā)菌株，以表達(dá)載體組成型高拷貝質(zhì)粒pYX212過表達(dá)以TEF1p為啟動(dòng)子的XR和以PGK1p為啟動(dòng)子的XDH(圖2)，得到菌株XR-pXDH。用該菌株做葡萄糖單糖，木糖、葡萄糖混糖好氧培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵過程中用高效液相色譜HPLC測定培養(yǎng)基中的葡萄糖、木糖、木糖醇含量，用氣相色譜測定乙醇含量。

種子培養(yǎng)基為YPD，發(fā)酵培養(yǎng)基為YP(D+X)。所述所選啟動(dòng)子為以TEF1p為啟動(dòng)子的XR和以PGK1p為啟動(dòng)子的XDH，在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，以TEF1p為XDH的啟動(dòng)子。

用接種環(huán)或槍頭從-80℃保藏的30％甘油管中的單菌落挑取適量接種于5ml YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm培養(yǎng)20～24h，此培養(yǎng)物為一級種子。

一級種子培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)接于裝有100ml YPD液體培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，接種量5～10％，30℃，200rpm培養(yǎng)20～24h，此培養(yǎng)物為二級種子。

二級種子培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的接種。轉(zhuǎn)接于裝有100ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，接種量5～10％。30～32℃，200rpm條件下進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵條件為好氧培養(yǎng)，控制方法為發(fā)酵過程中在500ml錐形瓶瓶口包扎八層紗布。

發(fā)酵過程中每24h進(jìn)行取樣分析，HPLC條件：Bio-Rad Aminex HPX–87H色譜柱，柱溫55℃，流動(dòng)相為5mmol H₂SO₄，流速0.4ml/min，每個(gè)樣品運(yùn)行25min。

結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為20g/L，木糖濃度為40g/L時(shí)，木糖消耗、菌體生長、木糖醇積累等綜合情況最優(yōu)。本發(fā)明提供的菌株、其制備方法及應(yīng)用，以及該菌株的發(fā)酵方法中所用原料及試劑均可由市場購得。其中，所用宿主菌株為釀酒酵母BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)。所用表達(dá)載體為組成型高拷貝質(zhì)粒pYX212。XR的啟動(dòng)子為TEF1p，XDH的啟動(dòng)子為PGK1p。

本專利所用的對照菌株，獲得方式為：在BY4741中表達(dá)空質(zhì)粒pYX212，命名為“CON”。

實(shí)施例1：

以木糖利用釀酒酵母菌株BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)為出發(fā)菌株，以表達(dá)載體組成型高拷貝質(zhì)粒pYX212過表達(dá)以TEF1p為啟動(dòng)子的XR和XDH，得到重組菌株XR-XDH；含有空質(zhì)粒的酒酵母菌株BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)為對照菌CON；XR和XDH的來源菌株熱帶假絲酵母Candida tropicalis 121也作為對照菌(以下簡寫為Ctp菌株)。

用上述三株菌做葡萄糖好氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：

種子培養(yǎng)基為合成培養(yǎng)基YPD，發(fā)酵培養(yǎng)基為初糖濃度為100g/L的YPD培養(yǎng)基。用接種環(huán)或槍頭從-80℃保藏的30％甘油管中的單菌落挑取適量接種于5ml YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm培養(yǎng)20～24h，此培養(yǎng)物為一級種子。

一級種子培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)接于裝有100ml YPD液體培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，接種量5～10％，30℃，200rpm培養(yǎng)20～24h，此培養(yǎng)物為二級種子。

二級種子培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的接種。轉(zhuǎn)接于裝有100ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，接種量5～10％。30～32℃，200rpm條件下進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵條件為好氧培養(yǎng)，控制方法為發(fā)酵過程中在500ml錐形瓶瓶口包扎八層紗布。

發(fā)酵過程中每24h進(jìn)行取樣分析，HPLC條件：Bio-Rad Aminex HPX–87H色譜柱，柱溫55℃，流動(dòng)相為5mmol H₂SO₄，流速0.4ml/min，每個(gè)樣品運(yùn)行25min。氣相色譜配有火焰離子化檢測器和30-m毛細(xì)管柱(Equity 1^TM；30m×0.32mm×1.0μm film thickness；Supelco Co,Bellefonate,PA,USA)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖3所示，圖3中釀酒酵母對照菌株CON，對照菌株熱帶假絲酵母Ctp，過表達(dá)以TEF1為啟動(dòng)子的XR、XDH的釀酒酵母菌株XR-XDH。

結(jié)果顯示，XR、XDH的親代菌株Ctp利用葡萄糖的能力十分優(yōu)越，24h就能把100g/L的葡萄糖耗完，乙醇產(chǎn)量達(dá)到最大，菌體生長非常迅速，12h就能達(dá)到最大值。和CON相比，雖然在以葡萄糖為碳源時(shí)，XR和XDH不需要發(fā)揮作用，但是XR-XDH菌株的葡萄糖消耗、菌體生長、乙醇產(chǎn)量均優(yōu)于CON。

實(shí)施例2：

對實(shí)施例1中的三株菌進(jìn)行葡萄糖、木糖混合糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。種子培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。發(fā)酵培養(yǎng)基為20g/L葡萄糖，40g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨。檢測方法同實(shí)施例1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，圖4釀酒酵母對照菌株CON，熱帶假絲酵母Ctp，過表達(dá)以TEF1為啟動(dòng)子的XR、XDH的釀酒酵母菌株XR-XDH，葡萄糖、木糖混合糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果表明，Ctp菌株3天就能將木糖耗完，但是CON和XR-XDH菌株幾乎不能利用木糖，菌體生長和乙醇產(chǎn)生也只限于葡萄糖利用階段，葡萄糖耗盡后，轉(zhuǎn)而利用乙醇作為碳源維持生長。

實(shí)施例3：

在XR-XDH菌株中進(jìn)一步過表達(dá)來源于熱帶假絲酵母的木酮糖激酶XK，轉(zhuǎn)醛醇酶TAL，得到菌株RH-TAL，RH-XK，進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵。培養(yǎng)及檢測方法同實(shí)施例1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，圖5以TEF1為啟動(dòng)子的XR、XDH的菌株XR-XDH，進(jìn)一步過表達(dá)來源于熱帶假絲酵母的轉(zhuǎn)醛醇酶的菌株RH-TAL，進(jìn)一步過表達(dá)來源于熱帶假絲酵母的木酮糖激酶XK的菌株RH-XK的葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果表明，過表達(dá)PPP途徑非氧化部分的關(guān)鍵酶木酮糖激酶XK，能夠顯著提高葡萄糖消耗速率(RH-XK 28h vs.RH 48h)，菌體生長明顯加快，但是乙醇產(chǎn)量有所減少，分析原因可能是因?yàn)檫^表達(dá)XK加大了PPP途徑的通量，促進(jìn)了生物質(zhì)合成，但是相對減少了糖酵解途徑通量，導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量降低。而過表達(dá)轉(zhuǎn)醛醇酶對葡萄糖消耗、菌體生長及乙醇產(chǎn)生都沒有益處。

實(shí)施例4：

對實(shí)施例3中的三種菌株進(jìn)行葡萄糖、木糖混合糖發(fā)酵。培養(yǎng)及檢測方法同實(shí)施例2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，圖6以TEF1為啟動(dòng)子的XR、XDH的菌株XR-XDH，進(jìn)一步過表達(dá)來源于熱帶假絲酵母的轉(zhuǎn)醛醇酶的菌株RH-TAL，進(jìn)一步過表達(dá)來源于熱帶假絲酵母的木酮糖激酶XK的菌株RH-XK的葡萄糖(20g/L)、木糖(40g/L)混合糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果表明，和XR-XDH相比，RH-XK雖然能在提高木糖消耗的同時(shí)減少木糖醇積累，但是木糖消耗速率依然非常低，無法滿足應(yīng)用需求。

實(shí)施例5:

發(fā)酵過程中木糖醇的積累可能是因?yàn)槟咎谴嫉侥就堑姆磻?yīng)為限速步驟。將XDH的啟動(dòng)子由TEF1換成PGK1，得到菌株XR-pXDH，對CON，XR-XDH，XR-pXDH進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)及檢測方法同實(shí)施例1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，對照菌株CON，以TEF1為啟動(dòng)子的XDH的菌株XR-XDH，以PGK1為啟動(dòng)子的XDH的菌株XR-pXDH的葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果表明，以葡萄糖為碳源時(shí)，和XR-XDH相比，更換XDH啟動(dòng)子后的菌株能在不影響乙醇產(chǎn)量的情況下提高葡萄糖消耗速率和菌體生長速率。

實(shí)施例6：

對實(shí)施例5中的三種菌株進(jìn)行葡萄糖、木糖混合糖發(fā)酵。培養(yǎng)及檢測方法同實(shí)施例2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，對照菌株CON，以TEF1為啟動(dòng)子的XDH的菌株XR-XDH，以PGK1為啟動(dòng)子的XDH的菌株XR-pXDH的葡萄糖(20g/L)、木糖(40g/L)混合糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果表明，和XR-XDH相比，更換XDH啟動(dòng)子后的菌株能有效利用木糖，該菌株菌體生長在葡萄糖耗盡之后經(jīng)歷一個(gè)穩(wěn)定期，繼而利用木糖繼續(xù)生長。產(chǎn)物主要為木糖醇。

實(shí)施例7：

對XR-pXDH菌株進(jìn)行木糖、葡萄糖不同比例實(shí)驗(yàn)?？偺菨舛瓤刂圃?0g/L。培養(yǎng)及檢測條件同實(shí)施例2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，XR-pXDH菌株木糖、葡萄糖不同比例實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果表明，當(dāng)木糖：葡萄糖＝4:2時(shí)，即木糖40g/L、葡萄糖20g/L時(shí)，菌株的木糖消耗、菌體生長都比較好，副產(chǎn)物乙酸積累量少。木糖比例更高時(shí)，木糖消耗速率很慢。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京工業(yè)大學(xué)

<120> 一株能共利用木糖和葡萄糖的釀酒酵母基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

<130> SG20161027001

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 975

<212> DNA

<213> 木糖還原酶XR核苷酸序列

<400> 1

atgtctacta ctcctactat tcctaccatt aaattaaact ctggttatga aatgccatta 60

gttggtttcg gatgttggaa agtcaataat gaaactgctg ctgaccaaat ctacaatgct 120

atcaaaactg gttacagatt atttgatggt gctgaagatt acggtaatga aaaagaagtt 180

ggtgaaggta ttaacagagc cattaaagaa ggattagtta aaagagaaga attattcatc 240

acttctaaat tatggaacaa tttccatgat ccaaagaatg ttgaaactgc tttaaacaaa 300

actttaagtg acttgaactt ggactatgtt gatttattct tgattcattt tccaattgct 360

tttaaatttg ttccaattga agaaaaatac ccacctggtt tctactgtgg tgatggtgat 420

aacttccact atgaagatgt tccattatta gatacttgga aagctttgga aaaattggtt 480

gaagctggta agatcaaatc tattggtatt tccaatttta ctggtgcttt gatttacgat 540

ttgatcagag gtgctactat caaaccagct gttttacaaa ttgaacatca cccatacttg 600

caacaaccaa aattgattga atatgttcaa aaagctggta ttgccattac tggttactct 660

tcatttggtc cacaatcatt cttggaattg gaatccaaga gagctttgaa taccccaact 720

ttatttgaac atgaaactat taaatcaatt gctgataaac atggtaaatc cccagctcaa 780

gttttgttaa gatgggctac tcaaagaaac attgctgtta ttccaaaatc aaacagtcca 840

gaaagattag ctcaaaactt gtctgttgtt gactttgact tgactcaaga agatttggac 900

aatattgcta aattggacat tggtttgaga ttcaatgatc catgggactg ggacaacatt 960

ccaatctttg tttaa 975

<210> 2

<211> 1095

<212> DNA

<213> 木糖醇脫氫酶XDH核苷酸序列

<400> 2

atgactgcaa acccatcatt agttcttaac aaagttgacg atatttcctt tgaagaatac 60

gaagctccaa aactcgaatc accaagagat gtcattgttg aagttaagaa aactggtatc 120

tgtggatcag atatccatta ctatgcccat ggttcaattg gtccatttat tttaagaaaa 180

ccaatggttt taggtcacga atcagcaggt gttgtttctg ctgtcggaag tgaagttacc 240

aacttgaagg ttggtgatag agttgccatt gaacctggtg taccttcaag atttagtgat 300

gagaccaaat ctggtcatta tcatttgtgc ccacatatgt cttttgccgc caccccacca 360

gttaacccag atgaaccaaa tcctcaaggt actttatgta aatactacag agtcccatgt 420

gactttttat tcaaattacc agatcatgtt tctttggagt tgggtgctat ggttgaacca 480

ttaactgttg gtgtccacgg ttgtaaattg gctgatttga aatttggtga agacgttgtt 540

gtttttggtg ccggtccagt tggtttgttg accgctgccg ttgctagaac aattggtgct 600

aaaagagtca tggttgttga tatttttgac aacaaattga agatggcaaa agatatgggt 660

gctgccactc atattttcaa ctcaaaaacc ggtggtgatt atcaagattt gatcaagagt 720

tttgatggtg ttcaaccttc agttgttttg gaatgtagtg gtgctcaacc atgtatctat 780

atgggtgtta aaatcttgaa agctggtggt agatttgttc aaattggtaa tgccggtggt 840

gatgtcaatt tcccaattgc tgatttctca accagagaat tggcattata tggttctttc 900

agatatggtt acggtgacta ccaaacttca attgatattt tagacagaaa ctacgtcaat 960

ggtaaagaca aagcaccaat taatttcgaa ttgttgatta ctcacagatt caagtttaaa 1020

gatgccatca aagcctatga tttggtcaga gcaggaaatg gtgctgtcaa atgtttaatt 1080

gatggtccag aatag 1095

<210> 3

<211> 412

<212> DNA

<213> TEF1啟動(dòng)子的核苷酸序列

<400> 3

gatcccccac acaccatagc ttcaaaatgt ttctactcct tttttactct tccagatttt 60

ctcggactcc gcgcatcgcc gtaccacttc aaaacaccca agcacagcat actaaatttt 120

ccctctttct tcctctaggg tgtcgttaat tacccgtact aaaggtttgg aaaagaaaaa 180

agagaccgcc tcgtttcttt ttcttcgtcg aaaaaggcaa taaaaatttt tatcacgttt 240

ctttttcttg aaattttttt ttttagtttt tttctctttc agtgacctcc attgatattt 300

aagttaataa acggtcttca atttctcaag tttcagtttc atttttcttg ttctattaca 360

acttttttta cttcttgttc attagaaaga aagcatagca atctaatcta ag 412

<210> 4

<211> 750

<212> DNA

<213> PGK1啟動(dòng)子的核苷酸序列

<400> 4

acgcacagat attataacat ctgcataata ggcatttgca agaattactc gtgagtaagg 60

aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc gcgaatcctt 120

tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt ttccctcctt 180

cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga aattaccgtc 240

gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc tcgacttcct 300

gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag cgacggctca 360

caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt agtaccacat 420

gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg ttactctctc 480

tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca cacactcttt 540

tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac atttacatat 600

atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt tctaattcgt 660

agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc aaggaagtaa 720

ttatctactt tttacaacaa atataaaaca 750

<210> 5

<211> 248

<212> DNA

<213> 終止子的核苷酸序列

<400> 5

tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg 60

aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt 120

tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt 180

acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt 240

taatttgc 248