本發(fā)明涉及一株來源于土壤并能產(chǎn)生新天然產(chǎn)物安他擬酸的青霉菌Z08及其在醫(yī)藥、林業(yè)及農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

土壤微生物在土壤中度過它們?nèi)炕蛘卟糠值纳鼩v程,并在土壤內(nèi)部各種過程中發(fā)揮著重要作用,這些作用在許多方面影響人類的社會和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。很多土壤微生物可以分泌次生代謝產(chǎn)物，如根瘤菌分泌根瘤菌結(jié)瘤因子——脂殼寡糖，在根瘤菌與植物的共生結(jié)瘤過程中起重要作用。真菌天然產(chǎn)物還是天然藥物的重要來源之一^1，2，如麥角生物堿，二酮哌嗪，喹啉，喹唑啉，地西泮，和聚酮化合物等。大規(guī)模真菌基因組序列測序的完成表明真菌具有產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物的潛能，這類次生代謝產(chǎn)物已經(jīng)成為了研究的熱點和開發(fā)的方向^3，4，5。人們在20世紀(jì)初開始注意到微生物與土壤肥力之間的關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)一些難溶性的復(fù)合物施入土壤中，可以被作為磷源而應(yīng)用，人們從土壤中篩選出50多株細(xì)菌，其中幾株青霉菌在平板上形成了肉眼可見的溶磷圈⁶。隨著工業(yè)污染和環(huán)境破壞的日益嚴(yán)重，惡性腫瘤發(fā)病率正在逐年提高，而常規(guī)抗癌藥物又具有很大的副作用，所以抗腫瘤藥物的研發(fā)是藥物化學(xué)研究領(lǐng)域研究的重要課題。真菌天然產(chǎn)物表現(xiàn)出十分廣泛的生物學(xué)活性，包括抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫抑制等。

據(jù)報道⁷草酸青霉菌P8,具有溶解土壤中多種難溶磷的作用,適合南方的紅壤、北方的黑土、褐土、潮土等多種土壤類型,具有提高作物產(chǎn)量,活化土壤難溶磷、防止磷肥的土壤化學(xué)固定,提高磷肥利用效率的多種作用功能。馬忠?guī)r等⁸在公開的發(fā)明專利中指出，對番茄苗根部周圍撒播淡紫擬青霉菌菌劑處理，能夠顯著促進(jìn)番茄的生長，且效果穩(wěn)定，具有很好的推廣應(yīng)用前景。利用淡紫擬青霉菌株FJAT-9041制備辛硫磷的降解菌劑，能有效地降解農(nóng)藥辛硫磷⁹。田間試驗表明，接種溶磷菌-青霉菌可以增加玉米產(chǎn)量¹⁰。草酸青霉菌NJDL-03可修復(fù)土壤鉛污染及提高石灰性土壤磷素利用率，在促進(jìn)作物生長方面效果顯著¹¹。細(xì)腳擬青霉菌株培養(yǎng)產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗病毒、護(hù)肝、改善營養(yǎng)、抗衰老、提高耐缺氧能力、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等功能¹²。

由此可見，青霉菌在農(nóng)業(yè)與醫(yī)藥等方面均具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，有必要進(jìn)一步對青霉菌及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種來源于土壤的新的青霉菌(Penicillium flavonim)Z08，該 青霉菌于2016年6月29日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)注冊保藏，保藏地點為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCC NO.12761。

本發(fā)明從種植玉米的土壤中分離得到一株真菌，該菌使用ITS引物擴(kuò)增得到ITS序列，經(jīng)BLAST鑒定，結(jié)果顯示該序列和Penicillium sp.1JJK-2011(GENE Bank ID：HM469397)相似度最高，達(dá)到98.9％，故鑒定該株菌屬于青霉屬(Penicillium flavonim)的青霉菌Z08。

該菌的微生物學(xué)特征為：在PDA平板上28℃培養(yǎng)4天后，菌落呈現(xiàn)白色，多為營養(yǎng)菌絲。其營養(yǎng)體為無色或淡黃色的菌絲體，菌絲各細(xì)胞之間有橫隔膜。7天后可見氣生菌絲上產(chǎn)生簡單的長而直立的分生孢子梗，頂端以特殊的對稱的掃帚狀的分支，同時菌落呈現(xiàn)淡綠色，顯微鏡檢可見成團(tuán)菌絲體。

本發(fā)明的另一目的是提供從該真菌中分離得到的一個新化合物安他擬尼酸A(antanicacid A)，其化學(xué)名稱為:(E)-2-(2-(3-(2-氨基苯甲酰胺)；分子式為:C₁₅H₁₇N₃O₆，分子量為:335.1117；化學(xué)結(jié)構(gòu)如下:

該化合物為淡黃色無定形粉末，易溶于水，二甲基亞砜等。

附圖說明

圖1安他擬酸A化合物¹H核磁共振圖譜。

圖2安他擬酸A化合物¹³C圖譜。

圖3安他擬酸A化合物¹H-¹³C HMQC圖譜。

圖4安他擬酸A化合物¹H-¹³C HMBC圖譜。

圖5安他擬酸A化合物¹H-¹H COSY圖譜。

圖6安他擬酸A化合物高分辨質(zhì)譜。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，以便是本領(lǐng)域技術(shù)人員更加清楚明白，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。

實施例1

一、青霉菌Z08菌株的分離與鑒定

從吉林省九臺市張家農(nóng)場土壤中應(yīng)用PDA+青霉素和鏈霉素平板分離得到了21株真菌，其中一株真菌即青霉菌Z08，青霉菌Z08在PDA瓊脂糖平板上可產(chǎn)生淡黃色化合物。該菌株經(jīng)分類學(xué)研究和分子生物學(xué)研究鑒定為青霉菌(Penicillium flavonim)。

該菌的微生物學(xué)特征為：在PDA平板上28℃培養(yǎng)4天后，菌落呈現(xiàn)白色，多為營養(yǎng)菌絲。其營養(yǎng)體為無色或淡黃色的菌絲體，菌絲各細(xì)胞之間有橫隔膜。7天后可見氣生菌絲上產(chǎn)生簡單的長而直立的分生孢子梗，頂端以特殊的對稱的掃帚狀的分支，同時菌落呈現(xiàn)淡綠色，顯微鏡檢可見成團(tuán)菌絲體。

1、青霉菌Z08菌株的制備

青霉菌純化采用如下培養(yǎng)基：在1000毫升水中加入土豆培養(yǎng)基40克，加入葡萄糖20克，瓊脂20克，在121℃,壓力為1kg/cm2條件下滅菌20分鐘，冷卻后加入無菌的青霉素和鏈霉素各30微克/毫升。無菌狀態(tài)下稱取土壤樣本約l克，加入無菌水10毫升，震蕩混勻，再分別稀釋10倍、100倍、100倍共制成4個濃度梯度的樣品，各取0.25毫升涂布于固體培養(yǎng)基上，每個梯度涂布20個平板，當(dāng)分離菌株在培養(yǎng)基上進(jìn)入生長旺盛期時，挑取菌株的孢子，在真菌純化培養(yǎng)基上劃線純化，28℃、相對濕度90％、恒溫恒濕條件下倒置培養(yǎng)，按此方法連續(xù)劃線直至單個平板上為形態(tài)單一的菌落時，挑取平板上的單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，待菌落長成后保存純種。

2、青霉菌Z08的基因組DNA提取

首先將菌株在28℃搖床(150r/min)培養(yǎng)7天，然后取冷凍干燥后的菌絲100mg，加適量的液氮于研缽中充分研磨，并加入2ml緩沖液(50mM Tris-HCl pH 7.2，50mM EDTA，2.5％SDS,1％β-巰基乙醇)，混勻，轉(zhuǎn)移至10mL試管中，加入2mL苯酚：氯仿(1:1)抽提液，提取，提取液離心，然后取上清液加入50微升RNase，55℃條件下，放置1小時并加入蛋白酶。然后用70％冷乙醇洗兩次，室溫干燥30分鐘，加入500微升水溶解，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、青霉菌Z08菌株鑒定

通過引物ITS58A1F:5’-GCATCGATGAAGAACGC-3’和ITSNLB3:5’-GGATTCTCACCCTCTATGA-3’對青霉菌Z08基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增片段用T載克隆轉(zhuǎn)化到DH5a并對陽性克隆進(jìn)行測序，獲得青霉菌Z08的ITS序列如下:

對青霉菌Z08的ITS序列進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示該序列和Penicillium sp.1JJK-2011(GENE Bank ID：HM469397)相似度最高，達(dá)到98.9％。故鑒定該株菌屬于青霉屬(Penicillium flavonim)青霉菌Z08。該菌于2016年6月29日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心注冊保藏，保藏地點為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCC NO.12761。

二、青霉菌Z08發(fā)酵產(chǎn)物中安他擬酸A的分離鑒定

1、青霉菌Z08發(fā)酵產(chǎn)物的制備及分離方法

①發(fā)酵物的制備

取青霉菌Z08的孢子劃線列于8升PDA的瓊脂平板(克/升)上：取酵母提取物(購自Sigma公司)0.5克，葡萄糖10.0克，磷酸鈣5.0克，硫酸銨0.5克，氯化鉀0.2克，硫酸鎂0.1克，硫酸錳0.0001克，硫酸亞鐵0.0001克，瓊脂15.0克，板在室溫下(20-22℃)下，溫育14天。當(dāng)觀察到瓊脂板變成黃顏色，同時孢子變成綠色時，用水將孢子從瓊脂板上除去，然后將瓊脂再用水提取。所得瓊脂漿液加10升水中攪拌5小時，并通過金屬(100目)過濾，得到青霉菌Z08發(fā)酵產(chǎn)物。

②反相液相色譜分離純化

將上述發(fā)酵產(chǎn)物溶液減壓蒸發(fā)至2L的體積，然后用乙酸乙酯等量萃取3次，萃取液減壓蒸干，干燥萃取物溶于水，依次用環(huán)己烷與甲醇萃取，取甲醇部分進(jìn)行HPLC制備。

儀器：HPLC-ESI-MS(Agilent 1100HPLC系統(tǒng)，ESI模式布魯克的amaZon點離子阱質(zhì)譜儀，配備160-600nm可變UV檢測儀，Phenomenex Luna 5μm C18(250毫米×15毫米，4.6微米)，流速(10ml/min)；

色譜條件：A(乙腈含0.1％甲酸)和B(含0.1％甲酸的水)溶劑梯度，0-5分鐘，5％A；5-15.5分鐘，線性梯度至60％A；15.5-16分鐘，線性梯度至100％A；16-17.5分鐘，100％A等度；17.5-18分鐘，線性到5％A，18-21分鐘，5％A。

③結(jié)果

青霉菌Z08發(fā)酵物(約200克)經(jīng)乙酸乙酯(2升)等量萃取3次，得1.5克浸膏,溶于水，依次用環(huán)己烷與甲醇萃取，取甲醇部分進(jìn)行HPLC制備，共采集30個部分，收集13.5分鐘樣品峰，得到一亮黃色粉末，5毫克。供Thermo Scientific LTQ，Orbitrap XL高分辨質(zhì)譜以及Bruker，Avance 600MHz核磁共振光譜儀進(jìn)行檢測。

2、青霉菌Z08發(fā)酵產(chǎn)物中安他擬酸A的鑒定

取上述所得亮黃色粉末1毫克，用Thermo Scientific LTQ，Orbitrap分析得高分辨質(zhì)譜，分子量為:335.1117(見圖6)；取上述所得亮黃色粉末3毫克溶解在DMSO-d₆中，用Bruker，Avance 600MHz核磁共振光譜儀進(jìn)行檢測(見表1和圖2)。

¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ：7.34(d,1H,J＝8.5，H-2)，8.51(t，1H，J＝8.5,1.5,H-3)，7.01(t，1H,J＝8.5,H-4)，8.01(d,1H,J＝8.5，H-5)，7.35(d,1H,J＝8.5，H-8)，5.21(d,J＝10.2，H-9)，3.06(m,1H,H-11)，2.13(m,1H,H-12a)，1.98(m,1H,H-12b)，2.51(m,1H,H-13)。

¹³C NMR(150MHz，DMSO-d₆)δ:140.7(s，C-1)，131.6(d，C-2)，119.3(d，C-3)，122.4(d,C-4)，131.6(d,C-5)，124.2(s,C-6)，170.7(s，C-7)，135.4(d,C-8)，101.2(d，C-9)，166.3(s,C-10),58.7(d,C-11)，28.2(t,C-12)，32.6(t，C-13)，176.1(s,C-14)，176.1(s,C-15)。

表1核磁共振光譜數(shù)據(jù)

根據(jù)HRESIMS推導(dǎo)其分子式為C₁₅H₁₇N₃O₆：m/z＝336.1191[M+H]⁺(計算336.1196)，同時根據(jù)¹³C NMR及其它核磁光譜數(shù)據(jù)，推導(dǎo)其需要9個不飽和度。¹H-¹H COSY(圖5)和HMQC(圖3)譜分析表明存在以下自旋系統(tǒng)：H2-H3-H4-H5，H8-H9，H11-H12-H13。由HMBC光譜(圖4和表1)中觀察到的碳?xì)湎嚓P(guān)如下：從C-1到H-2，H-5；從C-6到H-4，H-2；從C-7到H-8，H-5；從C-10到H-8，H-7；從C-14至H-12；從C-15至H-12；從C-13到H-11。安他尼酸A的HMBC相關(guān)：

經(jīng)過檢索及以上所有這些數(shù)據(jù)最終確定，該化合物為新化合物，其化學(xué)名稱為:(E)-2-(2-(3-(2-氨基苯甲酰胺)，被命名為安他擬酸A；化學(xué)式為：該化合物為淡黃色無定形粉末，易溶于水，二甲基亞砜等。

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