本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，是關(guān)于一種以連翹苷為原料生物轉(zhuǎn)化制備連翹脂素的方法。

(二)

背景技術(shù)：

連翹脂素(phillygenin)，又名連翹苷元(CAS號(hào)為487-39-8，分子式為C₂₁H₂₄O₆，分子量為372.41)，屬于雙環(huán)氧木脂素類(lèi)物質(zhì)。連翹脂素具有多種生物活性，包括良好的抗氧化性，表現(xiàn)出非常強(qiáng)的DPPH、ABTS、FRAP自由基清除能力及降血脂活性；連翹脂素對(duì)人肝癌細(xì)胞(SMMC27721)、人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞(V79)及小鼠黑色素肉瘤細(xì)胞(B16)具有體外抗腫瘤活性，也能降低高血脂癥小鼠的血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇，且可通過(guò)氧化途徑來(lái)降低血脂水平；研究表明連翹脂素能預(yù)防或治療由過(guò)氧化物引起的相關(guān)疾病，如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，癌癥，動(dòng)脈粥樣硬化和神經(jīng)退行性疾病。

連翹脂素以游離狀態(tài)存在于一些木犀科植物中，如連翹、流蘇樹(shù)和桂花等，因此可以從這些植物中分離獲得，但其含量相對(duì)較低，如從產(chǎn)于河南的連翹葉提取連翹脂素的收率僅為0.162％(崔燕巖，馮少勇，趙光，等.連翹有效成分的HPLC法測(cè)定[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1992(8):603-608)。在上述植物中，連翹脂素更多的與葡萄糖結(jié)合成苷，即連翹苷(phillyrin，CAS號(hào)為487-41-2，分子式為C₂₇H₃₄O₁₁，分子量為534.56)，含量相對(duì)較高。如從產(chǎn)于河南的連翹葉提取連翹苷的收率可達(dá)3.14％，是連翹脂素含量的19.4倍。雖然連翹苷也具有多種生物活性，如清熱解毒、排膿化瘀、抗氧化、抗病毒等藥理作用，但是其口服吸收效果較差，對(duì)一些腫瘤細(xì)胞沒(méi)有抑制活性。有研究報(bào)道，連翹苷在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為連翹脂素后才能發(fā)揮效用。

可以看出，連翹脂素具有更好的藥理活性，如將連翹苷轉(zhuǎn)化為連翹脂素，對(duì)連翹資源的深度開(kāi)發(fā)具有重要意義。目前，已有酶法轉(zhuǎn)化的研究報(bào)道，如采用纖維素酶轉(zhuǎn)化連翹苷，轉(zhuǎn)化48h，轉(zhuǎn)化率可達(dá)93.6％(中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利CN 105331653 A)，但該方法的纖維素酶用量較大，是底物質(zhì)量的1～10倍，酶的成本無(wú)疑較高；如果采用酸水解法，存在的問(wèn)題則是副產(chǎn)物較多，構(gòu)型容易轉(zhuǎn)變，生成的同分異構(gòu)體難以分離。

為了提高連翹脂素的生產(chǎn)效率，克服現(xiàn)有連翹脂素生產(chǎn)方法的不足，本發(fā)明采用微生物法轉(zhuǎn)化連翹苷為連翹脂素(反應(yīng)式見(jiàn)圖1)，篩選獲得了一株轉(zhuǎn)化能力高、專(zhuān)一性好的微生物菌株，培養(yǎng)獲得菌體，以菌體為生物催化劑，將連翹苷轉(zhuǎn)化為連翹脂素，在底物濃度為2g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化得率可達(dá)90％以上。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一株產(chǎn)糖苷酶的微生物菌株—桔青霉(Penicillium citrinum)LB，及其在轉(zhuǎn)化連翹苷制備連翹脂素中的應(yīng)用。較好地克服現(xiàn)有酶解法中酶消耗量大的不足，本工藝具有成本低、流程簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化得率高和副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一株新菌株—桔青霉(Penicillium citrinum)LB，保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)：GDMCC No:60050，保藏日期2016年6月27日，地址：廣東省廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓；郵編：510075。

本發(fā)明所述桔青霉LB，是從土壤中分離，經(jīng)過(guò)篩選得到的優(yōu)良菌株。所述桔青霉LB的形態(tài)特征如下：在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，28℃條件下培養(yǎng)2天，即長(zhǎng)出菌落。菌落初期為白色細(xì)絨毛狀，之后表面逐漸呈灰綠色，產(chǎn)生大量綠色分生孢子，背面呈黃色。在顯微鏡下觀(guān)察到菌絲有橫隔，孢子梗頂端產(chǎn)生成串的青色分生孢子，分生孢子穗呈青霉屬菌種特有的帚狀。

所述桔青霉LB的18s rDNA部分核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明還提供一種所述桔青霉LB在生物轉(zhuǎn)化連翹苷制備連翹脂素中的應(yīng)用。

所述的應(yīng)用是將桔青霉LB經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后獲得的濕菌體為生物催化劑，以連翹苷為底物，以甲醇為助溶劑，以含濕菌體的發(fā)酵液或?qū)窬w懸浮于緩沖液中構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系，于30～35℃、200～250r/min恒溫振蕩條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液分離純化，獲得連翹脂素。

進(jìn)一步，所述的轉(zhuǎn)化體系是由含菌體的發(fā)酵液、連翹苷和甲醇構(gòu)成；或?qū)l(fā)酵液過(guò)濾，取濕菌體懸浮于等同發(fā)酵液體積、pH 6的磷酸緩沖液中，再加入連翹苷和甲醇構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系。所述轉(zhuǎn)化體系中生物催化劑用量以濕菌體干重計(jì)為1.51～1.64g/L。

進(jìn)一步，轉(zhuǎn)化體系中所述底物連翹苷的終濃度為1～2g/L，所述助溶劑甲醇的體積終濃度為1％～5％(優(yōu)先選用甲醇溶解連翹苷，然后再加入轉(zhuǎn)化體系)。

進(jìn)一步，所述的轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件為：在30～35℃、150～250r/min恒溫振蕩條件下轉(zhuǎn)化18～24h。

進(jìn)一步，所述生物催化劑按如下方法制備：將桔青霉LB接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于28～30℃、200～250r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)2～3天，獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾，收集濕菌體；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：蔗糖6～10g/L，(NH₄)₂SO₄ 4～7g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄5g/L，MgSO₄ 1g/L，MnSO₄ 0.5g/L，溶劑為水，pH 5～7。

所述桔青霉LB菌株在發(fā)酵前，通常需要先經(jīng)平板培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，再經(jīng)過(guò)種子培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，然后用種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

所述生物催化劑制備方法為：(1)活化培養(yǎng)：將桔青霉LB菌種孢子接種于平板培養(yǎng)基，于28～30℃恒溫培養(yǎng)2～3天，獲得平板孢子，所述的平板培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，其終濃度組成為：馬鈴薯200g/L(馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，加5倍質(zhì)量水煮沸20-30min，4層紗布過(guò)濾去渣留汁)，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，溶劑為水，pH自然；(2)種子擴(kuò)大培養(yǎng)：挑取步驟(1)活化培養(yǎng)后桔青霉LB孢子接種至種子培養(yǎng)基中，于28～30℃、200～250r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)2～3天，得種子液，所述種子培養(yǎng)基，除不含瓊脂外，其終濃度組成和配制方法同平板培養(yǎng)基；(3)菌體發(fā)酵：將種子液以體積濃度5％～10％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28～30℃、200～250r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)2～3天，獲得發(fā)酵液。所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：蔗糖6～10g/L，(NH₄)₂SO₄ 4～7g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄5g/L，MgSO₄ 1g/L，MnSO₄ 0.5g/L，溶劑為水，pH 5～7。

進(jìn)一步，優(yōu)選所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：蔗糖7g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄ 1g/L，MnSO₄ 0.5g/L，溶劑為水，pH 6。

本發(fā)明所述的連翹脂素分離純化的方法為：在生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化體系用等體積的乙酸乙酯萃取，萃取液于圓底燒瓶中，45℃下減壓蒸干乙酸乙酯后，再加入原轉(zhuǎn)化體系體積1/4的甲醇溶解殘留物；甲醇溶液用濾紙過(guò)濾后，于45℃下減壓干燥，(優(yōu)選濾液轉(zhuǎn)入另一潔凈圓底燒瓶中，45℃下減壓蒸干甲醇后，加少量甲醇溶解殘留物，甲醇溶液轉(zhuǎn)入潔凈培養(yǎng)皿中，減壓干燥后)，即得連翹脂素。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供一種利用桔青霉LB發(fā)酵獲得生物催化劑，以連翹苷為底物制備連翹脂素的方法，在底物投料濃度為2g/L時(shí)，連翹脂素的轉(zhuǎn)化得率為90.5％。相比于現(xiàn)有技術(shù)，采用本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢(shì)有：桔青霉LB營(yíng)養(yǎng)要求低、發(fā)酵時(shí)間短、抗污染能力強(qiáng)；生長(zhǎng)快；轉(zhuǎn)化反應(yīng)專(zhuān)一性好，轉(zhuǎn)化效率高，副產(chǎn)物少；本發(fā)明把活性低的連翹苷轉(zhuǎn)化活性更好的連翹脂素，可大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用，生產(chǎn)工藝具有周期短，轉(zhuǎn)化率高，環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。

(四)附圖說(shuō)明

圖1連翹苷轉(zhuǎn)化為連翹脂素的化學(xué)反應(yīng)式；

圖2 HPLC法分析連翹脂素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

圖3轉(zhuǎn)化樣品的HPLC分析圖譜，A為標(biāo)準(zhǔn)品連翹苷和連翹脂素的HPLC圖譜；B為連翹苷轉(zhuǎn)化0h的HPLC圖譜；C為連翹苷經(jīng)生物轉(zhuǎn)化20h的HPLC圖譜(實(shí)施例6樣品)。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1轉(zhuǎn)化菌種的分離與篩選

采集花壇肥沃土壤，用無(wú)菌水稀釋1×10⁶倍后涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基(PDA)上，于28℃恒溫培養(yǎng)4天，挑取顏色和形態(tài)不同的霉菌菌落轉(zhuǎn)接新鮮PDA平板培養(yǎng)基，置于28℃恒溫培養(yǎng)3天，得孢子豐富的菌株12株(菌株編號(hào)見(jiàn)表1)，保存于4℃冰箱中備用。

接種環(huán)分別挑取上述各個(gè)菌株的平板培養(yǎng)基上的孢子2環(huán)，接種到裝有100mL初始發(fā)酵培養(yǎng)基中(250mL三角瓶裝)，于30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)3天(不同菌株發(fā)酵液的干菌體濃度在1.42g/L～4.37g/L之間不等)，1mg的連翹苷溶于1mL甲醇后加入發(fā)酵液，使轉(zhuǎn)化體系中連翹苷的濃度為10mg/L。三角瓶于30℃、200r/min恒溫振蕩轉(zhuǎn)化18h。轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)布氏漏斗抽濾除去菌體后，用100mL乙酸乙酯萃取2遍，乙酸乙酯分液于圓底燒瓶中，減壓蒸干乙酸乙酯后用3mL甲醇溶解殘留物，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，用HPLC分析樣品中連翹脂素的濃度。

HPLC分析來(lái)自不同菌株發(fā)酵液轉(zhuǎn)化樣品中的連翹脂素濃度，計(jì)算連翹脂素的轉(zhuǎn)化得率，由此比較不同菌株產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化連翹苷為連翹脂素的能力高低。12個(gè)菌株中，編號(hào)為L(zhǎng)B的霉菌轉(zhuǎn)化生成連翹脂素得率最高，轉(zhuǎn)化液中連翹脂素的濃度為5.11mg/L，轉(zhuǎn)化得率達(dá)到73.3％。

表1不同菌株轉(zhuǎn)化連翹苷生成連翹脂素的濃度和得率

所述的PDA平板培養(yǎng)基，按如下組成和方法配制：馬鈴薯洗凈去皮切成小塊，稱(chēng)取200g，加自來(lái)水1000mL，煮沸30min，4層紗布過(guò)濾去渣，濾液補(bǔ)足到1000mL，再加入葡萄糖20g、瓊脂20g，pH自然(實(shí)測(cè)6.5)，加熱至瓊脂溶化后分裝于三角瓶中，經(jīng)高壓蒸汽121℃滅菌20min，凝固前倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿，每皿25～30mL。

所述的初始發(fā)酵培養(yǎng)基按如下組成和方法配制：葡萄糖4g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄ 1g/L，MnSO₄ 0.5g/L，pH 7，溶劑為水，250mL的三角瓶裝100mL初始發(fā)酵培養(yǎng)基，8層紗布扎口，高壓蒸汽121℃滅菌20min。

所述HPLC分析方法為：LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津儀器有限公司)，色譜柱為Phenomenex Luna C18柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱溫為室溫；流動(dòng)相為乙腈和水梯度洗脫(0～30min，乙腈體積分?jǐn)?shù)變化為10％～100％，水體積分?jǐn)?shù)變化為90％～0％；30～40min，100％乙腈)；流速0.8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)277nm，進(jìn)樣量20μL。由相同分析條件下的標(biāo)準(zhǔn)品連翹脂素濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖2)，計(jì)算出轉(zhuǎn)化樣品中的連翹脂素的濃度。

所述的連翹脂素轉(zhuǎn)化得率按以下公式計(jì)算：

式中，372.41為連翹脂素的分子量，534.56為連翹苷的分子量。

實(shí)施例2：菌株LB轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性驗(yàn)證

以菌株LB為轉(zhuǎn)化菌種，在100mL搖瓶發(fā)酵規(guī)模下，增加了種子擴(kuò)大培養(yǎng)步驟，用含菌體的發(fā)酵液轉(zhuǎn)化連翹苷，驗(yàn)證菌種的轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性，具體工藝步驟如下：

(1)將4℃冰箱中保存的菌株LB平板菌種接種于新鮮平板培養(yǎng)基，平板于28℃恒溫培養(yǎng)2天，所述的平板培養(yǎng)基組成和制備方法同實(shí)施例1；

(2)用接種環(huán)取步驟(1)活化培養(yǎng)后菌株LB孢子2次至50mL種子培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)2天，得干菌體濃度為1.83g/L的種子液。所述種子培養(yǎng)基，除不含瓊脂外，其終濃度組成和配制方法同平板培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝50mL，經(jīng)高壓蒸汽121℃滅菌20min。

(3)步驟(2)種子液以體積濃度5％(即5mL)的接種量接種至100mL初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)2天(干菌體濃度為2.76g/L)后，加入1mg的連翹苷(溶于1mL甲醇)，使轉(zhuǎn)化體系中連翹苷的濃度為10mg/L。三角瓶于30℃、200r/min恒溫振蕩轉(zhuǎn)化18h。所述的初始發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成和配制方法同實(shí)施例1。

(4)轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)布氏漏斗抽濾除去菌體后，用100mL乙酸乙酯萃取2遍，乙酸乙酯分液于圓底燒瓶中，減壓蒸干乙酸乙酯后用3mL甲醇溶解殘留物，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，用HPLC分析樣品中連翹脂素的濃度。

HPLC分析表明，按本實(shí)施例方法，菌株LB發(fā)酵液轉(zhuǎn)化連翹苷，重復(fù)3批次實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化樣品中連翹脂素平均濃度為4.96mg/L，轉(zhuǎn)化得率平均為71.2％，3批次實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著性差異，表明菌株LB發(fā)酵轉(zhuǎn)化連翹苷為連翹脂素的轉(zhuǎn)化性能穩(wěn)定。

實(shí)施例3：菌株LB的分類(lèi)鑒定

將菌株LB接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，28℃條件下培養(yǎng)2天，即可長(zhǎng)出菌落。菌落初期為白色細(xì)絨毛狀，之后表面逐漸呈灰綠色，產(chǎn)生大量綠色分生孢子，背面呈黃色。在顯微鏡下觀(guān)察到菌絲有橫隔，孢子梗頂端產(chǎn)生成串的青色分生孢子，分生孢子穗呈青霉屬菌種特有的帚狀。

將菌株LB交由生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行18S rDNA測(cè)序，測(cè)得序列大小為1282bp，具體序列(SEQ ID NO:1所示)如下：

GCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACATGGATACCTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTACAAACCCCGACTTCAGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAACGCCCTTCGGGGCTCCTTGGTGAATCATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTCGGGTCTCGTAATTGGAATGAGAACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGGCCTTTCCTTCTGGGGAACCTCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGGATTCTATGATGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACAAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAATAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATCTTTTGGATGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTCGGCCCTTAAATAGCCCGGTCCGCATCTGCGGGCCGCTGGCTTC。

將該序列在GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)，與超過(guò)100株青霉屬菌株有99％以上的同源性，與6株桔青霉菌株的18S rDNA序列有100％的同源性。依據(jù)18S rDNA序列，繪制的該菌株與青霉屬不同種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，該菌株與桔青霉親緣關(guān)系較近，與青霉屬其他種的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，綜合菌株LB的形態(tài)特征和18S rDNA的序列分析，可以確定菌株LB為一株桔青霉(Penicillium citrinum)，定名為桔青霉LB，已保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)：GDMCC No:60050，保藏日期2016年6月27日，地址：廣東省廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓；郵編：510075。

實(shí)施例4：桔青霉LB轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

以桔青霉LB為轉(zhuǎn)化菌種，在實(shí)施例2的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基組成，提高的底物濃度，延長(zhǎng)了轉(zhuǎn)化時(shí)間，轉(zhuǎn)化得率有顯著提高，具體工藝步驟如下：

(1)將4℃冰箱中保存的桔青霉LB平板菌種接種于新鮮平板培養(yǎng)基，平板于28℃恒溫培養(yǎng)2天，所述的平板培養(yǎng)基組成和制備方法同實(shí)施例1；

(2)用接種環(huán)取步驟(1)活化培養(yǎng)后桔青霉LB孢子2次至50mL種子培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)2天，得干菌體濃度為1.78g/L的種子液。所述種子培養(yǎng)基組成和制備方法同實(shí)施例2。

(3)步驟(2)種子液以體積濃度10％(即10mL)的接種量接種至100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、250r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)2天(干菌體濃度為1.54g/L)后，加入0.2g的連翹苷溶于5mL甲醇的溶液，使轉(zhuǎn)化體系中連翹脂素的濃度為2g/L(轉(zhuǎn)化體系體積按100mL計(jì))。三角瓶于35℃、250r/min恒溫振蕩轉(zhuǎn)化18h。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：蔗糖7g/L，(NH₃)₂SO₄ 5g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄ 1g/L，MnSO₄ 0.5g/L，溶劑為水，pH 6。250mL的三角瓶裝100mL發(fā)酵培養(yǎng)基，8層紗布扎口，高壓蒸汽121℃滅菌20min。

(4)轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)布氏漏斗抽濾除去菌體后，用100mL乙酸乙酯萃取2遍，乙酸乙酯分液于圓底燒瓶中，減壓蒸干乙酸乙酯后用5mL甲醇溶解殘留物，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，用甲醇稀釋120倍后用HPLC分析樣品中連翹脂素的濃度。

HPLC分析表明，按本實(shí)施例方法，用桔青霉LB菌株發(fā)酵液轉(zhuǎn)化連翹苷，轉(zhuǎn)化樣品中連翹脂素濃度為1.26g/L，轉(zhuǎn)化得率為90.5％。

實(shí)施例5：菌體緩沖液體系轉(zhuǎn)化

以桔青霉LB為轉(zhuǎn)化菌種，在實(shí)施例4的基礎(chǔ)上，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾后收獲菌體，懸浮于緩沖液中轉(zhuǎn)化連翹苷，具體工藝步驟如下：

(1)將4℃冰箱中保存的桔青霉LB平板菌種接種于新鮮平板培養(yǎng)基，平板于30℃恒溫培養(yǎng)2天，所述的平板培養(yǎng)基組成和制備方法同實(shí)施例1；

(2)用接種環(huán)取步驟(1)活化培養(yǎng)后桔青霉LB孢子2次至50mL種子培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)2天，得干菌體濃度為1.86g/L的種子液。所述種子培養(yǎng)基組成和制備方法同實(shí)施例2。

(3)步驟(2)種子液以體積濃度10％(即10mL)的接種量接種至100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、250r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)2天(干菌體濃度為1.51g/L)后，發(fā)酵液經(jīng)布氏漏斗過(guò)濾，用pH 6的磷酸緩沖液100mL重新懸浮菌體于一只250mL三角瓶中，加入0.2g的連翹苷溶于5mL甲醇的溶液，使轉(zhuǎn)化體系中連翹脂素的濃度為2g/L(轉(zhuǎn)化體系體積按100mL計(jì))。三角瓶于35℃、250r/min恒溫振蕩轉(zhuǎn)化20h。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成和配制方法同實(shí)施例4。

(4)轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)布氏漏斗抽濾除去菌體后，用100mL乙酸乙酯萃取2遍，乙酸乙酯分液于圓底燒瓶中，減壓蒸干乙酸乙酯后用5mL甲醇溶解殘留物，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，用甲醇稀釋120倍后用HPLC分析樣品中連翹脂素的濃度。

HPLC分析表明，按本實(shí)施例方法，用桔青霉LB菌株發(fā)酵液轉(zhuǎn)化連翹苷，轉(zhuǎn)化樣品中連翹脂素濃度為1.24g/L，轉(zhuǎn)化得率為89.0％。相比于實(shí)施例4方法，雖然轉(zhuǎn)化得率略有下降，但因菌體重懸于緩沖液中，體系中雜質(zhì)較少，有利于后續(xù)產(chǎn)物的分離。

所述的pH 6的磷酸緩沖液配制方法為：稱(chēng)取Na₂HPO₄·H₂O 7.16g，用去離子水定容至100mL(A液)；稱(chēng)取NaH₂PO₄·2H₂O 3.12g，用去離子水定容至100mL(B液)；取87.7mL的A液和12.3mL的B液混合，即得到100mL pH 6的磷酸緩沖液。

實(shí)施例6：生物轉(zhuǎn)化法制備連翹脂素

在實(shí)施例5的基礎(chǔ)上，發(fā)酵體系放大到400mL，制備菌體用于連翹苷的生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化體系放大到400mL，具體工藝步驟如下：

(1)將4℃冰箱中保存的桔青霉LB平板菌種接種于新鮮平板培養(yǎng)基，平板于30℃恒溫培養(yǎng)2天，所述的平板培養(yǎng)基組成和制備方法同實(shí)施例1；

(2)用接種環(huán)取步驟(1)活化培養(yǎng)后桔青霉LB孢子2次至50mL種子培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)2天，得干菌體濃度為1.75g/L的種子液。所述種子培養(yǎng)基組成和制備方法同實(shí)施例2。

(3)步驟(2)種子液以體積濃度10％(即40mL)的接種量接種至400mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)2天(干菌體濃度為1.64g/L)后，發(fā)酵液經(jīng)布氏漏斗過(guò)濾，用400mL、pH 6的磷酸緩沖液重新懸浮菌體于一只1L三角瓶中，加入0.8g的連翹苷溶于20mL甲醇的溶液，使轉(zhuǎn)化體系中連翹脂素的濃度為2g/L(轉(zhuǎn)化體系體積按400mL計(jì))。三角瓶于35℃、250r/min恒溫振蕩轉(zhuǎn)化24h。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成同實(shí)施例4，1L的三角瓶裝400mL發(fā)酵培養(yǎng)基，8層紗布扎口，高壓蒸汽121℃滅菌25min。

(4)轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)布氏漏斗抽濾除去菌體后，用400mL乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液于圓底燒瓶中，45℃下減壓蒸干乙酸乙酯后，再加入100mL甲醇溶解殘留物；甲醇溶液用濾紙過(guò)濾后，轉(zhuǎn)入另一潔凈圓底燒瓶中，45℃下減壓蒸干甲醇后，加10mL甲醇溶解殘留物，甲醇溶液轉(zhuǎn)入潔凈培養(yǎng)皿中，減壓干燥后得0.597g連翹脂素。

稱(chēng)取步驟(4)制備的連翹脂素1mg溶解于5mL甲醇中，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，用HPLC分析樣品中連翹脂素的濃度。以標(biāo)準(zhǔn)品連翹苷和連翹脂素為對(duì)照，同時(shí)檢測(cè)連翹苷轉(zhuǎn)化0h和20h的HPLC圖譜。分析結(jié)果表明，按本實(shí)施例方法，制備的連翹脂素純度為85.1％，轉(zhuǎn)化得率為91.2％。