一種生產(chǎn)低極性人參皂苷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)低極性人參皂苷的方法，屬于天然產(chǎn)物加工領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]人參為五加科植物人參的干燥根，多生長(zhǎng)于晝夜溫差小的海拔500?1100米山地緩坡或斜坡地的針闊混交林或雜木林中。由于根部肥大，形若紡錘，常有分叉，全貌頗似人的頭、手、足和四肢，故而稱為人參。人參被稱為“百草之王”，是馳名中外、老幼皆知的名貴藥材。長(zhǎng)期以來(lái)，由于過(guò)度采挖，資源枯竭，人參賴以生存的森林生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，目前東北參也處于瀕臨絕滅的邊緣。東北的野生人參也極罕見(jiàn)，因此，保護(hù)本種的自然資源有其特殊的重要意義。
[0003]人參具有多種生理和藥理作用，如抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、改善微循環(huán)、安神、抗衰老、增強(qiáng)記憶及學(xué)習(xí)能力等。
[0004]在抗腫瘤方面，人參具有:①抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞分化;②抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移;③抑制腫瘤誘導(dǎo)的新生血管生成;④降低化療藥物的毒副作用。
[0005]野生人參即含有和栽培人參相同的人參皂苷(稱為天然人參皂苷)，又含有獨(dú)特的人參皂苷(稱為稀有人參皂苷和苷元)，野生人參的功效源于稀有人參皂苷和苷元。食用人參后，其中的二醇型原始人參皂苷只有4%能在腸道轉(zhuǎn)化成稀有人參皂苷和苷元、被機(jī)體吸收利用，其余96%以糞便形式排除。為提高栽培人參中稀有人參皂苷和苷元的含量，人們采用多種方法對(duì)人參進(jìn)行加工。
[0006]①第一代人參加工技術(shù):將人參蒸制，使人參皂苷受熱分解，失去部分糖基，形成稀有人參皂苷。我們常見(jiàn)的紅參，以及世界著名的進(jìn)口紅參都是采用這一技術(shù)得到的產(chǎn)品。
[0007]②第二代人參加工技術(shù):利用有機(jī)酸、無(wú)機(jī)酸、堿破壞人參皂苷的糖苷鍵，生成稀有人參皂苷。
[0008]③第三代人參加工技術(shù):根據(jù)酶的專(zhuān)一性將不同構(gòu)型、不同種類(lèi)的糖苷鍵降解，達(dá)到定向水解目的，該法維持在實(shí)驗(yàn)室水平。
[0009]④第四代人參加工技術(shù):是將不同降解能力的微生物組合催化分解，將底物轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物的過(guò)程，其根本為微生物與外源底物間發(fā)生的酶促反應(yīng)。很難選取高活性工程菌，該領(lǐng)域已歷經(jīng)30多年的發(fā)展，還未見(jiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的報(bào)道。
[0010]國(guó)際上，美國(guó)專(zhuān)利(5776460)報(bào)道了經(jīng)120-180°c處理0.5-20小時(shí)后，人參中稀有人參皂苷含量有所提高。該專(zhuān)利僅僅是控制溫度，人參熱解產(chǎn)物的質(zhì)和量均無(wú)法恒定，產(chǎn)品穩(wěn)定性無(wú)法保證，產(chǎn)品中稀有人參皂苷的含量較低、批次差異大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)低極性人參皂苷的方法。本發(fā)明人參加工方法能夠產(chǎn)生25-羥基達(dá)瑪烷和25-羥基達(dá)瑪烯，本發(fā)明通過(guò)精細(xì)控制催化分解進(jìn)程，提取皂苷的產(chǎn)量和組分是可控的，從處理后的人參等原料中提取的目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率高。
[0012]本發(fā)明提供的生產(chǎn)低極性人參皂苷的方法，包括如下步驟:將含人參皂苷的植物、所述植物的組織培養(yǎng)物、所述植物的提取物和/或天然人參皂苷的原料經(jīng)催化分解，然后分離，即得到低極性人參皂苷；
[0013]所述低極性人參皂苷為25-羥基達(dá)瑪烷組物質(zhì)和下述(1)-(5)中至少一組物質(zhì)的混合物:
[0014](I)25-羥基達(dá)瑪烯組:3β，12β，25-三羥基達(dá)瑪20(22)烯、3-0-β-?-吡喃葡萄糖基-30，120，25-三羥基達(dá)瑪20(22)烯和3-0-0-0-吡喃葡萄糖基-(1—2)-3-0-0-0-吡喃葡萄糖基-3β，12β，25-三羥基達(dá)瑪20 (22)烯中的至少一種；
[0015](2)稀有二醇皂苷I組:20-(S，R)-Rg3、20-(S，R)-Rh2、20-(S，R)-Pro 和人參二醇中的至少一種；
[0016](3)稀有二醇皂苷II組:Rg5和/或Rk3 ；
[0017](4)三醇I組:20-(S，R)_原人參三醇和/或人參三醇；
[0018](5)三醇11組:20-(5，10-1^2、20-(5，10-1^6、詘4和1^5中的至少一種；
[0019]所述25-羥基達(dá)瑪烷組:30，120，20(3，10，25-四羥基達(dá)瑪烷、3-0-0-0-吡喃葡萄糖基_3β，12β，20(S，R)，25_四輕基達(dá)瑪燒和3-0-β-?-卩比喃葡萄糖基-(I—2)-3_O-0-D-卩比喃葡萄糖基_3β，12β，20(S，R)，25-四羥基達(dá)瑪烷中的至少一種。
[0020]上述的方法中，所述植物為人參、三七、西洋參和絞股藍(lán)中的至少一種；
[0021]所述植物采用須、根、莖、葉、花、果實(shí)和蘆頭中的至少一個(gè)部位；
[0022]所述天然人參皂苷為肋1、肋2、肋3、此、1?(1、1^1、1^和1?2中至少一種；
[0023]所述催化分解采用的催化劑為菌、酶、有機(jī)酸和有機(jī)堿中的至少一種。
[0024]上述的方法中，所述菌為保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、蝙蝠蛾擬青霉和酵母菌中的至少一種;所述保加利亞乳桿菌的菌株具體可為CICC20244型號(hào)，所述嗜熱鏈球菌的菌株具體可為CICC20365型號(hào)，所述蝙蝠蛾擬青霉的菌株具體可為CICC14065型號(hào)，所述酵母菌的菌株具體可為CICC1211型號(hào)，所述嗜酸乳桿菌具體可為CICC6083型號(hào)，所述雙歧桿菌具體可為CICC21711型號(hào)；
[0025]所述酶為糖苷酶、脫氫酶、羥化酶、氧化酶、還原酶、水解酶、轉(zhuǎn)移酶、裂解酶和異構(gòu)酶中的至少一種；
[0026]所述有機(jī)酸為草酰乙酸、草酸、丙二酸、丁二酸、丁烯二酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、己二酸、苯二甲酸、天冬氨酸、谷氨酸、氨基酸、糖醛酸、甲酸、冰醋酸、乳酸、丙酸、丁酸、戊酸、苯甲酸、水楊酸、磺基水楊酸、苯磺酸、一氟乙酸、二氟乙酸、三氟乙酸、一氯乙酸、二氯乙酸和三氯乙酸中的至少一種；
[0027]所述有機(jī)堿為有機(jī)胺。
[0028]上述的方法中，所述糖苷酶為葡聚糖苷酶、葡萄糖苷酶或耐高溫葡萄糖苷酶；
[0029]所述脫氫酶為NADH脫氫酶或NADPH脫氫酶；
[0030]所述羥化酶為人參皂苷元羥化酶；
[0031 ]所述水解酶為人參皂苷糖基水解酶；
[0032]所述轉(zhuǎn)移酶為人參皂苷糖基轉(zhuǎn)移酶
[0033]所述裂解酶為人參皂苷糖基裂解酶
[0034]所述異構(gòu)酶為人參皂苷元異構(gòu)酶；
[0035]所述有機(jī)胺為吡啶、莨菪堿、異喹啉和吲哚中的至少一種。
[0036]上述的方法中，所述酶的重量百分比濃度可為0.01?100%;
[0037]所述有機(jī)酸的重量百分比濃度可為0.01?100%，具體可為15% ;
[0038]所述有機(jī)堿的重量百分比濃度可為0.01?100% ;
[0039 ] 每g所述原料中所述菌的個(gè)數(shù)可為12?101Qcuf，具體可為I O2Cfu;
[0040]所述每g原料與所述酶的酶活可為1:0.0OlU?108U，具體可為300U;
[0041]所述原料與所述有機(jī)酸的質(zhì)量比可為1:0.01?10，具體可為1:1;
[0042 ] 所述原料與所述有機(jī)堿的質(zhì)量比可為1: 0.0I?1。
[0043]上述的方法中，當(dāng)采用所述酶催化分解時(shí)，所述催化分解的溫度可為15?85°C，具體可為37°C，所述催化分解的時(shí)間可為4?168h，具體可為24h;
[0044]當(dāng)采用所述有機(jī)酸催化分解時(shí)，所述催化分解的溫度可為25?95°C，所述催化分解的時(shí)間可為2?168h;
[0045]當(dāng)采用所述有機(jī)堿催化分解時(shí)，所述催化分解的溫度可為25?95°C，所述催化分解的時(shí)間可為2?168h;
[0046]上述的方法中，所述催化分解后還包括加熱滅活的步驟；
[0047]所述加熱的溫度可為46?350 °C，具體可為100°C、121°C或100?121°C;
[0048]所述加熱的時(shí)間可為0.5?24h，具體可為0.5h、2h、5h或0.5?5h;
[0049]所述分離包括萃取和/或柱層析;具體采用萃取將產(chǎn)物中的人參多糖出去，柱層析將所述產(chǎn)物中的人參皂苷分離開(kāi)。
[0050]上述的方法中，所述柱層析采用的洗脫溶劑為所述乙腈和所述水，所述乙腈和所述水的體積比可為3:1?9，具體可為3: I?9按照梯度進(jìn)行洗脫；
[0051]所述柱層析采用的洗脫溶劑為所述乙醇和所述水，所述乙醇和所述水的體積比可為1:0.1?I。
[0052]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0053]本發(fā)明中，原料經(jīng)催化分解過(guò)程時(shí)人參皂苷被酶解、釋放，并呈現(xiàn)游離狀態(tài)，脫糖、羥化后形成25位羥化人參皂苷或苷元，通過(guò)精細(xì)控制催化分解進(jìn)程，皂苷的產(chǎn)量和組分是可控的。特別是本加工技術(shù)能得到較高含量的含25-0H-達(dá)瑪烷、達(dá)瑪烯等人參皂苷。
【具體實(shí)施方式】
[0054]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0055]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0056]下述實(shí)施例中，保加利亞乳桿菌的菌株為CICC20244型號(hào)；嗜熱鏈球菌的菌株為CICC20365型號(hào);蝙蝠蛾擬青霉的菌株為CICC14065型號(hào);酵母菌的菌株為CICC1211型號(hào);嗜酸乳桿菌為CICC6083型號(hào);雙歧桿菌為CICC21711型號(hào)。
[0057]實(shí)施例1、
[0058]4年生栽培人參根(紫莖紅果人參的曬干參，生曬參5000g，含水5-12%)加入到50L益生菌(每g原料中保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、蝙蝠蛾擬青霉、酵母菌的個(gè)數(shù)分別為10:^11、10:^11、10:^11、10:^11)催化分解液中，37°(:發(fā)酵24小時(shí)，100°(:加熱30分鐘。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)HPLC分析表明，轉(zhuǎn)化率90.3%o主產(chǎn)物為Rg3，Rh2，原人參二醇，原人參三醇，人參二醇，人參三醇，25-0H-達(dá)瑪烷，25-0H-達(dá)瑪烯等稀有人參皂苷及苷元及天然人參皂苷。轉(zhuǎn)化人參粉碎，用甲醇回流提取3次，減壓除去甲醇后，蒸干。向蒸干物中加入30%的乙醇反復(fù)洗滌，去除人參多糖，沉淀物干燥。用甲醇溶解，反相制備柱進(jìn)行分離(流動(dòng)相為乙腈和水，1: 3?3:1梯度洗脫)分別獲得如下人參皂苷:
[0059]二醇 I組:
[0060]30，120，20(3，10，25-四羥基達(dá)瑪烷產(chǎn)率3.5%;
[0061 ] 3-0-0-0-吡喃葡萄糖基-30，120，20(3，10，25-四羥基達(dá)瑪烷產(chǎn)率4.1%;
[0062]3-0-β-?-吡喃葡萄糖基-(1—2)-3-0-β-?-吡喃葡萄糖基-3β，12β，20 (S，R)，25-四羥基達(dá)瑪烷產(chǎn)率4.5%;
[0063]二醇 II組:
[0064]3β，12β，25-三羥基達(dá)瑪20(22)烯產(chǎn)率3.3% ；
[0065]3-0-0-0-吡喃葡萄糖基-3隊(duì)120，25-三羥基達(dá)瑪20(22)烯產(chǎn)率4.6% ；
[0066]3-0-β-?-吡喃葡萄糖基-(l—2)-3-O-0-D-吡喃葡萄糖基-3β，12β，25-三羥基達(dá)瑪20(22)烯產(chǎn)率4.7% ；
[0067]二醇 III組:
[0068]20-(S，R)_Rg3 產(chǎn)率 4.8%;
[0069]20-(S，R)-Rh2 產(chǎn)率 5.2%;
[0070]20-(S，R)_PPD產(chǎn)率2.9% ;
[0071]人參二醇產(chǎn)率2.1%;
[0072]二醇 IV 組:
[0073]1^5產(chǎn)率3.6%;1^3產(chǎn)率3.3%;
[0074]二醇 V組:
[0075]天然二醇型皂苷產(chǎn)率6.2%，Rbl產(chǎn)率3.5%，Rb2產(chǎn)率0.5%，Rb3產(chǎn)率0.3%，Rc產(chǎn)率0.5%，Rd產(chǎn)率0.7%，Ral產(chǎn)率0.4%，Ra2產(chǎn)率0.3%，
[0076]三醇I組:
[0077]20_(S，R)_原人參三醇產(chǎn)率2.7%;
[0078]人參三醇產(chǎn)率12%。
[0079]三醇II組:
[0080]20-(S，R)_Rg2產(chǎn)率6.7% ;
[0081 ] 20-(S，R)_Rg6產(chǎn)率7.6% ;
[0082]詘4產(chǎn)率7.3%;