本發(fā)明涉及一類苯甲酰胺類化合物及其用途。
背景技術(shù)：
：尋找和發(fā)現(xiàn)有效的非細(xì)胞毒抗腫瘤藥物是目前抗腫瘤藥物化學(xué)研究的一個(gè)重點(diǎn)，近年來，一類鋅離子依賴性金屬蛋白酶家族-組蛋白去乙?；?histonedeacetylase，HDAC)成為抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)的新靶點(diǎn)。組蛋白去乙?；?histonedeacetylase，HDAC)和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histoneacetyltransferase，HAT)為真核細(xì)胞中廣泛存在的的一類相互拮抗的蛋白酶，它們共同調(diào)控著組蛋白末端氨基酸殘基的乙?；?，使之處于平衡狀態(tài)。組蛋白的乙酰化和去乙?；揎棡檎{(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一種方式，組蛋白的乙?；潭韧ㄟ^影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響基因的表達(dá)。在腫瘤細(xì)胞中HDAC過量表達(dá)，從而抑制了某些抑癌基因的表達(dá)。大量文獻(xiàn)表明抑制HDAC的活性能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和和侵襲。HDAC抑制劑已成為重要的抗腫瘤作用的靶標(biāo)，其中有一類具有苯甲酰胺結(jié)構(gòu)的HDAC抑制劑具有良好的口服生物活性和抗腫瘤活性而受到人們的關(guān)注。許多苯甲酰胺類HDAC抑制劑正處于臨床研究階段，其中Tacedinaline(1，CI-994)對(duì)HDAC顯示出一定的抑制活性，具有廣譜的抗腫瘤活性，成為第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的苯甲酰胺類HDAC抑制劑，CI-994目前在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中與吉西他濱聯(lián)用治療非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌等實(shí)體瘤患者。西達(dá)本胺(2，Chidamide，CS055)是深圳微芯生物科技有限公司開發(fā)的已獲準(zhǔn)上市的組蛋白去乙酰化酶口服抑制劑，批準(zhǔn)的適應(yīng)癥為復(fù)發(fā)及難治性外周T細(xì)胞淋巴瘤，西達(dá)本胺對(duì)肺癌，胃癌，肝癌，乳腺癌等的治療正處于臨床階段。還有許多苯甲酰胺類化合物如MS-275(3)，MGCD-0103(4)正處于臨床階段。為了獲得更高活性的苯甲酰胺類HDAC抑制劑，本專利發(fā)明人合成了一系列新的骨架結(jié)構(gòu)的苯甲酰胺類化合物，并對(duì)其體外抗腫瘤細(xì)胞活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，本專利中的化合物顯示出比參比藥物CI994和西達(dá)本胺(Chidamide,CS055)更強(qiáng)的抗腫瘤活性。上面結(jié)構(gòu)式是已上市或正處于臨床研究的苯甲酰胺類化合物技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及一類苯甲酰胺類的設(shè)計(jì)與合成，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明提供一種藥效活性更優(yōu)異的苯甲酰胺類化合物。本發(fā)明之所以能夠解決上述問題乃是通過以下技術(shù)方案給予實(shí)現(xiàn)：一種苯甲酰胺類化合物，其特征在于下列通式(I)所示的結(jié)構(gòu)：其中R1為氫，氟，氯，溴，碘，烷基，烷氧基，烷基羰基，烷氧基羰基，烷酰胺基，硝基，氰基，芳基，雜芳基。R2為氫，氟，氯，溴，碘，烷基，烷氧基，烷基羰基，烷氧基羰基，烷酰胺基，硝基，氰基，芳基，雜芳基。作為一種優(yōu)選方案所述的苯甲酰胺類化合物，其特征在于，所述的苯甲酰胺類化合物選自:表1本發(fā)明合成其中一部分的化合物所述的化合物在制備抑制癌細(xì)胞增殖或治療癌癥藥物中的應(yīng)用。其中癌細(xì)胞或癌癥包括：人肺癌細(xì)胞A549，人胃癌細(xì)胞MGC80-3，人肝癌細(xì)胞HepG2，人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，食管癌，胰腺癌，直腸癌，宮頸癌或卵巢癌。本發(fā)明提供了通式(I)的化合物的制備方法，該方法包括以下步驟：(a)將取代苯酚與化合物1縮合反應(yīng)得到化合物2；(b)將化合物2水解為化合物3，并酸化為化合物4(c)將化合物4與化合物5進(jìn)行縮合反應(yīng)得到化合物6其中R1為氫，氟，氯，溴，碘，烷基，烷氧基，烷基羰基，烷氧基羰基，烷酰胺基，硝基，氰基，芳基或雜芳基；R2為氫，氟，氯，溴，碘，烷基，烷氧基，烷基羰基，烷氧基羰基，烷酰胺基，硝基，氰基，芳基或雜芳基。進(jìn)一步，反應(yīng)步驟(c)使用肽縮合劑作催化劑。所述肽縮合劑選自苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(BOP)。附圖說明圖1：化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響圖2：化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞單克隆形成能力的影響具體實(shí)施方式通過以下的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)解釋及展述，使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠更加容易地理解本發(fā)明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明所述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例及限制本發(fā)明的任何或所有權(quán)利，更不應(yīng)該背離本發(fā)明的精神。實(shí)施例1：合成本發(fā)明中的一部分化合物N-(2-氨基苯基)-4-(苯氧基甲基)苯甲酰胺(化合物5a)的制備。步驟(1)：稱量苯酚0.41g(4.4mmol)，4-溴甲基苯甲酸甲酯1g(4.4mmol)，碳酸鉀1.21g(8.8mmol)，碘化鉀0.725g(4.4mmol)置于100ml三口圓底燒瓶，加入30ml丁酮，氮?dú)獗Ｗo(hù)，磁力攪拌，油浴加熱至丁酮回流，反應(yīng)時(shí)間為8h，期間用薄層層析板跟蹤反應(yīng)，展開劑為乙酸乙酯：石油醚＝1:6(體積比)。反應(yīng)完成后向反應(yīng)液加入3.5gNaOH(用30ml水溶解后加入)，再加入20ml甲醇溶液，油浴加熱至回流，點(diǎn)板確定水解完全后，將反應(yīng)也冷卻至常溫，冰浴下加入2mol/L的鹽酸水溶液，析出大量固體，用砂芯漏斗抽真空過濾得固體，并用水對(duì)固體進(jìn)行清洗，抽干后再用石油醚清洗固體并將固體抽干。最終得白色固體0.83g，產(chǎn)率為：83％；步驟(2)：稱量步驟(1)得到的產(chǎn)物0.42g(1.84mmol)溶解于15mlDMF中，加入BOP0.97g(2.2mmol)，三乙胺0.74g(7.32mmol)，常溫?cái)嚢?0min后加入鄰苯二胺0.237g(2.2mmol)，反應(yīng)時(shí)間為3h，期間用薄層層析板跟蹤反應(yīng)，展開劑為乙酸乙酯：石油醚＝3:1(體積比)。反應(yīng)完成后，向反應(yīng)液中加入350ml乙酸乙酯萃取，倒入分液漏斗中，加入飽和碳酸鈉水溶液洗3次，飽和氯化鈉洗2次，有機(jī)相用無水硫鎂干燥，過濾，旋蒸得固體，向固體中加入甲醇，過濾，用甲醇洗固體，用乙醚洗固體并抽干得灰白色固體0.35g，產(chǎn)率為：61％；mp176.2-178.2℃；1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝9.70(s,1H),8.03(d,J＝7.8Hz,2H),7.60(d,J＝7.8Hz,2H),7.32(t,J＝7.8Hz,1H),7.21(d,J＝7.7Hz,1H),7.01(m,4H),6.82(m,J＝7.8Hz,1H),6.63(t,J＝7.2Hz,1H),5.22(s,2H),4.94(s,2H)；13CNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝68.50,114.84,116.11,116.23,120.83,123.28,126.47,126.66,127.15,127.93,129.50,134.03,140.58,143.12,158.12,165.05ppm；C20H18N2O2,MS(ES+)m/z:319.1442(M+H)+?；衔?a與化合物5a相同的制備方法相似，只是將步驟(2)中的鄰苯二胺替換為3-氟-5-氨基苯胺0.28g(2.2mmol)?；衔?2a,15～18a與化合物5a相同的制備方法相似，只是將步驟(1)中的原料苯酚分別替換為4-氟苯酚(0.49g，4.4mmol)(化合物12a)；4-甲基苯酚(0.48g，4.4mmol)(化合物15a)；4-甲氧基苯酚(0.55g,4.4mmol)(化合物16a)；4-乙基苯酚(0.54g,4.4mmol)(化合物17a)；4-丙基苯酚(0.60g,4.4mmol)(化合物18a)。N-(2-氨基-4-氟基苯基)-4-(苯氧基甲基)苯甲酰胺(化合物6a)mp158.8-160.0℃；1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝9.61(s,1H),8.01(d,J＝6.7Hz,2H),7.59(d,J＝6.7Hz,2H),7.32(m,2H),7.05(m,4H),6.56(d,J＝10.7Hz,1H),6.38(m,1H),5.24(m,4H)；13CNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝68.48,101.28,102.09,114.83,119.19,120.83,127,12,127.94,128.48,128.58,129.50,133.89,140.60,145.41,145.53,158.10,159.83,162.20,165.30ppm；C20H17FN2O2,MS(ES+)m/z:337.1437(M+H)+。N-(2-氨基苯基)-4-((4-氟基苯氧基甲基)苯甲酰胺(化合物12a)mp196.0-197.8℃；1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝9.69(s,1H),8.02(d,J＝8.0Hz,2H),7.58d,J＝8.0Hz,2H),7.20(m,1H),7.15(m,2H),7.06(m,2H),6.99(d,J＝7.8Hz,1H),6.81(m,1H),6.62(t,J＝7.5Hz,1H),5.20(s,2H),4.93(s,2H)；13CNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝69.18,115.72,115.95,116.11,116.19,116.22,126.48,126.67,127.19,127.93,134.07,140.37,143.12,154.44,157.79,165.02；C20H17FN2O2,MS(ES+)m/z:337.1347(M+H)+。N-(2-氨基苯基)-4-((4-甲基苯氧基甲基)苯甲酰胺(化合物15a)mp183.6-185.0℃；1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝9.68(s,1H),8.01(d,J＝8.1Hz,2H),7.57(d,J＝8.1Hz,2H),7.20(d,J＝7.7Hz,1H),7.11(d,J＝8.3Hz,2H),6.99(m,1H),6.93(d,J＝8.5Hz,2H),6.81(m,1H),6.62(t,J＝7.5Hz,1H),5.18(s,2H),4.92(s,2H),2.24(s,3H)；13CNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝20.05,68.57,114.70116.10,116.22,123.27,126.46,126.66,127.09,127.89,129.49,129.82,133.95,140.75,143.12,155.99,165.04；C21H20N2O2,MS(ES+)m/z:333.1607(M+H)+。N-(2-氨基苯基)-4-((4-甲氧基苯氧基甲基)苯甲酰胺(化合物16a)mp173.2-174.7℃；1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝9.68(s,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,2H),7.57(d,J＝8.0Hz,2H),7.20(d,J＝7.6Hz,1H),6.98(m,3H),6.88(m,2H),6.81(m,1H),6.62(t,J＝7.5Hz,1H),5.15(s,2H),4.92(s,2H),3.71(s,3H)；13CNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝55.32,69.10,114.59,115.79,116.10,116.22,123.27,126.46,126.66,127.11,127.88,133.93,140.83,143.12,152.09,153.54,165.04ppm；C21H20N2O3,MS(ES+)m/z:349.1555(M+H)+。N-(2-氨基苯基)-4-((4-乙基苯氧基甲基)苯甲酰胺(化合物17a)mp171.9-173.8℃；1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝9.68(s,1H),8.01(d,J＝8.1Hz,2H),7.57(d,J＝8.1Hz,2H),7.19(d,J＝7.7Hz,1H),7.14(d,J＝8.5Hz,2H),6.96(m,3H),6.81(m,1H),6.62(t,J＝7.5Hz,1H),5.19(s,2H),4.98(s,2H),2.54(m,2H)；1.56(m,2H),1.16(t,J＝7.5Hz,3H)；13CNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝15.87,27.26,68.57,114.71,116.10,116.23,123.28,126.46,126.66,127.08,127.90,128.64,133.95,136.04,140.77,143.08,156.17,165.03；C22H22N2O2,MS(ES+)m/z:347.1756(M+H)+。N-(2-氨基苯基)-4-((4-丙基苯氧基甲基)苯甲酰胺(化合物18a)mp171.5-173.0℃；1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝9.68(s,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,2H),7.58(d,J＝8.0Hz,2H),7.20(d,J＝7.7Hz,1H),7.12(d,J＝8.4Hz,2H),6.97(m,3H),6.81(d,J＝7.8Hz,1H),6.62(t,J＝7.5Hz,1H),5.18(s,2H),4.92(s,2H),2.48(d,J＝7.7Hz,2H)；1.56(m,2H),0.88(t,J＝7.4Hz,3H)；13CNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝13.56,24.27,36.35,68.57,114.60,116.09,116.21,123.27,126.45,126.65,127.09,127.90,129.22,133.96,134.39,140.76,143.11,156.21,165.03；C23H24N2O2,MS(ES+)m/z:361.1911(M+H)+。實(shí)施例2：化合物抗腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(1)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系，選用四種癌細(xì)胞：人肺癌細(xì)胞A549，人胃癌細(xì)胞MGC80-3，人肝癌細(xì)胞HepG2，人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116。實(shí)驗(yàn)前，四種癌細(xì)胞被保藏在液氮中，首先取出癌細(xì)胞，在37攝氏度的水浴鍋中使其快速升溫到37攝氏度，將細(xì)胞液離心去除上層凍存液，細(xì)胞用培養(yǎng)基重新懸浮后，轉(zhuǎn)移到24mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶加入6ml培養(yǎng)基于37攝氏度，含5％CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，(其中人肝癌細(xì)胞HepG2，人胃癌細(xì)胞MGC80-3，在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，用0.25％胰蛋白酶常規(guī)消化后傳代培養(yǎng)。人肺癌細(xì)胞A549，人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，用0.25％胰蛋白酶常規(guī)消化后傳代培養(yǎng)。)等細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到培養(yǎng)瓶70％-80％左右時(shí)，先用PBS洗去培養(yǎng)基，用0.25％胰蛋白酶消化將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中脫落下來，加入新鮮培養(yǎng)基離心后，去除上層培養(yǎng)基，再加入新鮮培養(yǎng)基重懸后1：2～3傳代。(2)當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，將處于對(duì)數(shù)期的癌細(xì)胞用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞后，用新鮮培養(yǎng)基稀釋到(3～4)×104個(gè)/ml的細(xì)胞密度，在96孔板中，每孔加入90μL的細(xì)胞液，在37攝氏度，含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，加藥(把合成的化合物事先稀釋到一系列不同的濃度，將不同濃度的化合物溶液加入到96孔板中，每個(gè)濃度重復(fù)3個(gè)復(fù)孔)，72小時(shí)后，96孔板中每孔加入10μLCCK-8溶液，再培養(yǎng)1小時(shí)后，用BIO-RAD酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的吸光度值，通過GraphpadPrism5軟件擬合得到抑制曲線，最終得到IC50值。表2：本發(fā)明所合成的化合物對(duì)不同癌細(xì)胞的抑制效果化合物名稱A549MGC80-3HepG2HCT116CS055(西達(dá)本胺)11.02±0.816.44±1.1722.65±3.092.28±0.77CI99420.10±0.7611.60±1.0418.51±1.777.71±0.865a6.76±0.205.67±0.826.70±0.734.89±0.296a8.34±0.746.02±0.347.02±0.76/12a5.37±0.214.97±0.653.84±0.543.86±0.3915a5.43±0.256.53±0.636.59±0.604.86±0.4316a5.53±0.213.48±0.334.20±0.512.02±0.2317a6.42±0.365.88±0.596.96±1.314.83±0.5518a5.21±1.274.42±0.674.75±0.893.23±0.73表2的結(jié)果表明：本發(fā)明合成的苯甲酰胺類化合物對(duì)四種癌細(xì)胞具有比參比藥物更強(qiáng)的抗腫瘤效果，尤其對(duì)于人肝癌細(xì)胞，本專利中合成的苯甲酰胺類化合物比參比化合物CI994的藥效強(qiáng)2-5倍，比參比藥物西達(dá)本胺的藥效強(qiáng)3-6倍。實(shí)施例3：化合物抗腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549肺癌細(xì)胞鋪于12孔板，每孔鋪60萬個(gè)細(xì)胞，24h后用槍頭在每孔底部劃線得劃痕，再分別用8μmol/LCS055，CI994，12a，16a處理細(xì)胞，以DMSO處理組為空白對(duì)照，48h后用顯微鏡拍照。由圖1可看出本發(fā)明合成的化合物12a,16a比參比藥物CS055和CI994具有更強(qiáng)的抗癌細(xì)胞遷移的能力。實(shí)施例4：化合物抗腫瘤細(xì)胞單克隆形成實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549肺癌細(xì)胞鋪于6孔板，每孔鋪3000個(gè)細(xì)胞，立即用2μmol/L,4μmol/L，8μmol/L的CS055，CI994，12a，16a處理細(xì)胞，以DMSO處理組為空白對(duì)照，7天后，移去每孔的培養(yǎng)基，加入PBS(磷酸鹽緩沖液)輕輕洗2遍，加入3.7％甲醛水溶液固定20min，再用PBS輕輕洗兩遍，0.1％結(jié)晶紫水溶液染色30min，PBS洗3遍，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并拍照。由圖2可看出本發(fā)明合成的化合物12a,16a比參比藥物CI994具有更強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞單克隆形成的能力。實(shí)施例5：化合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549肺癌細(xì)胞鋪于6孔板，每孔鋪16萬個(gè)細(xì)胞，24h后加入CS055，CI994和12a(濃度為4μmol/L和8μmol/L)處理細(xì)胞，以DMSO處理為對(duì)照組，48h后收集每孔的培養(yǎng)基，用胰酶消化收集各孔細(xì)胞，1000rpm離心5min，去除離心后的上清，再用PBS洗兩遍，然后加入100μL1×bindingbuffer緩沖液，5μLofAlexaFluor488annexin和1μL的碘化丙錠(100μg/ml)，避光室溫孵育15min，以AlexaFluor488annexin和碘化丙錠單染的組別作為對(duì)照組，樣品用MoFloXDP流式細(xì)胞儀檢測(cè)。由化合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的細(xì)胞流式圖可看出本發(fā)明合成的化合物12a在8μmol/L濃度下能夠誘導(dǎo)64.4％的A549肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，而CS055(西達(dá)本胺)僅能誘導(dǎo)22.42％的A549肺癌細(xì)胞凋亡，CI994僅能誘導(dǎo)12.58％的A549肺癌細(xì)胞凋亡。由此可見本發(fā)明所合成的化合物具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。實(shí)施例6：化合物阻斷腫瘤細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549肺癌細(xì)胞鋪于6孔板，每孔鋪16萬個(gè)細(xì)胞，24h后加入CS055，CI994和12a(濃度為2μmol/L和16μmol/L)處理細(xì)胞，以DMSO處理為對(duì)照組，48h后收集每孔的培養(yǎng)基，用胰酶消化收集各孔細(xì)胞，1000rpm離心5min，去除離心后的上清，再用PBS洗兩遍，細(xì)胞用70％乙醇固定，PBS洗兩遍，加入RNA酶37℃避光孵育30min，樣品用MoFloXDP流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果顯示無論在2μmol/L還是16μmol/L濃度下CS055和CI994對(duì)A549肺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期基本無影響，而本發(fā)明合成的化合物12a在16μmol/L濃度下能將癌細(xì)胞周期阻斷在G2/M期(加DMSO處理的對(duì)照組癌細(xì)胞處于G2/M期的比例為9.1％，經(jīng)過16μmol/L化合物12a的處理后，處于G2/M期癌細(xì)胞的比例增加到37.74％)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3