本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及鹽酸納洛酮的新用途，具體涉及鹽酸納洛酮的藥物組合物及其在宮頸癌中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：鹽酸納洛酮為純粹的阿片受體拮抗藥，本身無(wú)內(nèi)在活性。但能競(jìng)爭(zhēng)性拮抗各類阿片受體，對(duì)μ受體有很強(qiáng)的親和力。納洛酮生效迅速，拮抗作用強(qiáng)。納洛酮同時(shí)逆轉(zhuǎn)阿片激動(dòng)劑所有作用，包括鎮(zhèn)痛。另外其還具有與拮抗阿片受體不相關(guān)的回蘇作用。可迅速逆轉(zhuǎn)阿片鎮(zhèn)痛藥引起的呼吸抑制，可引起高度興奮，使心血管功能亢進(jìn)。本品尚有抗休克作用。不產(chǎn)生嗎啡樣的依賴性、戒斷癥狀和呼吸抑制。迄今為止，尚未見(jiàn)鹽酸納洛酮及其藥物組合物與宮頸癌的相關(guān)性報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種鹽酸納洛酮的藥物組合物，該藥物組合物中含有鹽酸納洛酮和一種天然產(chǎn)物，鹽酸納洛酮和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療宮頸癌。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(Ⅰ)，一種鹽酸納洛酮的藥物組合物，包括鹽酸納洛酮、化合物(Ⅰ)和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型；化合物(Ⅰ)具有如下結(jié)構(gòu)式：進(jìn)一步地，藥學(xué)上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體或潤(rùn)滑劑。進(jìn)一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。上述化合物(Ⅰ)的制備方法，包含以下操作步驟：(a)將水飛薊粉碎，用70～80％乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中正丁醇萃取物用大孔樹(shù)脂除雜，先用15％乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70％乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集70％洗脫液，減壓濃縮得70％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中70％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、30:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1、15:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72％的甲醇水溶液等度洗脫，收集8～14個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(Ⅰ)。進(jìn)一步地，化合物(Ⅰ)的制備方法中，所述大孔樹(shù)脂為D101型大孔吸附樹(shù)脂。上述化合物(Ⅰ)在制備治療宮頸癌的藥物中的應(yīng)用。上述鹽酸納洛酮的藥物組合物在制備治療宮頸癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供的鹽酸納洛酮的藥物組合物中含有鹽酸納洛酮和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，鹽酸納洛酮和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)宮頸癌具有治療作用；二者聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)宮頸癌的治療效果進(jìn)一步提高，可以開(kāi)發(fā)成治療宮頸癌的藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。實(shí)施例1：化合物(Ⅰ)分離制備及結(jié)構(gòu)確證試劑來(lái)源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購(gòu)自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。分離方法：(a)將水飛薊(2kg)粉碎，用75％乙醇熱回流提取(20L×3次)，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味(4L)，依次用石油醚(4L×3次)、乙酸乙酯(4L×3次)和水飽和的正丁醇(4L×3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中正丁醇萃取物用D101型大孔樹(shù)脂除雜，先用15％乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70％乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集70％洗脫液，減壓濃縮得70％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中70％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1(8個(gè)柱體積)、30:1(8個(gè)柱體積)、15:1(8個(gè)柱體積)和5:1(10個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1(8個(gè)柱體積)、15:1(10個(gè)柱體積)和2:1(5個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72％的甲醇水溶液等度洗脫，收集8～14個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)(純度大于98％)。結(jié)構(gòu)確證：HR-ESI-MS顯示[M+H]+為m/z399.1942，結(jié)合核磁特征可得分子式為C20H30O8，不飽和度為6。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δH(ppm，CDCl3，500MHz)：H-1a(1.86，m)，H-1b(1.15，m)，H-2(2.24，m)，H-5(4.67，s)，H-7(3.42，s)，H-8(1.31，s)，H-10(2.04，m)，H-11(1.47，m)，H-12(3.45，s)，H-14(3.65，s)，H-16a(5.21，s)，H-16a(5.10，s)，H-17(2.01，s)，H-18(0.97，d，J＝5.9Hz)，H-19(1.01，d，J＝7.1Hz)，H-20(1.32，s)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δC(ppm，CDCl3，125MHz)：31.2(CH2，1-C)，37.1(CH，2-C)，214.3(C，3-C)，101.5(C，4-C)，72.8(CH，5-C)，96.1(C，6-C)，67.4(CH，7-C)，40.1(CH，8-C)，72.4(C，9-C)，48.5(CH，10-C)，38.1(CH，11-C)，68.7(CH，12-C)，89.5(C，13-C)，60.2(CH，14-C)，143.5(C，15-C)，115.1(CH2，16-C)，18.1(CH3，17-C)，12.2(CH3，18-C)，16.4(CH3，19-C)，19.2(CH3，20-C)。紅外光譜表明該化合物含有羥基(3436cm-1)。氫譜顯示四個(gè)甲基信號(hào)[δH2.01(3H，s，Me-17)，0.97(3H，d，J＝5.9Hz，Me-18)，1.01(3H，d，J＝7.1Hz，Me-19)和1.32(3H，s，Me-20)]，一組末端雙鍵信號(hào)[δH5.21(1H，s，H-16a)和5.10(1H，s，H-16b)]，五個(gè)連氧次甲基質(zhì)子信號(hào)[δH4.67(1H，s，H-5)，3.42(1H，s，H-7)，3.45(1H，s，H-12)和3.65(1H，s，H-14)]。該化合物的碳譜顯示該化合物有20個(gè)碳信號(hào)，包括四個(gè)甲基，兩個(gè)亞甲基(一個(gè)烯烴碳)，八個(gè)次甲基(四個(gè)連氧碳)，以及六個(gè)季碳(一個(gè)酮羰基碳，一個(gè)烯烴碳以及四個(gè)連氧季碳)。通過(guò)核磁數(shù)據(jù)以及高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，可以推測(cè)該化合物為一個(gè)典型的瑞香烷型化合物。通過(guò)HMBC譜的解析可以發(fā)現(xiàn)，H-2/C-3，H-19/C-3，H-5/C-4，H-5/C-6，H-8/C-7以及H-20/C-7的相關(guān)性可以證明該化合物中C-4，C-5，C-6和C-7均為連氧碳，同時(shí)C-3為一個(gè)羰基碳信號(hào)。另外，H-18/C-12，H-12/C-14，H-12/C-13的相關(guān)性說(shuō)明C-12，C-13以及C-14均為連氧碳。最后，通過(guò)H-17/C-16以及H-16/C-13之間的相關(guān)說(shuō)明在C-15和C-16之間存在一個(gè)末端雙鍵。至此，解析出該化合物中6個(gè)不飽和度中的5個(gè)，通過(guò)和trigochininsA的核磁數(shù)據(jù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，該化合物的C-4和C-6位的碳譜數(shù)據(jù)均發(fā)生很大的位移，故而該化合物中存在一個(gè)C-4和C-6之間的四元環(huán)。ROESY譜中H-1b/H-8，H-8/H-7，H-8/H-11，H-8/H-14以及H-11/H-12的相關(guān)信號(hào)表明這些質(zhì)子都是位于β位的。同時(shí)，H-5/H-10，H-5/H-20，H-10/H-2，H-10/H-18的相關(guān)性顯示這些質(zhì)子都是位于α位的。此外，H-17/H-14以及H-16/H-12之間強(qiáng)烈的相關(guān)說(shuō)明該化合物中13-OH位于α位的。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和ROESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過(guò)ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致。該化合物化學(xué)式及碳原子編號(hào)如下：實(shí)施例2：藥理作用本實(shí)施例使用人宮頸癌Hela細(xì)胞懸液制備宮頸癌大鼠模型，檢測(cè)三組大鼠宮頸癌組織中Survivin、Caspase-3和Caspase-7表達(dá)水平。觀察藥物下調(diào)宮頸癌大鼠凋亡抑制因子Survivin水平，改善凋亡因子Caspase-3和Caspase-7的表達(dá)等方面的抗宮頸癌作用。1、材料與方法1.1動(dòng)物6周齡雌性Wistar大鼠，平均體重(153±14)g，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物中心。1.2試劑與樣品鹽酸納洛酮購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。化合物(Ⅰ)自制，制備方法見(jiàn)實(shí)施例1。人宮頸癌Hela細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所；兔抗人Survivin抗體、兔抗人Caspase-3抗體、兔抗人Caspase-7抗體和DAB顯色劑購(gòu)于CellSignallingTechnology公司。1.3大鼠分組及模型制備無(wú)菌操作下，取人宮頸癌Hela細(xì)胞置于RPMI-1640培養(yǎng)液(成為分10％胎牛血清和2％谷氨酰胺)中，在37℃體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，用0.25％胰酶消化細(xì)胞，10％體積分?jǐn)?shù)的小牛血清培養(yǎng)基終止消化，1200r/min離心10min，洗滌，調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為107/mL，抽取人宮頸癌Hela細(xì)胞懸液，向大鼠腋窩皮下注射0.5mL，常規(guī)飼養(yǎng)大鼠7d后見(jiàn)明顯腫瘤結(jié)節(jié)生長(zhǎng)，為造模成功，剔除沒(méi)有造模成功的大鼠。大鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、鹽酸納洛酮組(80mg·kg-1)、化合物(Ⅰ)組(80mg·kg-1)、鹽酸納洛酮與化合物(Ⅰ)組合物組【40mg·kg-1鹽酸納洛酮+40mg·kg-1化合物(Ⅰ)】。正常對(duì)照組為未造模的大鼠，予以混合飼料和純凈水飼養(yǎng)，由大鼠自行飲食。模型對(duì)照組予以混合飼料和純凈水飼養(yǎng)；藥物組在飼養(yǎng)的基礎(chǔ)上，每天灌胃給藥。1.4檢測(cè)Survivin、Caspase-3和Caspase-7的蛋白表達(dá)大鼠飼養(yǎng)3周后處死，無(wú)菌操作下，模型組和給藥組取腫瘤組織50mg，正常對(duì)照組腋窩皮下組織50mg，將選取好的組織經(jīng)PBS緩沖液洗滌，將洗滌后的組織研磨、離心收集，用冰冷PBS洗滌細(xì)胞3次后，加入裂解緩沖液，搖勻，置于4℃水中冰浴30min，1200r/min離心10min，吸取上清液，即胞質(zhì)蛋白。采用BCA法對(duì)樣品蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白定量。調(diào)整樣品蛋白量為30～40μg后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PBST洗膜5min后，PBST溶解封閉PVDF膜2h。繼而加入兔抗人Survivin抗體、兔抗人Caspase-3抗體、兔抗人Caspase-7抗體(按1：1000稀釋)或抗β-actin(1：2000稀釋)，置于4℃環(huán)境中過(guò)夜。PBST洗滌3次，每次10min，加入二抗，溫室孵育2h。再次用PBST洗滌3次，每次10min。將PVDF膜ECL顯色，在暗室中將PVDF曝光于X光片中，用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS18.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1對(duì)宮頸癌模型大鼠移植瘤體積的的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，正常對(duì)照組未見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)；與模型對(duì)照組比較，鹽酸納洛酮與化合物(Ⅰ)組合物組腫瘤體積明顯縮小(P＜0.01)；與模型對(duì)照組比較，鹽酸納洛酮組、化合物(Ⅰ)組腫瘤體積縮小(P＜0.05)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，體積單位為mm3。2.2對(duì)宮頸癌模型大鼠移植瘤組織中Survivin、Caspase-3和Caspase-7蛋白表達(dá)的影響與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組組大鼠腫瘤組織中Survivin的表達(dá)明顯升高，而其Caspase-3和Caspase-7蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與模型對(duì)照組比較，鹽酸納洛酮與化合物(Ⅰ)組合物組大鼠腫瘤組織中Survivin的表達(dá)較明顯降低(P＜0.01)，Caspase-3和Caspase-7蛋白的表達(dá)均顯著升高(P＜0.01)；與模型對(duì)照組比較，鹽酸納洛酮組、化合物(Ⅰ)組大鼠腫瘤組織中Survivin的表達(dá)降低(P＜0.05)，Caspase-3和Caspase-7蛋白的表達(dá)均升高(P＜0.05)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表1對(duì)移植瘤體積和移植瘤組織中Survivin、Caspase-3和Caspase-7蛋白表達(dá)的影響組別體積SurvivinCaspase-3Caspase-7正常對(duì)照組00.017±0.0040.894±0.3290.952±0.257模型對(duì)照組975±2320.856±0.2540.367±0.2560.494±0.167鹽酸納洛酮組274±320.474±0.1280.568±0.2970.727±0.169化合物(Ⅰ)組283±270.425±0.1130.534±0.2520.725±0.159鹽酸納洛酮與化合物(Ⅰ)組合物組25±40.277±0.2320.798±0.1990.927±0.154宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤。本病是由宮頸上皮內(nèi)瘤變形成后繼續(xù)發(fā)展，突破上皮下基膜侵潤(rùn)間質(zhì)，形成宮頸侵潤(rùn)癌。宮頸轉(zhuǎn)化區(qū)上皮化生過(guò)度活躍，并在致癌因素作用下也可形成宮頸侵潤(rùn)癌。常與性生活紊亂、分娩次數(shù)多、高危型HPV感染、早婚等因素有關(guān)。本病發(fā)病初期可有接觸性出血、陰道異常分泌物等癥狀，但多數(shù)患者早期常無(wú)明顯癥狀和體征，晚期可出現(xiàn)陰道出現(xiàn)不規(guī)則流血以及癌組織累及其他組織器官出現(xiàn)的繼發(fā)性癥狀。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，我國(guó)宮頸癌患病率仍處于逐年上升趨勢(shì)。細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子和凋亡抑制因子共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過(guò)程。Survivin是目前發(fā)現(xiàn)凋亡抑制作用最強(qiáng)的因子，能夠抑制凋亡促進(jìn)因子酶原轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘蛲龃龠M(jìn)因子，抑制細(xì)胞凋亡，在正常人組織中幾乎零表達(dá)，但在惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到不可忽略的作用。有研究報(bào)道，正常人體組織中Survivin為低表達(dá)，宮頸CIN患者組織中Survivin呈中等表達(dá)，而宮頸癌患者組織中Survivin呈現(xiàn)出高表達(dá)。根據(jù)Survivin這一特點(diǎn)，可將Survivin做為判斷惡性腫瘤預(yù)后和輔助診斷的重要指標(biāo)，也可為惡性腫瘤靶點(diǎn)治療提供依據(jù)。Caspase-3和Caspase-7是凋亡促進(jìn)因子Caspase家族的重要成員，具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。人體少數(shù)細(xì)胞非依賴凋亡促進(jìn)因子，但大多數(shù)細(xì)胞凋亡依賴凋亡因子的誘導(dǎo)，當(dāng)?shù)蛲龃龠M(jìn)因子被抑制，活性受到抑制，細(xì)胞凋亡與增殖平衡失調(diào)，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。凋亡抑制因子Survivin下調(diào)時(shí)，凋亡促進(jìn)因子Caspase上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Survivin可直接或間接作用于Caspase來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明，鹽酸納洛酮、化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)宮頸癌具有治療作用；鹽酸納洛酮和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時(shí)，治療效果進(jìn)一步提高，可以開(kāi)發(fā)成治療宮頸癌的藥物。上述實(shí)施例的作用在于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3