本發(fā)明涉及藥物化合物領(lǐng)域，具體地說，涉及海洋真菌來源的萘螺縮酮類化合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著老齡化加劇、生態(tài)環(huán)境遭到破壞、不健康生活方式及食品安全問題凸現(xiàn)，我國腫瘤發(fā)病率多年來持續(xù)上升。據(jù)世界癌癥報(bào)告估計(jì)，2015年中國癌癥發(fā)病人數(shù)約為430萬，約占全球發(fā)病人數(shù)的五分之一；癌癥死亡人數(shù)約為280萬，約占全球癌癥死亡人數(shù)的四分之一。此外，根據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的《2015中國腫瘤登記年報(bào)》顯示，全國腫瘤登記地區(qū)惡性腫瘤發(fā)病率第一位的是肺癌，其次為胃癌、肝癌和食管癌；同時(shí)，死亡第一位的也是肺癌，其次為胃癌、食管癌和肝癌。因此，在我國，癌癥已成為一個(gè)必須高度重視的公共衛(wèi)生問題乃至社會(huì)問題。現(xiàn)有的治療癌癥的藥物中，要么副作用大，要么價(jià)格昂貴。所以癌癥的高發(fā)，增加的不僅僅是患者的傷痛，還給家庭、社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。為了避免或減少當(dāng)前藥物的不良副作用或耐藥性，同時(shí)提供更多候選藥物和降低治療癌癥藥物的成本，因此尋找新的抗腫瘤藥物是迫切需要的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供來源于海洋紅樹林內(nèi)生真菌的一類新的萘螺縮酮類化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述萘螺縮酮類化合物的制備方法。
本發(fā)明的又一目的是提供上述萘螺縮酮類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
海洋真菌來源的萘螺縮酮類化合物，結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)所示：
上述萘螺縮酮類化合物的制備方法，包括如下步驟：
(1)將海洋真菌的菌株Lasiodiplodia theobromae ZJ-HQ1從斜面培養(yǎng)基中接入種子培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液；所述海洋真菌的保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢市武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC M 2016219，保藏日期為2016年4月21日；
(2)將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)；
(3)將發(fā)酵產(chǎn)物過濾得到菌體，菌體用甲醇浸泡，減壓濃縮，得到浸膏，再經(jīng)層析分離，得到萘螺縮酮類化合物1或2。
作為一種優(yōu)選方案，上述制備方法中，步驟(1)所述種子培養(yǎng)基的組分為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1L。
作為一種優(yōu)選方案，上述制備方法中，步驟(2)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：東北大米6000g，海鹽180g，水6L。
作為一種優(yōu)選方案，上述制備方法中，步驟(1)所述搖床培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速200rpm，溫度28℃，培養(yǎng)時(shí)間72h。
作為一種優(yōu)選方案，上述制備方法中，步驟(2)所述靜置培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)時(shí)間為28天。
作為一種優(yōu)選方案，上述制備方法中，步驟(3)所述浸膏用硅膠柱層析進(jìn)行分離，分離用10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、100％的乙酸乙酯/石油醚梯度淋洗；收集10％－50％乙酸乙酯/石油醚洗脫液，40％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液，再以凝膠柱層析分離，重結(jié)晶純化，即得到黃色顆粒晶體化合物1和2，即為萘螺縮酮類化合物1和2。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
本發(fā)明的萘螺縮酮類化合物1和2來源于海洋真菌，海洋真菌種類繁多、數(shù)量龐大，從真菌提取的方法簡單，使得萘螺縮酮類化合物1和2來源豐富、成本低廉；萘螺縮酮類化合物1和2抗腫瘤活性高，應(yīng)用前景廣闊。
附圖說明
圖1為萘螺縮酮類化合物1和2的X-ray單晶衍射結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施實(shí)例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施實(shí)例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。
實(shí)施例1：
本發(fā)明的化合物，可以從海洋真菌Lasiodiplodia theobromae ZJ-HQ1的菌體中分離得到。海洋真菌是從廣東省湛江紅樹林保護(hù)區(qū)紅樹植物老鼠簕的葉子部分離得到；具體步驟如下：
1.種子培養(yǎng)：
1.1配制種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，自來水1L，平均分裝于5個(gè)500mL錐形瓶，121℃滅30分鐘。
1.2種子的培養(yǎng)：將海洋真菌的菌株接入種子培養(yǎng)基，在28℃的溫度下，置搖床上以200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)72小時(shí)得種子培養(yǎng)液。
2.發(fā)酵培養(yǎng)：
2.1配制發(fā)酵培養(yǎng)基：東北大米6000g，海鹽180g，自來水6L，121℃滅30分鐘。
2.2發(fā)酵培養(yǎng)：
無菌操作將種子液5mL接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，于25℃靜置培養(yǎng)28天。
3.提取分離：
發(fā)酵物用甲醇浸泡，浸泡液在低于50℃下減壓濃縮得浸膏32.2g。該浸膏經(jīng)硅膠柱層析進(jìn)行分離，分別用10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，100％的乙酸乙酯-石油醚梯度淋洗，分成30組分。其中第15組分，采用葡聚糖凝膠Sephadex LH-20層析，用體積比為1:1的甲醇-氯仿為洗脫劑進(jìn)行洗脫，再用硅膠柱層，40％乙酸乙酯-石油醚為洗脫劑，獲得化合物1和2。實(shí)施例2：對(duì)實(shí)施例1中的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析測試，得到以下理化性質(zhì)數(shù)據(jù)：
化合物1：淡黃色晶體，熔點(diǎn)189.0-190.2℃(溫度計(jì)未校正)，EI-MS(m/z)：430[M]+。
化合物2：淡黃色晶體，熔點(diǎn)198.3-199.9℃(溫度計(jì)未校正)，EI-MS(m/z)：444[M]+。
化合物1–2的NMR數(shù)據(jù)見表1。
萘螺縮酮類化合物1和2的X-ray單晶衍射結(jié)構(gòu)圖如圖1。
表1化合物1–2的NMR數(shù)據(jù)(125MHz/500MHz，TMS，ppm)
化合物1–2的單晶數(shù)據(jù)見表2。
表2
實(shí)施例2:
對(duì)實(shí)施例1中的化合物1和2對(duì)五種細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)：
1.材料：
1.1四唑化合物(MTS)：
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,CellTiter 96Aqueous One Solution Reagent,Promega,USA)。
1.2靶細(xì)胞的制備：人肺癌細(xì)胞株A549，人肝癌細(xì)胞株HepG2,子宮頸癌細(xì)胞株Hela，人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和人正常細(xì)胞HEK293T的復(fù)蘇與培養(yǎng)。
a.從液氮罐中取出人肺癌細(xì)胞株A549，人肝癌細(xì)胞株HepG2,子宮頸癌細(xì)胞株Hela，人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和人正常細(xì)胞HEK293T的凍存管,迅速置入37℃水浴箱中，不停搖動(dòng)使之迅速溶化，無菌操作移入離心管中；
b.向人肺癌細(xì)胞株A549，人肝癌細(xì)胞株HepG2,子宮頸癌細(xì)胞株Hela，人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7加入DMEM完全培養(yǎng)液至10mL，1000rmp離心5min，棄上清；而人正常細(xì)HEK293T則加入RPMI-1640培養(yǎng)液至10mL，1000rmp離心5min，棄上清；
c.重復(fù)以上操作一次；
d.人肺癌細(xì)胞株A549，人肝癌細(xì)胞株HepG2,子宮頸癌細(xì)胞株Hela，人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7以DMEM完全培養(yǎng)液吹打使細(xì)胞混勻后移入培養(yǎng)瓶中，5％CO2，37℃培養(yǎng)；而人正常細(xì)HEK293T則加入RPMI-1640培養(yǎng)液吹打使細(xì)胞混勻后移入培養(yǎng)瓶中，5％CO2，37℃培養(yǎng)；
e.觀察細(xì)胞生長情況，及時(shí)更換培養(yǎng)液，分瓶。
1.3細(xì)胞計(jì)數(shù)：
a.選取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化，培養(yǎng)基終止，移入離心管中，加培養(yǎng)基至10mL；
b.取10μl細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板一側(cè)凹槽中，顯微鏡下計(jì)數(shù)四大格的細(xì)胞總數(shù)、除以4，乘104，即為每毫升培養(yǎng)液所含細(xì)胞數(shù)；
c.調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105/mL。
1.4化合物1和2的配制：取氯代萘縮酮化合物1和2加入到DMEM完全培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度為500μmol/mL，超聲乳化，過濾除菌，4℃保存。
2.試驗(yàn)方法
a.96孔板各孔加入人肺癌細(xì)胞株A549，人肝癌細(xì)胞株HepG2,子宮頸癌細(xì)胞株Hela，人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和人正常細(xì)胞HEK293T，50μL(1×105/mL)，5％CO2，37℃培養(yǎng)12h。
b.加入不同濃度受試對(duì)象50μL，對(duì)照加DMEM完全培養(yǎng)基50μL，繼續(xù)培養(yǎng)72h。
c.加入MTS(CellTiter 96Aqueous One Solution Reagent,Promega,USA)各10μL，繼續(xù)培養(yǎng)1h。
d.酶標(biāo)儀(TECAN，Switzerland)490nm下測定每孔OD值。
e.計(jì)算抑制率：
腫瘤細(xì)胞殺傷率％＝[(對(duì)照組測定的平均OD值－加藥組測定的平均OD值)/對(duì)照組測定的平均OD值]×100％。
f.以抑制率對(duì)藥物濃度的對(duì)數(shù)作圖，求得IC50值；以lg c為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，求得IC50值。
3.試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)結(jié)果顯示萘螺縮酮類化合物1和2均能有效抑制人肺癌細(xì)胞株A549，人肝癌細(xì)胞株HepG2,子宮頸癌細(xì)胞株Hela，人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，人正常細(xì)胞HEK293T，化合物1和2的抑制腫瘤IC50值(μM)見表3。
表3化合物1和2的體外細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果(IC50μM)