本發(fā)明涉及免疫球蛋白基因重排領(lǐng)域，具體涉及捕獲和擴(kuò)增Igκ基因二次重排中間產(chǎn)物的方法lm-pcr。

背景技術(shù)：

骨髓B淋巴細(xì)胞分化和發(fā)育過程伴隨著免疫球蛋白重鏈(IgH)和輕鏈(Igκ)胚系基因的重排以及功能性B細(xì)胞表面受體(BCR)的表達(dá)，V(D)J基因重排產(chǎn)生了豐富多樣的免疫球蛋白基因庫(kù)。但是，V(D)J基因重排過程也會(huì)產(chǎn)生自身反應(yīng)性的BCR。在陰性選擇過程中，自身反應(yīng)性的B淋巴細(xì)胞會(huì)被凋亡，或者通過重鏈基因替換(IgH replacement)和Igκ基因二次重排(secondary Igκrearrangements)改變自身反應(yīng)性BCR的特異性達(dá)到免疫耐受(immune tolerance)，從而避免自身反應(yīng)性B細(xì)胞被凋亡。

Igκ基因二次重排作為受體編輯的主要途徑，啟動(dòng)該途徑的分子機(jī)制一直不明確，研究人員試圖通過PCR擴(kuò)增Igκ基因二次重排的中間產(chǎn)物來(lái)對(duì)該途徑的分子機(jī)制進(jìn)行分析，但是由于Igκ基因二次重排的發(fā)生時(shí)間是瞬時(shí)的，只有足夠的模板量存在時(shí)才能擴(kuò)增得到目標(biāo)片段，因此，研究人員利用southern blot方法結(jié)合lm-pcr來(lái)擴(kuò)增Igκ基因二次重排中間產(chǎn)物，但是下游引物無(wú)修飾，靈敏度和特異性低，而且³²P標(biāo)記的探針有輻射，對(duì)身體有害，目標(biāo)片段不能回收，不能進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序及信息分析。此外，有些研究人員針對(duì)特定的Vκ和Jκ設(shè)計(jì)引物通過普通PCR來(lái)擴(kuò)增VκJκ基因片段，但這樣擴(kuò)增得到的VκJκ基因片段并不能確定是否是被Igκ基因二次重排排除掉的基因片段。因此，該領(lǐng)域需要一種特異性強(qiáng)，靈敏度高的方法來(lái)捕獲被Igκ基因二次重排替換掉的VκJκ基因片段，而且該產(chǎn)物能回收測(cè)序進(jìn)行進(jìn)一步的信息分析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種分析Igκ基因二次重排中間產(chǎn)物的方法及試劑盒。

lm-pcr即ligation-mediated PCR，最初是將寡核苷酸鏈(linker)連接到基因組DNA片段斷端，與PCR相結(jié)合用于擴(kuò)增連接有l(wèi)inker的DNA片段，進(jìn)而完成基因組DNA測(cè)序以及體外DNA足跡。本發(fā)明將lm-pcr技術(shù)引進(jìn)到捕獲RAG酶剪切免疫球蛋白基因片段產(chǎn)生的斷端，并利用特異性結(jié)合Vκ基因片段的上游引物以及特異性結(jié)合RS序列的下游引物來(lái)擴(kuò)增被Igκ基因二次重排替換的初次重排基因片段。

本發(fā)明的技術(shù)原理為：優(yōu)化linker連接到基因組DNA上的反應(yīng)體系。根據(jù)Vκ基因家族中同源性較高的Vκ基因片段設(shè)計(jì)上游引物，上游引物包括Vκout和Vκin，通過Vector NTI軟件比對(duì)同源性較高的Vκ基因序列，在其框架區(qū)2處設(shè)計(jì)Vκout和Vκin，利用兼并引物，保證上游引物的靈敏度和特異性，提高lm-pcr擴(kuò)增效率。根據(jù)RS序列中的保守7聚體序列，在下游引物JκBW-LCH的3’端加上TSACAC六個(gè)堿基，提高擴(kuò)增目標(biāo)片段的靈敏度和特異性。此外根據(jù)引物的退火溫度以及目標(biāo)片段的大小，采用PCR兩步循環(huán)法，以及熱啟動(dòng)酶，不斷優(yōu)化反應(yīng)體系，得到最優(yōu)的lm-pcr反應(yīng)體系。

本發(fā)明技術(shù)方案

一種分析Igκ基因二次重排中間產(chǎn)物的方法，該方法采用lm-pcr方法捕獲在Igκ基因二次重排中被替換掉的初次重排片段VκJκ-intron-RS，該方法包括：骨髓B淋巴細(xì)胞的流式分選，B淋巴細(xì)胞基因組DNA的提取，linker的制備，基因組DNA與linker的連接反應(yīng)，lm-pcr擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳并回收目標(biāo)片段，克隆測(cè)序驗(yàn)證目標(biāo)片段。

本發(fā)明同時(shí)提供了一種分析Igκ基因二次重排中間產(chǎn)物的試劑盒，試劑盒包含制備linker所需的寡核苷酸鏈BW-1和BW-2，其序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示；lm-pcr的上游引物：Vκ4A out、Vκ4Ain、Vκ4C out、Vκ4C in、Vκ19A out、Vκ19Ain、Vκ23A out、Vκ23Ain、Vκ12out、Vκ12in、VκRF out和VκRF in，其序列如SEQ ID NO 4-15所示；lm-pcr的下游引物JκBW-LCH，其序列如SEQ ID NO 3所示。

本發(fā)明所述試劑盒中有6對(duì)上游引物，每對(duì)上游引物都包括Vκout和Vκin，Vκout和Vκin均與Vκ基因片段的框架區(qū)2互補(bǔ)，Vκout的互補(bǔ)區(qū)位于Vκin的外側(cè)，兩者均為兼并引物，可與同一Vκ基因家族中的不同Vκ基因片段結(jié)合并進(jìn)行擴(kuò)增，從而提高了lm-pcr反應(yīng)的靈敏性和特異性。

本發(fā)明方法中，所述lm-pcr的模板是連接有l(wèi)inker的基因組DNA，linker由人工合成的寡聚脫氧核苷酸鏈BW-1和BW-2制備而成，linker的制備條件是：分別取2nmolesBW-1和BW-2于PH值為7.7濃度為250mM的Tris溶液中，定容為100ul，將混合物置于PCR儀上，90℃5min，60℃5min，常溫冷卻，-20℃冰箱保存。

所述連接有l(wèi)inker的基因組DNA是將從B淋巴細(xì)胞中提取得到的基因組DNA與制備好的linker進(jìn)行連接反應(yīng)所得，反應(yīng)體系如表1所示，反應(yīng)體系在4℃過夜反應(yīng)，-20℃冰箱保存。

表1：連接反應(yīng)體系

lm-pcr能靈敏和特異性地捕獲VκJκ-intron-RS基因片段。

所述特異性擴(kuò)增下游引物JκBW-LCH的3’端含有TSACAC六個(gè)堿基，這六個(gè)堿基與重組信號(hào)序列RS中的保守序列互補(bǔ)，增強(qiáng)了lm-pcr的靈敏性和特異性。

所述特異性擴(kuò)增上游引物包括Vκout和Vκin，Vκout和Vκin均與Vκ基因片段的框架區(qū)2互補(bǔ)，Vκout的互補(bǔ)區(qū)位于Vκin的外側(cè)，兩者均為兼并引物，能夠與同一Vκ基因家族中的不同Vκ基因片段結(jié)合并進(jìn)行擴(kuò)增，從而提高了lm-pcr反應(yīng)的靈敏性和特異性。

由于連接有l(wèi)inker的基因組DNA中含有的Igκ基因二次重排中間產(chǎn)物量比較少，lm-pcr包括兩次擴(kuò)增lm-pcr1和lm-pcr2，lm-pcr1的模板是連接有l(wèi)inker的基因組DNA，上下游引物分別為Vκout和JκBW-LCH，lm-pcr2的模板是lm-pcr1的擴(kuò)增產(chǎn)物，上下游引物分別為Vκin和JκBW-LCH，lm-pcr1是對(duì)基因組中的模板量進(jìn)行擴(kuò)充，lm-pcr2是保證特異性兼大量擴(kuò)增Igκ基因二次重排中間產(chǎn)物。

為了進(jìn)一步保證lm-pcr的特異性以及提高擴(kuò)增效率，lm-pcr1和lm-pcr2均使用熱啟動(dòng)酶，以及采用兩步循環(huán)法，lm-pcr1和lm-pcr2的反應(yīng)體系以及PCR程序設(shè)置如下：

表2：lm-pcr1的反應(yīng)體系

表3：lm-pcr2的反應(yīng)體系

lm-pcr1和lm-pcr2的PCR程序如下：

本發(fā)明所述的lm-pcr方法包括如下步驟：

1、骨髓B淋巴細(xì)胞的流式分選。

2、B淋巴細(xì)胞基因組DNA的提取。

3、linker的制備。

4、基因組DNA與linker的連接反應(yīng)。

5、以連接有l(wèi)inker的基因組DNA為模板進(jìn)行l(wèi)m-pcr1擴(kuò)增。

6、以lm-pcr1的產(chǎn)物為模板進(jìn)行l(wèi)m-pcr2擴(kuò)增。

7、瓊脂糖凝膠電泳分離lm-pcr2產(chǎn)物并回收目標(biāo)片段。

8、克隆測(cè)序驗(yàn)證目標(biāo)片段。

本發(fā)明所述的試劑盒包括制備linker所需的寡核苷酸鏈BW-1和BW-2，lm-pcr的上游引物：Vκ4A out、Vκ4Ain、Vκ4C out、Vκ4C in、Vκ19A out、Vκ19Ain、Vκ23A out、Vκ23Ain、Vκ12out、Vκ12in、VκRF out和VκRF in，lm-pcr的下游引物JκBW-LCH。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

相比較傳統(tǒng)的方法，本發(fā)明避免在Southern blot實(shí)驗(yàn)中使用P³²標(biāo)記的放射性DNA探針，本發(fā)明能夠可靠，簡(jiǎn)單和快速地對(duì)大量V(D)J基因重排進(jìn)行分析，測(cè)定抗體庫(kù)多樣性的發(fā)生階段和程度，進(jìn)而對(duì)B淋巴細(xì)胞多樣性進(jìn)行推斷。因此，本發(fā)明的方法提供了在多種應(yīng)用(例如自身免疫疾病紅斑狼瘡以及B淋巴細(xì)胞白血病的免疫測(cè)定)中對(duì)樣品中B淋巴細(xì)胞庫(kù)多樣性進(jìn)行分析的選擇工具，以用于研究自身免疫疾病的發(fā)生，以及用于研究白血病治療對(duì)免疫系統(tǒng)重建，和檢測(cè)造血干細(xì)胞移植的動(dòng)力學(xué)免疫檢測(cè)的效果。例如，在B細(xì)胞淋巴樣白血病中，通過鑒定B細(xì)胞克隆的二次V(D)J基因重排的信號(hào)，如果治療有效，該測(cè)試抗體庫(kù)Igkappa組合多樣性增加；相反，如果無(wú)應(yīng)答，抗體庫(kù)的多樣性減少。在監(jiān)測(cè)造血干細(xì)胞(骨髓)移植中，免疫庫(kù)重建或治療有效，可監(jiān)測(cè)到B細(xì)胞克隆的二次V(D)J基因重排增多，以指示B淋巴細(xì)胞的數(shù)量和多樣性增加，表明該治療方案有效。

附圖說明

附圖1為Igκ基因二次重排替換掉的初次重排片段和lm-pcr方法示意圖。

附圖2(A)為以MRL.FAS^lpr小鼠骨髓單細(xì)胞懸液為實(shí)驗(yàn)材料，從分選得到的pro-B、small pre-B和immatureB細(xì)胞中提取基因組DNA并通過lm-pcr方法獲得Igκ基因二次重排替換掉的初次重排片段，目的條帶位于400-500bp之間。

附圖2(B)為以B6.FAS^lpr小鼠骨髓單細(xì)胞懸液為實(shí)驗(yàn)材料，從分選得到的pro-B、small pre-B和immatureB細(xì)胞中提取基因組DNA并通過lm-pcr方法獲得Igκ基因二次重排替換掉的初次重排片段，目的條帶位于400-500bp之間。

附圖2(C)為以C3H小鼠骨髓單細(xì)胞懸液為實(shí)驗(yàn)材料，從分選得到的pro-B、small pre-B和immatureB細(xì)胞中提取基因組DNA并通過lm-pcr技術(shù)獲得Igκ基因二次重排替換掉的初次重排片段，目的條帶位于400-500bp之間。

附圖2(D)為以MRL.FAS^lpr小鼠骨髓單細(xì)胞懸液為實(shí)驗(yàn)材料，從分選得到的pro-B、small pre-B和immatureB細(xì)胞中提取基因組DNA并通過常規(guī)PCR方法測(cè)定基因組CD14的存在，以此指示基因組DNA提取的完整性。

附圖3為來(lái)源于MRL.FAS^lpr小鼠immature-B細(xì)胞的一個(gè)目標(biāo)序列，在圖中標(biāo)注了該序列的Vκ、Jκ、intron和RS。

具體實(shí)施方式

1、以MRL.FAS^lpr、B6.FAS^lpr和C3H小鼠骨髓單細(xì)胞懸液為實(shí)驗(yàn)材料，利用流式細(xì)胞分選技術(shù)得到不同發(fā)育階段的骨髓B淋巴細(xì)胞。

制備小鼠骨髓單細(xì)胞懸液，根據(jù)小鼠骨髓單細(xì)胞懸液中的細(xì)胞種類及其特異性表面抗原，以及B細(xì)胞各個(gè)發(fā)育階段的特異性表面抗原，設(shè)計(jì)抗體染色策略，從而分選得到野生型小鼠(C3H)和紅斑狼瘡小鼠(B6.FAS^lpr，MRL.FAS^lpr)的pro-B(B220⁺CD43⁺IGM^-IGD^-)，small pre-B(B220⁺CD43^-IGM^-IGD^-)和immature-B(B220⁺CD43^-IGM⁺IGD^-)細(xì)胞。

2、pro-B、small pre-B和immature-B細(xì)胞基因組DNA的提取對(duì)分選得到的pro-B、small pre-B、immature-B細(xì)胞進(jìn)行基因組DNA的提取，由于分選得到的細(xì)胞數(shù)量較少以及之后的lm-pcr對(duì)模板DNA的純度要求較高，采用Qiagen公司的QIAamp DNAMicro kit。

3、按照上述發(fā)明內(nèi)容中所述的制備Linker的條件進(jìn)行l(wèi)inker的制備，將制備好的linker分別與pro-B、small pre-B和immature-B細(xì)胞的基因組DNA按照上述發(fā)明內(nèi)容中所述的反應(yīng)體系進(jìn)行連接反應(yīng)。

4、分別以連接有l(wèi)inker的pro-B、small pre-B和immature-B細(xì)胞的基因組DNA為模板，Vκout和JκBW-LCH為引物進(jìn)行l(wèi)m-pcr1的擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為：ligated genomic DNA100-200ng、Vκout 1.5μl、JκBW-LCH 1.5μl、GoTaqG2HotStartPolymerase 0.125μl、5×Buffer5μl、2.5mM dNTP Mix 2μl、MgCL₂2μl和ddH₂O 11μl，總體系為25μl；PCR程序設(shè)置為：95℃2min，95℃3min，95℃45s，68℃3min，循環(huán)12次，72℃10min，4℃forever。

5、以lm-pcr1的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，Vκin和JκBW-LCH為引物進(jìn)行l(wèi)m-pcr2的擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為：lm-pcr1products 4μl、Vκin 3μl、JκBW-LCH 3μl、GoTaqG2HotStartPolymerase0.25μl、5×Buffer 10μl、2.5mM dNTP Mix 4μl、MgCL₂4μl和ddH₂O 22μl，總體系為50μl；PCR程序設(shè)置為：95℃2min，95℃3min，95℃45s，68℃3min，循環(huán)36次，72℃10min，4℃forever。

6、lm-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物由1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分離，通過瓊脂糖凝膠成像儀拍照，目的條帶位于400-500bp之間，結(jié)果圖如附圖2(A)、附圖2(B)、和附圖2(C)所示，在pro-B細(xì)胞中不發(fā)生Igκ基因二次重排，所以在400-500bp之間沒有條帶，在small pre-B和immature-B細(xì)胞中都發(fā)生Igκ基因二次重排，所以在400-500bp之間有目的條帶；附圖2(A)是以MRL.FAS^lpr小鼠的pro-B、smallpre-B和immature-B細(xì)胞基因組DNA為模板，分別以Vκ12out/in、VκRFout/in和Vκ4Cout/in作為上游引物，JκBW-LCH作為下游引物的擴(kuò)增結(jié)果；附圖2(B)是以B6.FAS^lpr小鼠的pro-B、small pre-B和immature-B細(xì)胞基因組DNA為模板，分別以Vκ12out/in、VκRFout/in和Vκ4Cout/in作為上游引物，JκBW-LCH作為下游引物的擴(kuò)增結(jié)果；附圖2(C)是以C3H小鼠的pro-B、small pre-B和immature-B細(xì)胞基因組DNA為模板，分別以Vκ4Aout/in、Vκ19Aout/in和Vκ23Aout/in作為上游引物，JκBW-LCH作為下游引物的擴(kuò)增結(jié)果。附圖2(D)是以上分選的pro-B、small pre-B和immature-B細(xì)胞基因組DNA為模板，以CD14引物用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增基因組CD14作為內(nèi)參，證明基因組完好。

7、在紫外燈下將目的條帶切下并置于干凈的EP管中，利用DNA回收試劑盒回收其中的DNA，將回收的DNA連接到克隆載體PMD19-Tvector上并對(duì)大腸桿菌感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化并進(jìn)行液體培養(yǎng)，對(duì)過夜培養(yǎng)的大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒的提取，將質(zhì)粒送去測(cè)序。

8、得到測(cè)序序列之后，利用Vector-NTI軟件找到插入片段，通過國(guó)際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)IMGT/V-QUEST和IMGT/JunctionAnalysis對(duì)插入片段進(jìn)行分析(http://www.imgt.org/)，找出目標(biāo)片段所對(duì)應(yīng)的Vκ、Jκ、intron和RS，圖3是來(lái)源于MRL.FAS^lpr小鼠immature-B細(xì)胞的一個(gè)目標(biāo)序列，在圖中標(biāo)注了該序列的Vκ、Jκ、intron和RS。