一種檢測血漿cfDNA中BCR和TCR免疫組庫的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫組庫測序技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測血漿CfDNA中BCR和TCR 免疫組庫的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 得益于下一代高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，DNA和RNA測序平臺(tái)在基 因組學(xué)的各個(gè)方面發(fā)揮著突出的推動(dòng)作用。同時(shí)，這一新興的技術(shù)領(lǐng)域也已經(jīng)被應(yīng)用于T 細(xì)胞和B細(xì)胞受體的免疫組庫測序。
[0003] 常規(guī)的T細(xì)胞和B細(xì)胞受體的免疫組庫測序，主要基于2大策略，第一：基于細(xì) 胞DNA通過TCR/BCR基因重排規(guī)律，在TCR(alpha/beta/gamma/delta鏈）和BCR(heavy/ light鏈）的可變區(qū)（variable)基因設(shè)置上游引物，在連接區(qū)（joining)J基因或恒定區(qū) (constant)C基因設(shè)置下游引物，通過PCR擴(kuò)增出目的鏈的PCR產(chǎn)物，但其往往存在擴(kuò)增時(shí) 的不均一性，從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；第二：基于細(xì)胞RNA，采用5'RACE技術(shù)，基于引入的接 頭序列進(jìn)行第二次無偏好（bias)的PCR擴(kuò)增。但是RNA樣品處理復(fù)雜，重復(fù)性不如DNA檢 測結(jié)果，并不是一種理想的原材料。
[0004] 血漿中循環(huán)游離DNA(cfDNA)，其來源主要是由細(xì)胞凋亡釋放到血中。近年來腫 瘤患者血液中游離ctDNA(Cell_freeCirculatingTumorDNA)的基因檢測診斷已成為研 究熱點(diǎn)，而且相關(guān)基于血漿CtDNA的IG-seq檢測正快速的發(fā)展中，其以血漿cfDNA/ctDNA 作為第一原料，針對(duì)特異性免疫亞克隆擴(kuò)增，以用于相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與預(yù)測，拓展了 cfDNA這一"液體活檢"標(biāo)志物應(yīng)用的廣闊前景。但個(gè)別特異性克隆的分析研究，存在著局 限性，其并不能完整全面的展現(xiàn)患者的疾病進(jìn)展情況。同時(shí)針對(duì)DNA擴(kuò)增不均一性調(diào)整的 優(yōu)化，目前分子標(biāo)簽編碼技術(shù)的引入，不僅可以區(qū)分測序和擴(kuò)增錯(cuò)誤與參照序列中的罕見 突變，而且可以進(jìn)行精準(zhǔn)的分子定量，從而最大化的實(shí)現(xiàn)了無偏好性的數(shù)據(jù)分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種檢測血漿cfDNA中BCR和TCR免疫組庫的方法以克服現(xiàn)有技術(shù)的 不足。
[0006] 本發(fā)明提供的檢測血漿CfDNA中BCR和TCR免疫組庫的方法，包括以下步驟：
[0007] (1)血漿cfDNA提取；
[0008] (2)BCRH鏈全長多重PCR擴(kuò)增和TCRP鏈CDR3多重PCR擴(kuò)增；
[0009](3)步驟（2)中兩種擴(kuò)增產(chǎn)物混合后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增；
[0010] ⑷高通量測序；
[0011] (5)免疫組庫精準(zhǔn)信息分析。
[0012] 本發(fā)明方法的流程圖見圖1。
[0013] 本發(fā)明方法中，步驟（2)中BCRH鏈全長多重PCR擴(kuò)增采用的上游引物共22條， 序列分別如SEQIDNO. 1-22所示，下游引物共6條，序列分別如SEQIDNO. 23-28所示；
[0014]TCRP鏈⑶R3多重PCR擴(kuò)增采用的上游引物共45條，序列分別如SEQID NO. 29-73所示，下游引物共4條，序列分別如SEQIDNO. 74-77所示。
[0015] 進(jìn)一步地，步驟（2)中，各條上游引物的濃度相同，各條下游引物的濃度相同，且 下游單個(gè)引物濃度為上游單個(gè)引物濃度的20倍。
[0016] 優(yōu)選地，步驟（2)中BCRH鏈全長多重PCR擴(kuò)增條件為：98°C預(yù)變性45s;98°C變 性15s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共8個(gè)循環(huán)；72°C終延伸60s;4°C保持。
[0017] 優(yōu)選地，步驟⑵中TCRP鏈CDR3多重PCR擴(kuò)增條件為：98°C預(yù)變性45s;98°C變 性15s，54°C退火30s，72°C延伸30s，共8個(gè)循環(huán)；72°C終延伸60s;4°C保持。
[0018] 本發(fā)明方法的步驟（3)所述的兩種擴(kuò)增產(chǎn)物分別是指BCRH鏈全長多重PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物中片段大小在300-350bp的片段回收純化后的產(chǎn)物、以及TCRI3鏈⑶R3多重PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物中片段大小在200-250bp的片段回收純化后的產(chǎn)物。
[0019] 優(yōu)選地，步驟（3)中將步驟（2)的兩種擴(kuò)增產(chǎn)物等體積混合后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò) 增；所采用的引物序列如SEQIDNO. 78-79所示。
[0020] 步驟（3)中PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8°C預(yù)變性45s;98°C變性15s，65°C退火30s，72°C 延伸30s，共15個(gè)循環(huán)；72°C終延伸60s;4°C保持。
[0021] 本發(fā)明的檢測血漿CfDNA中BCR和TCR免疫組庫的方法中，步驟（5)的免疫組庫 精準(zhǔn)信息分析包括以下步驟：
[0022] 1)基于已知接頭序列確定7個(gè)隨機(jī)堿基N的位置，7個(gè)隨機(jī)堿基可以形成47種唯 一標(biāo)簽，將成對(duì)測序序列的測序序列1和測序序列2的唯一標(biāo)簽序列首尾相連，形成14bp 的一條索引，并且以這14bp作為的成對(duì)測序序列索引進(jìn)行外部排序，以達(dá)到將來源于同一 個(gè)DNA模板的所有測序序列聚集到一起的目的；
[0023] 2)對(duì)聚集起來的擁有相同索引的測序序列進(jìn)行中心聚類，根據(jù)插入序列之間的漢 明距離，將每個(gè)有相同索引的大簇聚集成若干個(gè)小簇，每個(gè)小簇中任意兩對(duì)成對(duì)測序序列 的漢明距離不超過3,以達(dá)到區(qū)分開擁有相同索引卻來自不同DNA模板的測序序列的目的；
[0024] 3)對(duì)于每個(gè)DNA模板的dup簇（每個(gè)DNA模板擴(kuò)增形成的系列重復(fù)片段）中的測 序序列的每一個(gè)測序堿基進(jìn)行互相比對(duì)，若某種堿基型在測序序列中的一致率達(dá)到80 %， 則記新測序序列的這個(gè)堿基為此堿基型，否則記為N，這樣便得到了代表原始DNA模板序列 的新測序序列，通過這種方法矯正，可以有效去除測序和PCR中隨機(jī)引入的錯(cuò)誤，提高檢測 的準(zhǔn)確性；
[0025] 4)對(duì)新測序序列進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，去除接頭序列以及比對(duì)質(zhì)量小于30的測序序列；
[0026] 5)根據(jù)4)中得到的測序序列與頂GT數(shù)據(jù)庫中V、D和J區(qū)基因片段的胚系參考 序列進(jìn)行比對(duì)注釋，同時(shí)根據(jù)唯一標(biāo)簽對(duì)每個(gè)模板的唯一標(biāo)記，對(duì)各免疫亞克隆進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 定量；
[0027] 6)根據(jù)5)的結(jié)果進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)分析，免疫組庫表達(dá)譜分析、Biomarker分析。
[0028] 上述步驟2)所述的漢明距離值不超過3是本發(fā)明信息分析的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，為了盡 可能多的區(qū)分不同的亞克隆，需要盡量壓縮漢明距離的容忍度，以得到更加全面的BCR和 TCR的亞克隆類型。
[0029] 另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測血漿CfDNA中BCR和TCR免疫組庫的系統(tǒng)，包括 以下操作單元：
[0030] (1)血漿cfDNA提取單元；
[0031] (2)BCRH鏈全長多重PCR擴(kuò)增和TCRP鏈⑶R3多重PCR擴(kuò)增單元；
[0032] (3)步驟（2)中兩種擴(kuò)增產(chǎn)物混合后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增單元；
[0033] (4)高通量測序單元；
[0034] (5)免疫組庫精準(zhǔn)信息分析單元。
[0035] 所述單元（2)中BCRH鏈全長多重PCR擴(kuò)增采用的上游引物共22條，序列分別如 SEQIDNO. 1-22所示，下游引物共6條，序列分別如SEQIDNO. 23-28所示；
[0036]TCR鏈⑶R3多重PCR擴(kuò)增采用的上游引物共45條，序列分別如SEQID NO. 29-73所示，下游引物共4條，序列分別如SEQIDNO. 74-77所示。
[0037] 單元（3)中是將單元（2)的兩種擴(kuò)增產(chǎn)物等體積混合后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增；所 采用的引物序列如SEQIDNO. 78-79所示。
[0038] 單元（5)的免疫組庫精準(zhǔn)信息分析包括以下步驟：
[0039] 1)基于已知接頭序列確定7個(gè)隨機(jī)堿基N的位置，7個(gè)隨機(jī)堿基可以形成47種唯 一標(biāo)簽，將成對(duì)測序序列的測序序列1和測序序列2的唯一標(biāo)簽序列首尾相連，形成14bp 的一條索引，并且以這14bp作為的成對(duì)測序序列索引進(jìn)行外部排序，以達(dá)到將來源于同一