[0069]TCR擴(kuò)增上下游引物設(shè)計(jì)：人TCRP鏈V基因家族包含45個(gè)功能性基因家族和7 個(gè)0RF，根據(jù)52個(gè)基因的同源性總共設(shè)計(jì)45條上游引物（見表2的T-PCRl上游引物，或如 SEQIDNO. 29-73所示）；而人TCRI3鏈的C基因高度同源，因此設(shè)計(jì)4條不同的通用下游 引物（見表2的T-PCRl下游引物，或如SEQIDNO. 74-77所示），隨機(jī)與46條上游引物配 對(duì)，以避免由于血漿片段隨機(jī)斷裂原因?qū)е聰U(kuò)增失敗，提高片段擴(kuò)增的成功率。
[0070] 表IBCR-PCRl引物體系
[0071]



[0077] BCR/TCR-PCR2的引物結(jié)構(gòu)：PCR2上下游引物的基礎(chǔ)引物序列分別與PCRl的產(chǎn)物 兩端的接頭序列互補(bǔ)，同時(shí)其上游引物只包含測序序列，而下游引物則包含測序序列以及 測序標(biāo)簽一一8個(gè)已知固定堿基（index)，以用于進(jìn)行混合測序樣品間的區(qū)分。詳情見表3。
[0078] 表 3BCR/TCR-PCR2 引物體系
[0079]
[0080] 實(shí)施例2檢測血漿cfDNA中BCR和TCR免疫組庫方法的建立
[0081] 1、血漿cfDNA提取：
[0082]Ll提取血漿抽取受檢者外周血2管（5mL/管）于EDTA抗凝管中，輕柔上下顛 倒（防止細(xì)胞破裂），6-8次充分混勻，在采血當(dāng)天4-6小時(shí)內(nèi)進(jìn)行以下處理；在4°C條件下 1600g離心10分鐘，離心后將上清（血漿）分裝到多個(gè)I. 5mL/2mL離心管中，在吸取過程中 不能吸到中間層白細(xì)胞；在4°C條件下16000g離心10分鐘，去除殘余細(xì)胞，將上清（血漿） 轉(zhuǎn)移到新的I. 5mL/2mL離心管中，不能吸到管底白細(xì)胞，即得到分離后所需血漿。
[0083]I. 2血漿樣本處理完后，分離得到的血漿及剩余血細(xì)胞均保存到_80°C冰箱中，避 免反復(fù)凍融。
[0084] 1. 3血漿cfDNA/ctDNA的提取與定量：取分離出的血漿約2-3ml，按照QIAamp CirculatingNucleicAcidKit(Qiagen)提取試劑說明書，進(jìn)行血衆(zhòng)cfDNA的提取。 Qubit(Invitrogen，theQuant-iTTMdsDNAHSAssayKit)定量所提取的DNA，總量約為 30 ~50ng。
[0085] 2、分別進(jìn)行BCR/TCR多重PCRl擴(kuò)增
[0086] 2. 1分別將實(shí)施例1中的表1和表2中的上下游引物進(jìn)行混合，形成BCR和TCR上 下游引物MIX，且下游單個(gè)引物濃度為上游單個(gè)引物濃度的20倍。
[0087] 2. 2BCRH鏈全長多重PCRl反應(yīng)擴(kuò)增，基于QIAGEN公司MultiplexPCR試劑盒進(jìn) 行操作：
[0088]
[0089] 上述PCR反應(yīng)體系中，B-PCRl上游引物序列分別如SEQIDNO. 1-22所示，B-PCRl 下游引物序列分別如SEQIDNO. 23-28所示，其中B-PCRl上、下游引物Mix中各條引物為 等體積等濃度混合。
[0090]BCRH鏈全長多重PCR擴(kuò)增條件為：98°C預(yù)變性45s;98°C變性15s，60°C退火30s， 72°C延伸30s，共8個(gè)循環(huán)；72°C終延伸60s;4°C保持。
[0091] 2. 3TCRP鏈0?3區(qū)多重PCRl反應(yīng)擴(kuò)增，基于QIAGEN公司MultiplexPCR試劑盒 進(jìn)行操作：
[0092]
[0093] 上述PCR反應(yīng)體系中，TCRCDR3PCRl上游引物序列分別如SEQIDNO. 29-74所 示，TCRCDR3PCRl下游引物序列分別如SEQIDNO. 75-78所示，其中上、下游引物Mix中 各條引物為等體積等濃度混合。
[0094]TCRP鏈0?3多重PCR擴(kuò)增條件為：98°C預(yù)變性45s;98°C變性15s，54°C退火 30s，72°C延伸30s，共8個(gè)循環(huán)；72°C終延伸60s;4°C保持。
[0095] 2. 4使用TBE-PAGE膠電泳上述擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物，分別獲取片段大小在300bp 或190bp左右的片段，按照QIAquickGelExtractionKit(Qiagen)試劑說明書進(jìn)行產(chǎn)量 回收，獲取BCR/TCRPCRl的擴(kuò)增產(chǎn)物，之后采用Qubit(Invitrogen，theQuant-iTdsDNA BRAssayKit)進(jìn)行定量。
[0096] 3、擴(kuò)增產(chǎn)物等比例混合進(jìn)行PCR2擴(kuò)增：針對(duì)同一樣品，等比例各取50ngBCR和 TCR的PCRl純化產(chǎn)物，進(jìn)行PCR2擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：
[0097]
[0098]PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8°C預(yù)變性45s;98°C變性15s，65°C退火30s，72°C延伸30s，共 15個(gè)循環(huán)；72°C終延伸60s;4°C保持。
[0099]PCR2上、下游引物序列分別如SEQIDNO. 79、80所示。
[0100] 4、上機(jī)測序：采用IlluminaHiSeq2500PE101+8+101程序進(jìn)行上機(jī)測序，測序?qū)?驗(yàn)按照制造商提供的操作說明書（參見Illumina/Solexa官方公布cBot)進(jìn)行上機(jī)測序操 作。
[0101] 5、免疫組庫精準(zhǔn)信息分析：
[0102] 1)基于已知接頭序列確定7個(gè)隨機(jī)堿基N的位置，7個(gè)隨機(jī)堿基可以形成47種唯 一標(biāo)簽，將成對(duì)測序序列的測序序列1和測序序列2的唯一標(biāo)簽序列首尾相連，形成14bp 的一條索引，并且以這14bp作為的成對(duì)測序序列索引進(jìn)行外部排序，以達(dá)到將來源于同一 個(gè)DNA模板的所有測序序列聚集到一起的目的；
[0103] 2)對(duì)聚集起來的擁有相同索引的測序序列進(jìn)行中心聚類，根據(jù)插入序列之間的漢 明距離，將每個(gè)有相同索引的大簇聚集成若干個(gè)小簇，每個(gè)小簇中任意兩對(duì)成對(duì)測序序列 的漢明距離不超過3,以達(dá)到區(qū)分開擁有相同索引卻來自不同DNA模板的測序序列的目的；
[0104] 3)對(duì)于每個(gè)DNA模板擴(kuò)增形成的系列重復(fù)片段中的測序序列的每一個(gè)測序堿基 進(jìn)行互相比對(duì)，若某種堿基型在測序序列中的一致率達(dá)到80 %，則記新測序序列的這個(gè)堿 基為此堿基型，否則記為N，這樣便得到了代表原始DNA模板序列的新測序序列，通過這種 方法矯正，可以有效去除測序和PCR中隨機(jī)引入的錯(cuò)誤，提尚檢測的準(zhǔn)確性；
[0105] 4)對(duì)新測序序列進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，去除接頭序列以及比對(duì)質(zhì)量小于30的測序序列；
[0106] 5)根據(jù)4)中得到的測序序列與頂GT數(shù)據(jù)庫中V、D和J區(qū)基因片段的胚系參考 序列進(jìn)行比對(duì)注釋，同時(shí)根據(jù)唯一標(biāo)簽對(duì)每個(gè)模板的唯一標(biāo)記，對(duì)各免疫亞克隆進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 定量；
[0107] 6)根據(jù)5)的結(jié)果進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)分析，免疫組庫表達(dá)譜分析、Biomarker分析。
[0108] 9.測序結(jié)果分析
[0109] 通過1例肺腺癌術(shù)后患者的血漿樣品，基于以上方法步驟進(jìn)行檢測：
[0110] 9. 1患者TCR免疫多態(tài)性：見圖2。結(jié)果說明，患者T淋巴細(xì)胞各V、J基因亞型分 布較均一，最高克隆占比〇. 60% -一T淋巴細(xì)胞組庫多樣性良好。
[0111] 9. 2患者BCR聚類分析結(jié)果（Lineage分析）：見圖3。結(jié)果說明，Lineage基本呈 散在分布，預(yù)示B細(xì)胞組庫多樣性良好。
[0112] 綜合性分析顯示：患者術(shù)后總體免疫狀態(tài)良好。
[0113] 以上的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn) 行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方 案做出的各種變型和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測血漿cfDNA中BCR和TCR免疫組庫的方法，包括以下步驟： (1) 血漿cfDNA提取； (2) BCR H鏈全長多重PCR擴(kuò)增和TCR P鏈⑶R3多重PCR擴(kuò)增； (3) 步驟（2)中兩種擴(kuò)增產(chǎn)物混合后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增； (4) 高通量測序； (5) 免疫組庫精