本發(fā)明涉及一種提高玉米單倍體雄穗育性恢復(fù)能力的方法及其專用引物，屬于分子遺傳學(xué)育種領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

玉米是我國(guó)第一大糧食作物(張春雷，2012)，不但可以作為食用、飼用和工業(yè)等的重要來(lái)源，而且具有適應(yīng)性廣和高產(chǎn)的特征。隨著氣候環(huán)境的變化和人口的不斷增長(zhǎng)，為了滿足對(duì)糧食的需求，加快育種流程是必經(jīng)之路。

與連續(xù)自交5-7代得到純合自交系的常規(guī)育種方法相比，單倍體育種只需要誘導(dǎo)和加倍兩代便可產(chǎn)生純系，能顯著縮短育種年限，加快育種流程，提高育種效率。玉米單倍體育種主要包括單倍體誘導(dǎo)、單倍體鑒別和單倍體加倍三個(gè)步驟。隨著新型誘導(dǎo)系的選育，鑒別效率的不斷提高，單倍體加倍成為玉米單倍體育種的主要限制因素。

單倍體的染色體加倍方法主要有兩種：化學(xué)加倍和自然加倍。化學(xué)加倍是指利用一些化學(xué)試劑誘導(dǎo)單倍體染色體加倍。最常用的化學(xué)加倍方法是秋水仙素芽苗浸泡法。盡管利用秋水仙素進(jìn)行人工加倍能夠大規(guī)模的產(chǎn)生DH系(Gayen et al.,1994；Barnabás et al.,1999)，但是這種化學(xué)試劑昂貴，毒性大，使用過(guò)程中需要發(fā)苗、移苗，操作繁瑣，因此其利用具有一定局限性。自然加倍是指在自然環(huán)境條件下單倍體染色體發(fā)生自發(fā)的加倍(Jensen,1974)。目前，許多物種中都發(fā)現(xiàn)了一定比例的單倍體自然加倍。例如，油菜自然加倍率為10-40％(Henry,1998)，玉米的自然加倍效率為0-21.4％(Barnabas et al.,1999)。玉米單倍體自然加倍受環(huán)境和基因型的影響。Kleiber(2012)對(duì)溫帶玉米種質(zhì)和熱帶玉米種質(zhì)的單倍體自然加倍率進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫帶骨干種質(zhì)的單倍體自然加倍效率大于溫帶地方品種的單倍體自然加倍效率，早熟種質(zhì)來(lái)源的單倍體自然加倍效率要高于晚熟品種，溫室條件下單倍體自然加倍效率大于大田條件下單倍體自然加倍效率。玉米單倍體自然加倍又可以分為單倍體雄穗育性恢復(fù)和雌穗育性恢復(fù)。用來(lái)源于正常二倍體植株的花粉給單倍體雌穗授粉，單倍體雌穗育性恢復(fù)率能達(dá)到90％以上。而單倍體雄穗育性恢復(fù)率只有5-10％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于單倍體雌穗育性恢復(fù)，因此，單倍體雄穗育性恢復(fù)情況是影響單倍體自然加倍的主要因素。

分子標(biāo)記輔助技術(shù)可以利用分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)性狀直接進(jìn)行選擇，提高育種效率，尤其是對(duì)復(fù)雜性狀的選育，如抗病性和單倍體誘導(dǎo)率。分子標(biāo)記輔助選擇的基礎(chǔ)是對(duì)性狀的QTL定位及其過(guò)程中連鎖標(biāo)記的開(kāi)發(fā)。例如，董昕等對(duì)單倍體誘導(dǎo)率相關(guān)QTL進(jìn)行定位，并對(duì)第一條染色體位點(diǎn)qhir1進(jìn)行精細(xì)定位，開(kāi)發(fā)相關(guān)的分子標(biāo)記進(jìn)行誘導(dǎo)系的選育。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)玉米單倍體雄穗育性恢復(fù)性狀的引物對(duì)。

本發(fā)明提供的用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)玉米單倍體雄穗育性恢復(fù)性狀的引物對(duì)由序列1所示的單鏈DNA分子和序列2所示的單鏈DNA分子組成。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)玉米單倍體雄穗育性恢復(fù)性狀的PCR試劑。

本發(fā)明提供的用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)玉米單倍體雄穗育性恢復(fù)性狀的PCR試劑包括上述引物對(duì)。

上述PCR試劑中，所述引物對(duì)中的各條引物在所述PCR試劑中的終濃度均為5ng/ul。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)玉米單倍體雄穗育性恢復(fù)性狀的試劑盒。

本發(fā)明提供的用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)玉米單倍體雄穗育性恢復(fù)性狀的試劑盒包括上述引物對(duì)或上述PCR試劑。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述引物對(duì)或上述PCR試劑或上述試劑盒的新用途。

本發(fā)明提供了上述引物對(duì)或上述PCR試劑或上述試劑盒在如下(1)-(5)中任一種中的應(yīng)用：

(1)鑒定或輔助鑒定待測(cè)玉米單倍體雄穗育性恢復(fù)性狀；

(2)制備鑒定或輔助鑒定待測(cè)玉米單倍體雄穗育性恢復(fù)性狀的產(chǎn)品；

(3)選育單倍體雄穗育性恢復(fù)能力高的玉米單倍體；

(4)制備選育單倍體雄穗育性恢復(fù)能力高的玉米單倍體的產(chǎn)品；

(5)玉米育種。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)玉米單倍體雄穗育性恢復(fù)性狀的方法。

本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測(cè)玉米單倍體雄穗育性恢復(fù)性狀的方法包括如下步驟：用上述引物對(duì)對(duì)待測(cè)玉米基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確定待測(cè)玉米單倍體雄穗育性恢復(fù)性狀：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中僅含有大小為265bp片段的待測(cè)玉米單株的單倍體雄穗育性恢復(fù)能力高于或候選高于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中僅含有大小為226bp片段的待測(cè)玉米單株的單倍體雄穗育性恢復(fù)能力。

上述方法中，所述待測(cè)玉米單株為由一個(gè)單倍體雄穗育性恢復(fù)能力高和一個(gè)單倍體雄穗育性恢復(fù)能力低的親本雜交，得到雜交子代，將所述雜交子代與所述單倍體雄穗育性恢復(fù)能力低的親本回交，得到回交后代，再以單倍體誘導(dǎo)系為父本，對(duì)所述回交后代進(jìn)行誘導(dǎo)獲得的單倍體。

上述方法中，所述單倍體雄穗育性恢復(fù)能力體現(xiàn)在花藥外露率和/或花藥得分。上述方法中，所述花藥外露率是指單倍體的花藥外露的比例，根據(jù)單倍體花藥外露的比例從低到高，將花藥外露率劃分為如下0‐5六個(gè)等級(jí)：0級(jí)為不散；1級(jí)為5％以下的花藥外露；2級(jí)為6‐20％的花藥外露；3級(jí)為21‐50％的花藥外露；4級(jí)為51‐75％的花藥外露；5級(jí)為75％以上的花藥外露。

所述花藥得分取決于花藥外露率的級(jí)別，花藥外露率的級(jí)別為0級(jí)對(duì)應(yīng)的花藥得分為0分，花藥外露率的級(jí)別為1級(jí)對(duì)應(yīng)的花藥得分為0.2分，花藥外露率的級(jí)別為2級(jí)對(duì)應(yīng)的花藥得分為0.4分，花藥外露率的級(jí)別為3級(jí)對(duì)應(yīng)的花藥得分為0.6分，花藥外露率的級(jí)別為4級(jí)對(duì)應(yīng)的花藥得分為0.8分，花藥外露率的級(jí)別為5級(jí)對(duì)應(yīng)的花藥得分為1分。

上述方法中，

所述回交的次數(shù)為2次。

上述方法中，

所述單倍體雄穗育性恢復(fù)能力高的親本為豫87-1和4F1；

所述單倍體雄穗育性恢復(fù)能力低的親本為鄭58；

所述單倍體誘導(dǎo)系為誘導(dǎo)系CAU5。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種選育單倍體雄穗育性恢復(fù)能力高的玉米單倍體的方法。

本發(fā)明提供的選育單倍體雄穗育性恢復(fù)能力高的玉米單倍體包括如下步驟：培育上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中僅含有大小為265bp片段的玉米單倍體。

本發(fā)明提供了一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)玉米單倍體雄穗育性恢復(fù)性狀的方法及其專用引物，本發(fā)明通過(guò)對(duì)單倍體雄穗育性恢復(fù)相關(guān)QTL的定位，開(kāi)發(fā)相關(guān)的連鎖標(biāo)記，利用該標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定待測(cè)玉米單倍體雄穗育性恢復(fù)性狀的方法能直接在苗期鑒定出含有位于6號(hào)染色體主效QTL位點(diǎn)qhmf4的單株，選擇出含有該QTL位點(diǎn)的單株，有助于提高玉米單倍體雄穗育性恢復(fù)率，促進(jìn)玉米DH育種的利用。

附圖說(shuō)明

圖1為豫87-1、4F1和鄭58的瓊脂糖電泳圖。其中，1、2為豫87-1單株；3、4為4F1單株；5、6為鄭58單株。

圖2為F₁單倍體群體的瓊脂糖電泳圖。其中，1-10為(鄭58/豫87-1)單倍體單株；11為鄭58單倍體單株；12為豫87-1單倍體單株。

圖3為BC₂群體單株的瓊脂糖電泳圖。其中，1-10為鄭58回交鄭58/豫87-1兩代的BC₂群體，11為鄭58單株，12為豫87-1單株。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的單倍體雄穗育性恢復(fù)率高的材料豫87-1，在文獻(xiàn)“劉宗華,湯繼華,陳偉程.(2002).玉米高配合力自交系豫自87-1的選育研究.作物雜志,5,48-49”中公開(kāi)過(guò)，其單倍體花藥外露率為89.21％，花藥平均得分是0.84。公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

下述實(shí)施例中的單倍體雄穗育性恢復(fù)率高的材料4F1，在文獻(xiàn)“魯寶良,趙文媛,劉日尊,關(guān)國(guó)志.(2004).Mo17衍生系組配雜交種對(duì)我國(guó)玉米生產(chǎn)的影響和貢獻(xiàn).玉米科學(xué),12(1)”中公開(kāi)過(guò)，其單倍體花藥外露率為91.00％，花藥平均得分是0.74。公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

下述實(shí)施例中的單倍體雄穗育性恢復(fù)率低的材料鄭58，在文獻(xiàn)“王彥玲,衛(wèi)文星,鐵雙貴,王延召,朱衛(wèi)紅,岳潤(rùn)清,齊建雙.(2010).鄭58和掖478玉米自交系基因組差異性分析.玉米科學(xué),18(3),57-60”中公開(kāi)過(guò)，其單倍體花藥外露率為17.94％，花藥平均得分是0.04。公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

下述實(shí)施例中的高頻單倍體誘導(dǎo)系CAU5，其平均誘導(dǎo)率為10％，具有R1-nj標(biāo)記，在文獻(xiàn)“陳紹江，黎亮，李浩川.玉米單倍體育種技術(shù)[M].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2009.”中公開(kāi)，公眾可以從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

下述實(shí)施例中的Tris飽和酚、氯仿、酒精、異丙醇和瓊脂糖均是北京吉普騰生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的Buffer、dNTP和Taq E均是全式金有限公司的產(chǎn)品。

實(shí)施例1、分子標(biāo)記的獲得

一、玉米單倍體雄穗育性恢復(fù)QTL的定位

利用兩個(gè)F₁來(lái)源的玉米單倍體群體對(duì)單倍體雄穗育性恢復(fù)這一性狀進(jìn)行全基因組掃描，共檢測(cè)到了4個(gè)控制單倍體雄穗育性恢復(fù)的QTL位點(diǎn)，其中位于第6染色體的QTL命名為qhmf4，該QTL是效應(yīng)最大的QTL。

二、分子標(biāo)記的獲得

1、F₁單倍體群體和BC₂回交群體的發(fā)展

(1)以鄭58為母本，豫87-1為父本(鄭58/豫87-1)，同期播種于北京上莊實(shí)驗(yàn)站，散粉期將兩個(gè)材料分別互相授粉，獲得F₁種子。同年冬天，將F₁種子種于海南南繁公司基地，以誘導(dǎo)系CAU5為父本，對(duì)F₁進(jìn)行誘導(dǎo)，根據(jù)R1-nj顏色基因的表達(dá)挑選單倍體，胚乳為紫色但胚無(wú)紫色的籽粒為單倍體籽粒，獲得F₁單倍體群體(鄭58/豫87-1)。并用鄭58對(duì)F1進(jìn)行回交，回交兩次，獲得BC₂群體。

(2)以鄭58為母本，4F1為父本(鄭58/4F1)，同期播種于北京上莊實(shí)驗(yàn)站，散粉期將兩個(gè)材料分別互相授粉獲得F₁種子。同年冬天，將F₁種子種于海南南繁公司基地，以誘導(dǎo)系CAU5為父本，對(duì)F₁進(jìn)行誘導(dǎo)，根據(jù)R1-nj顏色基因的表達(dá)挑選單倍體，胚乳為紫色但胚無(wú)紫色的籽粒為單倍體籽粒，獲得F₁單倍體群體(鄭58/4F1)。

2、分子標(biāo)記的獲得

根據(jù)QTL定位結(jié)果，下載該定位區(qū)間內(nèi)B73參考序列，選取單拷貝序列，利用Primer3.0在線設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過(guò)多態(tài)性篩選及及連鎖群驗(yàn)證后，選擇一對(duì)差異性大、帶型清晰的多態(tài)性引物(分子標(biāo)記)F/R，將其命名為6-3。引物序列如下：

F:5’-TACAATCTGAAGCCCGTACAAAAT-3’(序列1)；

R:5’-GTTCCTGCTGCCTCGCTTCT-3’(序列2)。

F₁單倍體分離群體群帶型表明：該分子標(biāo)記位于定位區(qū)間內(nèi)，可以用于該位點(diǎn)的基因型檢測(cè)。

3、分子標(biāo)記檢測(cè)親本基因型

分別以豫87-1、鄭58和4F1的基因組DNA為模板，采用引物6-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。

電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。檢測(cè)結(jié)果表明：引物6-3在單倍體雄穗育性恢復(fù)率高的親本豫87-1和4F1中均僅擴(kuò)增得到大小為265bp的條帶(該位點(diǎn)來(lái)源于高親豫87-1或者4F1)；而在單倍體雄穗育性恢復(fù)率低的親本中僅擴(kuò)增得到大小為226bp的條帶(該位點(diǎn)來(lái)源于低親鄭58)。

三、分子標(biāo)記在F₁單倍體群體中的鑒定及驗(yàn)證

1、表型鑒定

2012年北京，在上莊試驗(yàn)站分別種植1000株以上鄭58/豫87-1單倍體群體和1000株以上鄭58/4F1單倍體群體。在單倍體散粉期，根據(jù)單倍體雄穗花藥外露的比例分別鑒定鄭58/豫87-1單倍體群體和鄭58/4F1單倍體群體的單株的花藥外露率的級(jí)別，并根據(jù)花藥外露率的級(jí)別得出花藥得分。鑒定方法如下：根據(jù)單倍體花藥外露的比例從低到高，將花藥外露率劃分為如下0-5六個(gè)等級(jí)：0級(jí)為不散；1級(jí)為5％以下的花藥外露；2級(jí)為6-20％的花藥外露；3級(jí)為21-50％的花藥外露；4級(jí)為51-75％的花藥外露；5級(jí)為75％以上的花藥外露。

最終在兩個(gè)F1單倍體群體中，分別選取94株經(jīng)鑒定散粉4-5級(jí)的單倍體和94株經(jīng)鑒定不育(0級(jí))的單倍體進(jìn)行基因型鑒定。

2、基因型鑒定

(1)DNA提取

在苗期分別對(duì)94株經(jīng)鑒定散粉4‐5級(jí)的單倍體和94株經(jīng)鑒定不育(0級(jí))的單倍體進(jìn)行采樣，剪取幼嫩葉片2cm，低溫冷藏。采用改良的CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)方法(Stewart et al.1993)提取玉米基因組DNA。

(2)PCR擴(kuò)增

以步驟(1)獲得的基因組DNA為模板，采用引物6-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

配好體系后加入20ul石蠟油，進(jìn)行PCR反應(yīng)，分別得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸45秒，循環(huán)37次；72℃延伸10分鐘，4℃保存。

(3)電泳

配制3％的瓊脂糖凝膠，分別對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并測(cè)序驗(yàn)證，電壓160V，電泳時(shí)間18min。

電泳結(jié)果如2所示。根據(jù)帶型可以將F₁單倍體群體分成兩種基因型：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅含有大小為265bp的片段(該位點(diǎn)來(lái)源于高親豫87-1或者4F1)的單株的基因型為有qhmf4型，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅含有大小為265bp的片段的單株命名為有qhmf4型自然恢復(fù)單株；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅含有大小為226bp的片段(該位點(diǎn)來(lái)源于低親鄭58)的單株的基因型為無(wú)qhmf4型，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅含有大小為226bp的片段的單株命名為無(wú)qhmf4型自然恢復(fù)單株。

在F₁單倍體群體(鄭58/豫87-1)中，散粉4-5級(jí)群體和不散粉群體中有qhmf4型自然恢復(fù)單株和無(wú)qhmf4型自然恢復(fù)單株的比率如表1所示。從表1中可以看出：在散粉4-5級(jí)群體中，有qhmf4型自然恢復(fù)單株出現(xiàn)的概率顯著大于無(wú)qhmf4型自然恢復(fù)單株出現(xiàn)的概率；在不散粉群體中，有qhmf4型自然恢復(fù)單株出現(xiàn)的概率與無(wú)qhmf4型自然恢復(fù)單株出現(xiàn)的概率沒(méi)有顯著差異。在F₁單倍體群體(鄭58/4F1)中得到了同樣的結(jié)果。以上結(jié)果說(shuō)明該分子標(biāo)記可以用于單倍體雄穗育性恢復(fù)的選擇。

表1、F₁單倍體群體中兩種基因型的平均出現(xiàn)概率

注：不同的字母代表在0.05水平差異顯著，相同的字母代表在0.05水平差異不顯著。

實(shí)施例2、分子標(biāo)記在BC_2:3家系單倍體群體中的驗(yàn)證

一、BC_2:3家系單株的獲得

1、分別以實(shí)施例1中獲得的BC₂回交群體單株的基因組DNA為模板，采用引物6-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物。各個(gè)單株的PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3所示：根據(jù)帶型將所有BC₂單株分為如下兩種基因型：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅含有大小為226bp的片段的單株(該位點(diǎn)來(lái)源于低親鄭58)，候選為無(wú)qhmf4型自然恢復(fù)單株；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為265bp和226bp的片段的單株(該位點(diǎn)為雜合位點(diǎn))，候選為雜合基因型自然恢復(fù)單株。

2、將BC₂群體中的雜合基因型自然恢復(fù)單株與鄭58進(jìn)行回交，獲得BC_2:3家系。以誘導(dǎo)系CAU5作為父本，對(duì)BC_2:3家系進(jìn)行誘導(dǎo)，根據(jù)R1-nj顏色基因的表達(dá)挑選單倍體，胚乳為紫色但胚無(wú)紫色的籽粒為單倍體籽粒，分別獲得如下BC_2:3家系單倍體群體：BC_2:3家系單倍體群體-1、BC_2:3家系單倍體群體-2和BC_2:3家系單倍體群體-3。

二、基因型鑒定

1、DNA提取

在苗期對(duì)BC_2:3家系單倍體群體單株分別進(jìn)行采樣，剪取幼嫩葉片2cm，低溫冷藏。采用改良的CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)方法(Stewart et al.1993)提取玉米基因組DNA。

2、PCR擴(kuò)增

以步驟1獲得的基因組DNA為模板，采用引物6-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增體系和程序同實(shí)施例1中的步驟三。

3、電泳

配制3％的瓊脂糖凝膠，對(duì)步驟2獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳并測(cè)序驗(yàn)證，電壓160V，電泳時(shí)間18min。

電泳結(jié)果表明：BC_2:3家系單倍體群體單株共有如下兩種基因型：有qhmf4型自然恢復(fù)單株和無(wú)qhmf4型自然恢復(fù)單株。其中，有qhmf4型自然恢復(fù)單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅含有大小為265bp的片段；無(wú)qhmf4型自然恢復(fù)單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅含有大小為226bp的片段。

三、表型鑒定

分別將上述BC_2:3家系單倍體群體-1、BC_2:3家系單倍體群體-2和BC_2:3家系單倍體群體-3進(jìn)行種植，兩個(gè)重復(fù)，散粉期進(jìn)行觀察，并按照實(shí)施例1中的方法記錄單倍體的花藥外露級(jí)別。然后根據(jù)花藥外露級(jí)別，按照如下方法得出每一家系內(nèi)各單株的花藥得分：花藥外露率的級(jí)別為0級(jí)對(duì)應(yīng)的花藥得分為0分，花藥外露率的級(jí)別為1級(jí)對(duì)應(yīng)的花藥得分為0.2分，花藥外露率的級(jí)別為2級(jí)對(duì)應(yīng)的花藥得分為0.4分，花藥外露率的級(jí)別為3級(jí)對(duì)應(yīng)的花藥得分為0.6分，花藥外露率的級(jí)別為4級(jí)對(duì)應(yīng)的花藥得分為0.8分，花藥外露率的級(jí)別為5級(jí)對(duì)應(yīng)的花藥得分為1分。最后計(jì)算每一家系的花藥平均得分。

不同家系內(nèi)不同基因型單倍體花藥平均得分如表2所示：同一家系內(nèi)有qhmf4型單倍體和無(wú)qhmf4型單倍體的雄穗花藥外露平均得分存在顯著差異，有qhmf4型的單倍體花藥平均得分高于無(wú)qhmf4型的單倍體花藥平均得分?；蛐丸b定結(jié)果與表型鑒定結(jié)果一致，說(shuō)明該分子標(biāo)記可以用于單倍體雄穗育性恢復(fù)的選擇。

表2、不同基因型對(duì)應(yīng)單倍體群體的花藥平均得分

注：同一BC_2:3家系內(nèi)，不同的字母代表在0.05水平差異顯著，相同的字母代表在0.05水平差異不顯著。