本發(fā)明涉及分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及一種miRNAs心衰標(biāo)志物及其應(yīng)用和心衰初篩檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：：微小RNA(microRNA或miRNAs)的發(fā)現(xiàn)及對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能的認(rèn)識(shí)為研究表觀遺傳學(xué)與疾病的關(guān)系開辟了新的研究領(lǐng)域。它是一類在進(jìn)化上非常保守的、分子長(zhǎng)度約19-25個(gè)核苷酸序列的非蛋白編碼的基因家族產(chǎn)物。至今，miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布來(lái)自58個(gè)不同物種的總數(shù)近9000個(gè)成熟miRNAs，其中人類基因組中確認(rèn)的miRNAs數(shù)目已達(dá)800多個(gè)，這些miRNAs調(diào)控著30％的人類基因及信號(hào)通路。miRNAs可通過(guò)與靶基因mRNA分子3’末端非翻譯區(qū)域(UntranslatedRegionsUTR)特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平沉默特定靶基因，抑制其翻譯。miRNAs參與生命過(guò)程中，包括早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡、脂肪代謝、甚至干細(xì)胞分化等一系列重要進(jìn)程。越來(lái)越多的研究證實(shí)miRNAs在調(diào)控各種疾病的發(fā)生、發(fā)展及藥物治療方面起到關(guān)鍵的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)miRNAs參與心臟的病理重構(gòu)整個(gè)過(guò)程，它通過(guò)調(diào)節(jié)參與適應(yīng)性和適應(yīng)不良性的心室重塑的基因表達(dá)而調(diào)節(jié)心臟重構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。2008年首次提取并檢測(cè)出體液中miRNAs，并被后來(lái)的研究所證實(shí)。近年來(lái)科學(xué)家們?cè)絹?lái)越關(guān)注循環(huán)miRNAs的研究，致力于將其用于臨床疾病的無(wú)創(chuàng)診斷預(yù)警。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)作為穩(wěn)定的以血漿為基礎(chǔ)的生物標(biāo)記物對(duì)心血管疾病的早期診斷及治療具有重要的臨床意義。循環(huán)血miRNAs已作為生物標(biāo)志物用于診斷心力衰竭和判斷預(yù)后的研究。一種理想的生物標(biāo)記物應(yīng)滿足：獲得容易如血漿和非創(chuàng)傷性；高度特異性和敏感性；能區(qū)分不同的病變；疾病早期出現(xiàn)；對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸變化敏感；在標(biāo)本內(nèi)穩(wěn)定且半衰期較長(zhǎng)；能被簡(jiǎn)單、快速、精確檢測(cè)且相對(duì)廉價(jià)等。循環(huán)中的miRNAs基本能夠滿足上述要求，例如它們?cè)谘褐蟹€(wěn)定存在；序列高度進(jìn)化穩(wěn)定性；表達(dá)具有組織或疾病特異性；檢測(cè)方法高度特異和敏感性。檢測(cè)循環(huán)miRNAs作為生物標(biāo)志物的方法包括實(shí)時(shí)定量PCR、miRNAs芯片法和測(cè)序法。一般做法是提取待查樣本全RNA，用miRNAs芯片或測(cè)序法篩查miRNAs，并與對(duì)照組(正常)比較，將明顯增高或降低超過(guò)1.5或2.0倍且統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異的miRNAs作為備選標(biāo)志物并進(jìn)行適時(shí)定量PCR驗(yàn)證。心力衰竭(HF)是一種復(fù)雜的病理生理綜合征，是大多數(shù)心血管疾病的最終歸宿。各種病理信號(hào)刺激心臟出現(xiàn)重構(gòu)、心肌細(xì)胞凋亡、能量代謝障礙等，導(dǎo)致心肌收縮力下降、心臟擴(kuò)大，最終出現(xiàn)HF。近些年，在全球范圍內(nèi)，HF的患病率和死亡率居高不下，患者5年死亡率高達(dá)50％，同時(shí)伴有生活質(zhì)量的低下及高達(dá)15％的年住院率。對(duì)HF發(fā)病機(jī)制的研究經(jīng)歷了血液動(dòng)力學(xué)紊亂、神經(jīng)內(nèi)分泌激活、分子生物學(xué)調(diào)節(jié)等理論，目前更深入到基因水平。在心衰發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有幾種生物標(biāo)記物與之相關(guān)，其中最為重要的是腦鈉肽(natriureticpeptides，BNP)尤其是B-BNP和NT-proBNP，對(duì)與心衰具有較高的臨床診斷價(jià)值，但在某些疾病如腎功能不全、源發(fā)性醛固酮增多癥以及某些甲狀腺疾病是這些標(biāo)志物也會(huì)增高；此外，在不同病因所致的心衰時(shí)其增高的反應(yīng)性和程度不同，因此，其對(duì)心衰診斷的特異性和敏感性受到質(zhì)疑，需要發(fā)現(xiàn)一種新的、更可靠的、更特異性的和更靈敏的預(yù)測(cè)心衰發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志物并應(yīng)用于臨床心衰早期診斷。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種更可靠的、更特異性的和更靈敏的miRNAs心衰標(biāo)志物和基于miRNAs心衰標(biāo)志物的心衰初篩檢測(cè)試劑盒。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：提供一種miRNAs心衰標(biāo)志物，包括：hsa-miR-210，hsa-miR-2110，hsa-miR-21-3p，hsa-miR-320a，hsa-miR-423-5p，hsa-miR-483-5p，hsa-miR-17-3p，hsa-miR-22-3p，hsa-miR-195-3p，hsa-miR-16-2-3p和hsa-miR-339-5p。本發(fā)明的另一技術(shù)方案為提供一種上述的miRNAs心衰標(biāo)志物在制備心衰初篩檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的又一技術(shù)方案為提供一種基于miRNAs心衰標(biāo)志物的心衰初篩檢測(cè)試劑盒，所述miRNAs的心衰標(biāo)志物為權(quán)利要求1所述的miRNAs心衰標(biāo)志物，所述心衰初篩檢測(cè)試劑盒包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)體系，所述PCR反應(yīng)體系包括針對(duì)權(quán)利要求1所述的miRNAs心衰標(biāo)志物的特異性引物和通用引物，所述特異性引物序列如SEQIDNO：1-11。本發(fā)明有益效果是：本發(fā)明提供的miRNAs心衰標(biāo)志物和基于miRNAs心衰標(biāo)志物的心衰初篩檢測(cè)試劑盒，通過(guò)檢測(cè)循環(huán)血差異表達(dá)的miRNAs可將不同病因的心衰與正常對(duì)照組區(qū)分開。具有快速、敏感和特異等特點(diǎn)，為臨床救治和疾病控制提供一種新的檢測(cè)方法和重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體實(shí)施方式為詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式詳予說(shuō)明。本發(fā)明最關(guān)鍵構(gòu)思：采集靜脈血提取血漿并提取全RNA，采用二代測(cè)序法建立miRNAs文庫(kù)和心衰患者循環(huán)血miRNAs表達(dá)譜；將不同病因心衰循環(huán)血miRNAs表達(dá)變化與正常對(duì)照組比較增高1.5倍以上且統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P＜0.05)作為備選心衰診斷標(biāo)志物；比較不同病因心衰備選診斷標(biāo)志物并篩選出共同增高的miRNAs制備miRNA芯片(心衰初篩診斷試劑盒)。實(shí)施例1一種基于miRNAs心衰標(biāo)志物的心衰初篩檢測(cè)試劑盒，所述miRNAs的心衰標(biāo)志物為：hsa-miR-210，hsa-miR-2110，hsa-miR-21-3p，hsa-miR-320a，hsa-miR-423-5p，hsa-miR-483-5p，hsa-miR-17-3p，hsa-miR-22-3p，hsa-miR-195-3p，hsa-miR-16-2-3p和hsa-miR-339-5p。所述心衰初篩檢測(cè)試劑盒包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)體系，所述PCR反應(yīng)體系包括上述心衰標(biāo)志物的特異性引物，所述特異性引物序列如SEQIDNO：1-11。表1hsa-miR-210agcccctgcccaccgcacactg(SEQIDNO：1)hsa-miR-2110ttggggaaacggccgctgagtg(SEQIDNO：2)hsa-miR-21-3pcaacaccagtcgatgggctgt(SEQIDNO：3)hsa-miR-320aaaaagctgggttgagagggcga(SEQIDNO：4)hsa-miR-423-5ptgaggggcagagagcgagacttt(SEQIDNO：5)hsa-miR-483-5paagacgggaggaaagaagggag(SEQIDNO：6)hsa-miR-17-3pactgcagtgaaggcacttgtag(SEQIDNO：7)hsa-miR-22-3paagctgccagttgaagaactgt(SEQIDNO：8)hsa-miR-195-3ptagcagcacagaaatattggc(SEQIDNO：9)hsa-miR-16-2-3pccaatattactgtgctgcttta(SEQIDNO：10)hsa-miR-339-5ptccctgtcctccaggagctcacg(SEQIDNO：11)實(shí)施例2一、材料與方法1、研究對(duì)象的選擇：(1)心力衰竭診斷：根據(jù)紐約心臟學(xué)會(huì)(NYHA)心功能分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(I-IV級(jí))，心功能III-IV級(jí)；二維心臟超聲左心室射血分?jǐn)?shù)＜45％；循環(huán)血NT-proBNP含量＞1000ng/L。滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的心臟病患者入組研究。(2)缺血性心肌病心衰(IHF)：滿足上述標(biāo)準(zhǔn)及冠狀動(dòng)脈造影顯示主要分支狹窄或支架術(shù)后再狹窄≥75％；動(dòng)脈血壓＜160/100mmHg；無(wú)心肌炎、原發(fā)性心臟瓣膜病、持續(xù)快速室上性心律失常、心包疾病、先天性心臟病、肺心病、繼發(fā)于其它全身疾病所致的心臟病變。(3)非缺血性心肌病心衰(NIHF)：滿足上述標(biāo)準(zhǔn)及冠狀動(dòng)脈造影顯示主要分支狹窄＜50％；動(dòng)脈血壓＜160/100mmHg；無(wú)心肌炎、原發(fā)性心臟瓣膜病、持續(xù)快速室上性心律失常、心包疾病、先天性心臟病、肺心病、繼發(fā)于其它全身疾病所致的心臟病變。(4)正常對(duì)照(NC)：選擇年齡和性別相配的正常捐助者。無(wú)上述疾病且心功能正常。無(wú)妊娠、透析治療、惡性腫瘤或經(jīng)腫瘤治療等。2、血漿樣本全RNA分離和純化：用含EDTA離心管采集全血樣本(5ml)并在4℃條件下離心分離血漿，mirVanaPARIS試劑盒分離血全RNA。在分離血全RNA前，向血漿中加入25fmol人工合成的秀麗隱桿線蟲MicroRNA-39作為內(nèi)參。將分離的血全RNA重懸于100μL無(wú)RNA酶水中，-80℃保存待測(cè)。3、miRNAs文庫(kù)的構(gòu)建：選取缺血性心衰患者8例、非缺血性心衰患者8例和健康對(duì)照人8例，提取血漿、分離全RNA并建立miRNAs文庫(kù)。建庫(kù)流程：1)分離SmallRNA，PAGE膠分離提取18-30nt大小的RNA，進(jìn)行回收。2)接頭連接，配制連接體系，混勻離心，適溫連接一段時(shí)間。3)RT-PCR，配制反轉(zhuǎn)錄體系，在PCR儀上適溫反應(yīng)一定時(shí)間，使連接產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄成雙鏈，再配制。PCR反應(yīng)體系，在PCR儀上按照一定程序進(jìn)行擴(kuò)增。4)PCR產(chǎn)物回收純化，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化，完成文庫(kù)構(gòu)建。5)文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)：構(gòu)建好的文庫(kù)使用Agilent2100Bioanalyzer和ABIStepOnePlusReal-TimePCRSystem進(jìn)行質(zhì)量和產(chǎn)量的檢測(cè)。4、qRT-PCR驗(yàn)證實(shí)施例1所述心衰標(biāo)志物；本發(fā)明miRNAs心衰標(biāo)志物定量分析采用兩步法進(jìn)行，即逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。每10微升RT反應(yīng)體系含0.5μgRNA，2μlofPrimerScriptBuffer，0.5μlofoligodT，0.5μlofrandomhexamersand0.5μlofPrimerScriptRTEnzymeMixI(Takara，Japan)。RT反應(yīng)在GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems，USA)上完成(15min，37℃)，再經(jīng)RT酶熱變性(5秒，85℃)。將10-μlRT反應(yīng)體系用去核酸酶水溶液稀釋10倍，保存在-20℃?zhèn)溆?。在LightCycler480IIReal-timePCR儀上完成Real-timePCR。10-μl反應(yīng)體系含有：1μlcDNA，5μlof2×LightCycler480SYBRGreenIMaster(Roche)，0.2μlprimersand3.6μl無(wú)核酸酶水。心衰標(biāo)志物的特異性引物如表1所示，GenerayBiotech(China)公司合成。樣品在384-wellopticalplate(Roche，Swiss)上孵育95℃，10分鐘，95℃，10秒和60℃，30秒共40個(gè)循環(huán)，PCR循環(huán)結(jié)束后完成熔化曲線并驗(yàn)證特異性PCR產(chǎn)物。U6小核RNAs，序列為：CAAGGATGACACGCAAATTCG(SEQIDNO：11)，作內(nèi)參以去除背景噪音。計(jì)算miRNAs相對(duì)表達(dá)量(normalizedCtvalue)。Inverted-normalizedCt＝MaxDetectableCt-{(DetectedCtU6’sCtOftheSample)+AverageU6’sCtOfAllSamples)。數(shù)值越高表明較表達(dá)并計(jì)算倍數(shù)變化。4)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：全部統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件上進(jìn)行。所得資料用X±SD和百分率表示；兩組資料比較分別使用不成對(duì)的t檢驗(yàn)和X2檢驗(yàn)；多組資料比較用方差分析檢驗(yàn)；相關(guān)性以Pearson’s相關(guān)系數(shù)表示。P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性。二、結(jié)果從5毫升血漿樣本中提取全RNA進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)樣本平均產(chǎn)生9.5-14.65M讀數(shù)，根據(jù)測(cè)序和差異表達(dá)miRNAs分析結(jié)果，計(jì)算出表達(dá)倍數(shù)和P值，P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異，如果檢測(cè)的實(shí)施例1所述心衰標(biāo)志物與對(duì)照試樣具有顯著差異，則判定患有心力衰竭。上述以實(shí)施例1所述心衰標(biāo)志物檢測(cè)心力衰竭診斷的陽(yáng)性符合率為15例，陰性符合率為7例。說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例1所述心衰標(biāo)志物能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)心衰早期診斷。以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
：，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3