亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

利用魚的GPx基因監(jiān)測CO2酸化水體的方法與流程

文檔序號(hào):11936988閱讀:414來源:國知局
本發(fā)明涉及二氧化碳酸化(CO2)水體監(jiān)測
技術(shù)領(lǐng)域
。更具體地說,本發(fā)明涉及一種利用魚的GPx基因監(jiān)測CO2酸化水體的方法。
背景技術(shù)
:自工業(yè)革命以來,由于人類活動(dòng)和工農(nóng)業(yè)發(fā)展,大氣中的二氧化碳(CO2)水平正以前所未有的速度上升,導(dǎo)致海洋和其他水體吸收CO2的量不斷增加,水體pH值下降,導(dǎo)致水體酸化。CO2酸化如海水酸化,不同于一般意義上的酸化如鹽酸(HCl)酸化,CO2酸化對魚類的影響顯著大于HCl酸化的影響。例如同是pH=6.2,CO2酸化對真鯛(Pagrusmajor)的卵和幼體產(chǎn)生的毒性(死亡率60-100%)遠(yuǎn)高于HCl酸化產(chǎn)生的毒性(死亡率1-4%)。由于CO2分子比H+更易穿透生物膜,與水反應(yīng)生成H2CO3,后者在碳酸酐酶的作用下,迅速分解成H+和HCO3-;在相同H+濃度下(pH=6.16),CO2衍生出的分子種類(HCO3-、CO32-)是HCl的150倍。HCl酸化只是H+濃度升高;而CO2進(jìn)入生物體內(nèi)后可以直接破壞體液的酸堿平衡,加之CO2酸化還會(huì)使機(jī)體新陳代謝率及蛋白合成下降,攜氧能力下降,抑制機(jī)體正常生理活動(dòng),乃至死亡。因此,由CO2酸化升高導(dǎo)致的pH降低對水生動(dòng)物產(chǎn)生的影響比單一H+濃度增加而產(chǎn)生的影響更為嚴(yán)重。海水酸化是CO2酸化,是全球環(huán)境變化的重大問題之一。海水酸化可直接和間接影響魚及其他水生生物的代謝、抗氧化、免疫防御、離子和酸堿平衡等,致其傷亡。海水酸化不僅威脅某些物種,還可使整個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)退化。海水酸化是亟待研究和積極應(yīng)對的全球性重大環(huán)境問題。目前有關(guān)海水酸化(CO2酸化水體)的研究剛起步,海水酸化對水生生物影響的研究還少,對魚類影響的研究更少,海水酸化的生物效應(yīng)相對難以預(yù)測,并且尚無適宜的魚類基因檢測CO2酸化水體的程度,影響了海水酸化對水生生物影響的深入研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問題,并提供一種利用魚的GPx基因監(jiān)測CO2酸化水體的方法,通過用對海水酸化非常敏感的海水青鳉(Oryziasmelastigma)稚魚的GPx基因作為敏感生物標(biāo)記物,測試并計(jì)算GPx基因的相對表達(dá)量,能敏感的表達(dá)出水體中CO2酸化的程度,方法簡單,易操作,能快速靈敏的檢測出水體CO2酸化程度,更好的監(jiān)測水體酸化情況,有助于研究不同程度的酸化水體對魚類GPx基因指標(biāo)的影響。為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn),提供了一種利用魚的GPx基因監(jiān)測CO2酸化水體的方法;所述的GPx是谷胱甘肽過氧化物酶的簡稱。本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:一種利用魚的GPx基因監(jiān)測CO2酸化水體的方法,用魚作為監(jiān)測酸化水體的生物樣本,魚的GPx基因作為監(jiān)測CO2酸化水體的敏感生物標(biāo)記物。優(yōu)選的是,建立魚的GPx基因的相對表達(dá)量2-ΔΔCt與CO2酸化水體的pH值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲取與建立標(biāo)準(zhǔn)曲線同類同大小的待測水域的魚,然后將計(jì)算得所述待測水域的魚的GPx基因的相對表達(dá)量2-ΔΔCt與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對,獲得CO2酸化水體的pH值大小。優(yōu)選的是,計(jì)算GPx基因的相對表達(dá)量具體包括以下步驟:1)用魚作為監(jiān)測水污染的生物樣本;2)利用RNA提取試劑,提取魚樣品總RNA,利用反轉(zhuǎn)錄試劑將RNA反轉(zhuǎn)錄合成首鏈cDNA;3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測,以首鏈cDNA為模板,分別根據(jù)所述GPx基因的特異性引物,所述18s-rRNA基因引物,在羅氏PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng),熒光定量PCR反應(yīng)體系為:SYBR試劑12.5μL、上游引物F1μL、下游引物R1μL、cDNA2μL、滅菌蒸餾水8.5μL,反應(yīng)體系總體積為25μL;反應(yīng)程序采用三步法程序:95℃預(yù)變性30s;95℃,15s;60℃,30s;72℃,30s,40個(gè)循環(huán),采集熒光信號(hào)數(shù)值Ct,Ct值是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù);4)獲得GPx基因熒光信號(hào)數(shù)值CtGPx和內(nèi)參基因熒光信號(hào)數(shù)值Ct18s-rRNA后,采取2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,ΔCt=CtGPx-Ct18s-rRNA,ΔΔCt=(CtGPx-Ct18s-rRNA)測試組-(CtGPx-Ct18s-rRNA)空白組,GPx基因的相對表達(dá)量=2-ΔΔCt,計(jì)算2-ΔΔCt得出GPx基因的相對表達(dá)量。優(yōu)選的是,實(shí)驗(yàn)選魚為稚魚,將稚魚分成若干組,其中一組為正常對照組,其他組為待測水域組;分別將稚魚放入正常對照水體和待測水域水體中飼養(yǎng);8周后隨機(jī)抽取魚樣品,檢測并計(jì)算GPx相對表達(dá)量2-ΔΔCt,如果待測水域組的2-ΔΔCt值小于正常對照組的2-ΔΔCt值,那么待測水域的pH值小于正常對照組的pH值,則待測水域的水體受到CO2酸化。優(yōu)選的是,GPx基因的特異性引物為:上游引物如SEQIDNO.1所示:GPx-F:5’-CGACCACCAGGGATTACACC-3’,下游引物如SEQIDNO.2所示:GPx-R:5’-GGACAGCAGGATTTCTTCATTCTT-3’;魚的內(nèi)參基因?yàn)?8s-rRNA基因,18s-rRNA基因的引物為:上游引物如SEQIDNO.3所示:18s-rRNA-F:5’-TTGACCCAACACGGGAAACCT-3’,下游引物如SEQIDNO.4所示:18s-rRNA-R:5’-CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3’。優(yōu)選的是,魚的GPx基因的相對表達(dá)量與CO2酸化水體的pH值大小呈正相關(guān)。優(yōu)選的是,所述魚為海水青鳉或淡水青鳉。優(yōu)選的是,所述稚魚均為30天齡稚魚。本發(fā)明至少包括以下有益效果:谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶。它能催化谷胱甘肽(GSH)變?yōu)檠趸凸入赘孰?GSSG),使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物,同時(shí)促進(jìn)H2O2的分解,保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害。研究魚體中GPx基因的變化能幫助我們更好理解和研究魚類在環(huán)境脅迫中氧化和抗氧化作用及機(jī)理。有利于預(yù)測海水酸化的生物效應(yīng),對保護(hù)海水酸化的首要沖擊者、水體生產(chǎn)力中的主要產(chǎn)物—魚類和其他生物,發(fā)展可持續(xù)的漁業(yè)和生態(tài)系統(tǒng)具有現(xiàn)實(shí)意義。并且本發(fā)明可以利用魚的GPx基因監(jiān)測CO2酸化水體的污染情況,通過魚的GPx基因的相對表達(dá)量與CO2酸化水體的pH值大小呈正相關(guān),就可以快速準(zhǔn)確監(jiān)測到水體受到CO2的酸化的程度和危害程度。本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn),部分還將通過對本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。具體實(shí)施方式結(jié)合下面實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明,以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。實(shí)施例11、水污染魚生物樣本飼養(yǎng)準(zhǔn)備采用30天齡海水青鳉稚魚作為監(jiān)測水污染的生物樣本,將稚魚分成5組,分別在表1所述的水環(huán)境中飼養(yǎng),其中水域的pH8.1為正常對照組,每組3個(gè)平行進(jìn)行,飼養(yǎng)8周后,每個(gè)平行取3尾魚樣品測定,每組測定3*3=9個(gè)數(shù)據(jù),將每組9個(gè)數(shù)據(jù)數(shù)理統(tǒng)計(jì)后得到各組魚的GPx基因的相對表達(dá)量。表15組稚魚飼養(yǎng)的水域中CO2酸化水體的pH值實(shí)驗(yàn)序號(hào)對照組1234pH值8.17.97.77.57.3構(gòu)建CO2充氣系統(tǒng)持續(xù)泡控目標(biāo)pH值的酸化海水,以目前近海表層海水的平均值(pH8.1)為對照組。通過向海水中充入高純CO2氣體,用HENTEXpH/ORP控制器監(jiān)測并控制每個(gè)養(yǎng)殖槽中海水pH值,以保持各組實(shí)驗(yàn)海水pH值的穩(wěn)定。飼養(yǎng)的其他條件是:每天三次投喂200目飼料,總投喂量為魚體重的5%。每天詳細(xì)觀察和記錄魚的活動(dòng)、攝食、畸形、死亡等,8周后隨機(jī)采集魚樣品,分別稱魚體濕重,可以直接或暫存-80℃用于GPx基因相對表達(dá)量的測定。2、利用RNA提取試劑,提取魚樣品總RNA,利用反轉(zhuǎn)錄試劑將RNA反轉(zhuǎn)錄合成首鏈cDNA;(1)快速稱取魚樣品100mg左右,記錄實(shí)際重量為M,然后放入提前預(yù)冷的研缽中倒入液氮,用研杵研磨稱量好的魚樣品,直至研磨成粉末狀,然后用不銹鋼小藥匙迅速將樣品粉末移入冰浴中的玻璃勻漿管底部。(2)用移液槍往玻璃勻漿管中加入0.6mLRNAiso試劑,充分勻漿至勻漿液呈無顆粒透明狀后,將勻漿液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中。然后再向勻漿管中加入0.2mLRNAiso試劑,洗滌勻漿棒和勻漿管管壁各一次,之后將勻漿液轉(zhuǎn)入之前的離心管中,重復(fù)上述操作一次,使加入的RNAiso試劑總體積為1mL。蓋好離心管并顛倒混勻數(shù)次后室溫靜置5min。(3)用1000μL微量移液槍往上一步的1.5mL離心管中加入200μL氯仿,蓋緊離心管蓋,混勻至溶液乳化后,再室溫靜置5min。(4)轉(zhuǎn)移至高速冷凍離心機(jī)中12000g,4℃,離心15min。(5)小心從離心機(jī)中取出離心管,用1000μL微量移液器吸取500μL上清液至一個(gè)新的1.5ml離心管中。(6)然后往新的1.5mL離心管中加入500μL異丙醇,蓋好離心管并充分顛倒混勻,室溫靜置10min。(7)轉(zhuǎn)移至高速冷凍離心機(jī)中12000g,4℃,離心10min。(8)將1.5mL離心管中上清液倒掉,再12000g,4℃,離心1min,用小槍頭(100μL)將上清液吸凈。(9)往離心管中加入現(xiàn)配的預(yù)冷的75%乙醇1ml(無水乙醇3:1DEPC水),蓋好離心管并輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁及RNA,再12000g,4℃,離心1min后小心去除乙醇。(10)在超凈工作臺(tái)中打開離心管蓋,室溫干燥沉淀10min,加入50μLDEPC處理水溶解沉淀,靜置3min,待RNA沉淀完全溶解后置于-20℃待用。(11)使用ThermoScientificNanodrop2000c測定總的RNA的含量,獲得測定濃度,RNA含量的計(jì)算公式:樣品RNA濃度(μg/mg)=測定濃度(ng/μl)×50×1000÷M。(12)用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度,若測定的OD260/OD280值在1.9~2.1之間,且總RNA電泳條帶清晰呈現(xiàn)為28S,18S和5S三條帶,28S的條帶亮度約為18S的兩倍,說明RNA純度和濃度符合要求,可繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);(13)利用反轉(zhuǎn)錄試劑將RNA反轉(zhuǎn)錄合成首鏈cDNA;a)逆轉(zhuǎn)錄:用普通PCR儀將RNA反轉(zhuǎn)錄成首鏈cDNA,按照表2配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液:表2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成反應(yīng)液配制方法:配置前先根據(jù)反轉(zhuǎn)錄樣品的數(shù)量計(jì)算出各反應(yīng)液實(shí)際需要量,統(tǒng)一加入無菌離心管中混合均勻,然后分裝到各個(gè)反應(yīng)管中,最后添加樣品并小心點(diǎn)動(dòng)離心混勻,使反應(yīng)更加充分并減少誤差。配制過程需在冰浴且無菌體系中進(jìn)行,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:50℃,20min→95℃,5min→5℃,5min→15℃,15min。3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測目的基因(1)引物設(shè)計(jì)所述GPx基因的特異性引物為:上游引物為:GPx-F:5’-CGACCACCAGGGATTACACC-3’,(SEQIDNO.1)下游引物為:GPx-R:5’-GGACAGCAGGATTTCTTCATTCTT-3’;(SEQIDNO.2)所述魚的內(nèi)參基因?yàn)?8s-rRNA基因,所述18s-rRNA基因的引物為:上游引物為:18s-rRNA-F:5’-TTGACCCAACACGGGAAACCT-3’,(SEQIDNO.3)下游引物為:18s-rRNA-R:5’-CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3’;(SEQIDNO.4)(2)PCR檢測目的基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)用普通PCR(RT-PCR)儀擴(kuò)增cDNA,按表3配制PCR反應(yīng)液:表3PCR反應(yīng)液組成根據(jù)反轉(zhuǎn)錄樣品數(shù)量計(jì)算各PCR反應(yīng)試劑用量,配制反應(yīng)混合液,點(diǎn)動(dòng)離心混勻,然后分裝到PCR反應(yīng)結(jié)束后的PCR反應(yīng)管中,再點(diǎn)動(dòng)離心混勻。反應(yīng)結(jié)束后,將PCR管存于4℃待用。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃,1min→(94℃,30sec→60℃,30sec→72℃,1min,40個(gè)循環(huán))→72℃,5min→15℃,pause。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,條件為100V,30min。若PCR反應(yīng)產(chǎn)物的條帶單一,出現(xiàn)位置在100–200bp之間,可初步確定PCR產(chǎn)物為目的基因。PCR產(chǎn)物純化與濃縮,PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測符合實(shí)驗(yàn)要求后,取經(jīng)純化濃縮后的PCR產(chǎn)物測序,測序結(jié)果經(jīng)BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)比對后,確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是目的基因片段,方可進(jìn)行后續(xù)的熒光定量實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用的是TaKaRa公司的PremixExTaqTM(PerfectRealTime)試劑盒,本試劑盒是在PCR擴(kuò)增合成雙鏈DNA的過程中,熒光分子GreenI與雙鏈DNA結(jié)合能夠發(fā)出熒光信號(hào),通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號(hào)出現(xiàn)的先后順序以及信號(hào)的強(qiáng)弱變化,來及時(shí)分析目的基因GPx的拷貝數(shù)目,從而對目的基因的表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)準(zhǔn)確定量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RTQ-PCR)的反應(yīng)體系如表4:表4RTQ-PCR反應(yīng)體系組成RTQ-PCR反應(yīng)體系的配制必須在冰浴無菌條件下進(jìn)行,并經(jīng)點(diǎn)動(dòng)離心混勻后才能使用。反應(yīng)液配制、分裝均要使用無菌的新槍頭,以避免污染,而且配制的速度要快,以免其中的反應(yīng)酶失活。反應(yīng)試劑添加完成后,使用配有八聯(lián)管轉(zhuǎn)頭的臺(tái)式離心機(jī)短暫離心,確保試劑沉積在管底。熒光定量反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30s;95℃,15s;60℃,30s;72℃,30s,40個(gè)循環(huán);采集熒光信號(hào)數(shù)值Ct;獲得GPx基因熒光信號(hào)數(shù)值CtGPx和內(nèi)參基因熒光信號(hào)數(shù)值Ct18s-rRNA后,采取2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,ΔCt=CtGPx-Ct18s-rRNA,ΔΔCt=(CtGPx-Ct18s-rRNA)測試組-(CtGPx-Ct18s-rRNA)空白組,GPx基因的相對表達(dá)量=2-ΔΔCt,計(jì)算2-ΔΔCt得出GPx基因的相對表達(dá)量;測定并經(jīng)數(shù)理統(tǒng)計(jì)的結(jié)果如表5所示:表55組魚樣品的GPx基因的相對表達(dá)量2-ΔΔCt實(shí)驗(yàn)序號(hào)對照組1234pH值8.17.97.77.57.3GPx2-ΔΔCt1.861.711.511.291.18受到海水酸化的脅迫,魚樣本生理機(jī)能發(fā)生變化,通過GPx基因的相對表達(dá)量來監(jiān)測水酸化的程度,隨著pH不斷降低,魚體內(nèi)GPx基因相對表達(dá)量也隨之降低,當(dāng)pH為7.3時(shí),GPx基因相對表達(dá)量最低,為1.18。通過表5的數(shù)據(jù)結(jié)果,建立海水青鳉的GPx基因的相對表達(dá)量2-ΔΔCt與CO2酸化水體的pH值的標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲取86天齡左右的海水青鳉,然后將計(jì)算得所述待測水域的海水青鳉的GPx基因的相對表達(dá)量2-ΔΔCt與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對,獲得CO2酸化水體的pH值大小。通過本發(fā)明的方法,就可以通過魚作為監(jiān)測水體酸化的生物樣本,魚的GPx基因作為監(jiān)測水中CO2酸化的敏感生物標(biāo)記物,就可以獲知待測水域中CO2酸化水體的pH值大小,以及獲知待測水域目前的危害程度。實(shí)施例21、樣品魚的飼養(yǎng)把海水青鳉30天齡的稚魚飼養(yǎng)在監(jiān)測的酸化水體中,以用作監(jiān)測的生物樣本。將稚魚分成2組,每組3個(gè)平行養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn),這2組分別為正常(無酸化)對照組與待測水域組,其中正常水域的pH值為8.1。將稚魚分別放入正常對照組水體和待測水域水體中飼養(yǎng),養(yǎng)殖8周后,每個(gè)平行取3尾魚樣品測定,每組測定3*3=9個(gè)數(shù)據(jù),將每組9個(gè)數(shù)據(jù)數(shù)理統(tǒng)計(jì)后得到各組魚的GPx基因相對表達(dá)量。2、按照分組,利用RNA提取試劑,提取魚樣品總RNA,利用反轉(zhuǎn)錄試劑將RNA反轉(zhuǎn)錄合成首鏈cDNA;(1)快速稱取冷凍的魚樣品100mg左右,記錄實(shí)際重量為M,然后放入提前預(yù)冷的研缽中倒入液氮,用研杵研磨稱量好的魚樣品,直至研磨成粉末狀,然后用不銹鋼小藥匙迅速將樣品粉末移入冰浴中的玻璃勻漿管底部。(2)用移液槍往玻璃勻漿管中加入0.6mLRNAiso試劑,充分勻漿至勻漿液呈無顆粒透明狀后,將勻漿液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中。然后再向勻漿管中加入0.2mLRNAiso試劑,洗滌勻漿棒和勻漿管管壁各一次,之后將勻漿液轉(zhuǎn)入之前的離心管中,重復(fù)上述操作一次,使加入的RNAiso試劑總體積為1mL。蓋好離心管并顛倒混勻數(shù)次后室溫靜置5min。(3)用1000μL微量移液槍往上一步的1.5mL離心管中加入200μL氯仿,蓋緊離心管蓋,混勻至溶液乳化后,再室溫靜置5min。(4)轉(zhuǎn)移至高速冷凍離心機(jī)中12000g,4℃,離心15min。(5)小心從離心機(jī)中取出離心管,用1000μL微量移液器吸取500μL上清液至一個(gè)新的1.5ml離心管中。(6)然后往新的1.5mL離心管中加入500μL異丙醇,蓋好離心管并充分顛倒混勻,室溫靜置10min。(7)轉(zhuǎn)移至高速冷凍離心機(jī)中12000g,4℃,離心10min。(8)將1.5mL離心管中上清液倒掉,再12000g,4℃,離心1min,用小槍頭(100μL)小心將上清液吸除干凈。(9)往離心管中加入現(xiàn)配的預(yù)冷的75%乙醇1ml(無水乙醇3:1DEPC水),蓋好離心管并輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁及RNA,再12000g,4℃,離心1min后小心去除乙醇。(10)在超凈工作臺(tái)中打開離心管蓋,室溫干燥沉淀10min,加入50μLDEPC處理水溶解沉淀,靜置3min,待RNA沉淀完全溶解后置于-20℃冰箱待用。(11)使用ThermoScientificNanodrop2000c測定總的RNA的含量,獲得測定濃度,RNA含量的計(jì)算公式:樣品RNA濃度(μg/mg)=測定濃度(ng/μl)×50×1000÷M。(12)用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度,若測定的OD260/OD280值在1.9~2.1之間,且總RNA電泳條帶清晰呈現(xiàn)為28S,18S和5S三條帶,28S的條帶亮度約為18S的兩倍,說明RNA純度和濃度符合要求,可繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);(13)利用反轉(zhuǎn)錄試劑將RNA反轉(zhuǎn)錄合成首鏈cDNA;a)逆轉(zhuǎn)錄:用普通PCR儀將RNA反轉(zhuǎn)錄成首鏈cDNA,按照表2配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液:表2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成反應(yīng)液配制方法:配置前先根據(jù)反轉(zhuǎn)錄樣品的數(shù)量計(jì)算出各反應(yīng)液實(shí)際需要量,統(tǒng)一加入無菌離心管中混合均勻,然后分裝到各個(gè)反應(yīng)管中,最后添加樣品并小心點(diǎn)動(dòng)離心混勻,使反應(yīng)更加充分并減少誤差。配制過程需在冰浴且無菌體系中進(jìn)行,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:50℃,20min→95℃,5min→5℃,5min→15℃,15min。4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測目的基因(1)引物設(shè)計(jì)所述GPx基因的特異性引物為:上游引物為:GPx-F:5’-CGACCACCAGGGATTACACC-3’,(SEQIDNO.1)下游引物為:GPx-R:5’-GGACAGCAGGATTTCTTCATTCTT-3’;(SEQIDNO.2)所述魚的內(nèi)參基因?yàn)?8s-rRNA基因,所述18s-rRNA基因的引物為:上游引物為:18s-rRNA-F:5’-TTGACCCAACACGGGAAACCT-3’,(SEQIDNO.3)下游引物為:18s-rRNA-R:5’-CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3’;(SEQIDNO.4)(2)PCR檢測目的基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)用普通PCR(RT-PCR)儀擴(kuò)增cDNA,按表3配制PCR反應(yīng)液:表3PCR反應(yīng)液組成根據(jù)反轉(zhuǎn)錄樣品數(shù)量計(jì)算各CR反應(yīng)試劑用量,配制反應(yīng)混合液,點(diǎn)動(dòng)離心混勻,然后分裝到PCR反應(yīng)結(jié)束后的PCR反應(yīng)管中,再點(diǎn)動(dòng)離心混勻。反應(yīng)結(jié)束后,將PCR管存于4℃冰箱待用。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃,1min→(94℃,30sec→60℃,30sec→72℃,1min,40個(gè)循環(huán))→72℃,5min→15℃,pause。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,條件為100V,30min。若PCR反應(yīng)產(chǎn)物的條帶單一,出現(xiàn)位置在100-200bp之間,可初步確定PCR產(chǎn)物為目的基因。PCR產(chǎn)物純化與濃縮,PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測符合實(shí)驗(yàn)要求后,取經(jīng)純化濃縮后的PCR產(chǎn)物測序,測序結(jié)果經(jīng)BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)比對后,確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是目的基因片段,方可進(jìn)行后續(xù)的熒光定量實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用的是TaKaRa公司的PremixExTaqTM(PerfectRealTime)試劑盒,本試劑盒是在PCR擴(kuò)增合成雙鏈DNA的過程中,熒光分子GreenI與雙鏈DNA結(jié)合能夠發(fā)出熒光信號(hào),通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號(hào)出現(xiàn)的先后順序以及信號(hào)的強(qiáng)弱變化,來及時(shí)分析目的基因GPx的拷貝數(shù)目,從而對目的基因的表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)準(zhǔn)確定量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RTQ-PCR)的反應(yīng)體系如表4:表4RTQ-PCR反應(yīng)體系組成RTQ-PCR反應(yīng)體系的配制必須在冰浴無菌條件下進(jìn)行,并經(jīng)點(diǎn)動(dòng)離心混勻后才能使用,反應(yīng)液配制、分裝均要使用無菌的新槍頭,以避免污染,而且配制的速度要快,以免其中的反應(yīng)酶失活。反應(yīng)試劑添加完成后,使用配有八聯(lián)管轉(zhuǎn)頭的臺(tái)式離心機(jī)短暫離心,確保試劑沉積在管底。熒光定量反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30s;95℃15s;60℃30s;72℃30s,40個(gè)循環(huán);采集熒光信號(hào)數(shù)值Ct;采用上述參數(shù),多次循環(huán)測試,相對其他參數(shù)來說采集到的熒光信號(hào)數(shù)值Ct誤差??;獲得GPx基因熒光信號(hào)數(shù)值CtGPx和內(nèi)參基因熒光信號(hào)數(shù)值Ct18s-rRNA后,采取2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,ΔCt=CtGPx-Ct18s-rRNA,ΔΔCt=(CtGPx-Ct18s-rRNA)測試組-(CtGPx-Ct18s-rRNA)空白組,GPx基因的相對表達(dá)量=2-ΔΔCt,計(jì)算2-ΔΔCt得出GPx基因的相對表達(dá)量,采取2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析能減少誤差,能夠準(zhǔn)確表述GPx基因的相對表達(dá)量從而精準(zhǔn)反映出水酸化程度;檢測結(jié)果:對照組的2-ΔΔCt值為1.86,待測組的2-ΔΔCt值為1.51,結(jié)果顯示待測組的2-ΔΔCt值小于對照組的2-ΔΔCt值,表明待測水域已經(jīng)受到了CO2酸化,需及早進(jìn)行水域治理。而用化學(xué)的方法測試CO2酸化的程度,一般采用試紙測試,由于海水中存在各種雜質(zhì)而導(dǎo)致測試CO2酸化的程度不準(zhǔn)確,而且難以判斷酸化的危害程度,不能準(zhǔn)確監(jiān)測水體和及時(shí)預(yù)防水體酸化。還可以借助在實(shí)施例1中得到的GPx基因的相對表達(dá)量與CO2酸化水體的pH值的正相關(guān)曲線,獲得在實(shí)施例2中待測水域中魚的GPx基因的相對表達(dá)量2-ΔΔCt值為1.51時(shí),比對正相關(guān)曲線,得到待測水域的CO2酸化水體的pH值為7.7。本發(fā)明所提到的空白組為所使用的試劑盒的空白對照,目的是為了減小誤差。盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上,但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用,它完全適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域,對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言,可輕易改作他用,因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下,本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的實(shí)施例。當(dāng)前第1頁1 2 3 
當(dāng)前第1頁1 2 3 
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1