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利用魚的GPx基因監(jiān)測CO2酸化水體的方法與流程

文檔序號(hào):11936988閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種利用魚的GPx基因監(jiān)測CO2酸化水體的方法,其特征在于,用魚作為監(jiān)測水體污染的生物樣本,魚的GPx基因作為監(jiān)測水中CO2酸化的敏感生物標(biāo)記物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用魚的GPx基因監(jiān)測CO2酸化水體的方法,其特征在于,建立魚的GPx基因的相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt與CO2酸化水體pH值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲取與建立標(biāo)準(zhǔn)曲線同類同大小的待測水域的魚,然后將計(jì)算得所述待測水域的魚的GPx基因的相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì),獲得CO2酸化水體的pH值大小。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用魚的GPx基因監(jiān)測CO2酸化水體的方法,其特征在于,計(jì)算GPx基因的相對(duì)表達(dá)量具體包括以下步驟:

1)用魚作為監(jiān)測水污染的生物樣本;

2)利用RNA提取試劑,提取魚樣品總RNA,利用反轉(zhuǎn)錄試劑將RNA反轉(zhuǎn)錄合成首鏈cDNA;

3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測,以首鏈cDNA為模板,分別根據(jù)所述GPx基因的特異性引物,18s-rRNA基因引物,在羅氏PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng),熒光定量PCR反應(yīng)體系為:SYBR試劑12.5μL、上游引物F 1μL、下游引物R 1μL、cDNA 2μL、滅菌蒸餾水8.5μL,反應(yīng)體系總體積為25μL;反應(yīng)程序采用三步法程序:95℃預(yù)變性30s;95℃,15s;60℃,30s;72℃,30s,40個(gè)循環(huán),采集熒光信號(hào)數(shù)值Ct,Ct值是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù);

4)獲得GPx基因熒光信號(hào)數(shù)值CtGPx和內(nèi)參基因熒光信號(hào)數(shù)值Ct18s-rRNA后,采取2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,ΔCt=CtGPx-Ct18s-rRNA,

ΔΔCt=(CtGPx-Ct18s-rRNA)測試組-(CtGPx-Ct18s-rRNA)空白組,GPx基因的相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt,計(jì)算2-ΔΔCt得出GPx基因的相對(duì)表達(dá)量。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用魚的GPx基因監(jiān)測CO2酸化水體的方法,其特征在于,實(shí)驗(yàn)選魚為稚魚,將稚魚分成若干組,其中一組為正常對(duì)照組,其他組為待測水域組;分別將稚魚放入正常對(duì)照水體和待測水域水體中飼養(yǎng);8周后隨機(jī)抽取魚樣品,檢測并計(jì)算GPx相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt,如果待測水域組的2-ΔΔCt值小于正常對(duì)照組的2-ΔΔCt值,那么待測水域的pH值小于正常對(duì)照組的pH值,則待測水域的水體受到CO2酸化。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的利用魚的GPx基因監(jiān)測CO2酸化水體的方法,其特征在于,GPx基因的特異性引物為:

上游引物如SEQ ID NO.1所示:GPx-F:5’-CGACCACCAGGGATTACACC-3’,

下游引物如SEQ ID NO.2所示:GPx-R:5’-GGACAGCAGGATTTCTTCATTCTT-3’;

魚的內(nèi)參基因?yàn)?8s-rRNA基因,18s-rRNA基因的引物為:

上游引物如SEQ ID NO.3所示:18s-rRNA-F:5’-TTGACCCAACACGGGAAACCT-3’,

下游引物如SEQ ID NO.4所示:18s-rRNA-R:5’-CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3’。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用魚的GPx基因監(jiān)測CO2酸化水體的方法,其特征在于,魚的GPx基因的相對(duì)表達(dá)量與CO2酸化水體的pH值大小呈正相關(guān)。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用魚的GPx基因監(jiān)測CO2酸化水體的方法,其特征在于,所述魚為海水青鳉或淡水青鳉。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用魚的GPx基因監(jiān)測CO2酸化水體的方法,其特征在于,所述稚魚均為30天齡稚魚。

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