本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)肺炎支原體核酸及耐藥突變的引物、探針、方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

肺炎支原體(Mycoplasma Pneumoniae，MP)是造成兒童、老年人呼吸道感染的主要病原體，也是引起社區(qū)獲得性肺炎的常見(jiàn)病原體。主要引起肺炎以及氣管炎、支氣管炎、哮喘等臨床癥狀和一些嚴(yán)重的臨床并發(fā)癥。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素是目前治療肺炎支原體肺炎的首選藥物，抗生素濫用導(dǎo)致MP耐藥性不斷升高。

培養(yǎng)法是檢測(cè)肺炎支原體的金標(biāo)準(zhǔn)，一旦檢出，即可確診。但其缺點(diǎn)在于需要的時(shí)間長(zhǎng)，一般培養(yǎng)需2周左右，生長(zhǎng)條件苛刻，當(dāng)標(biāo)本中MP數(shù)量少、培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)不夠或操作方法不當(dāng)時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果；ELISA具有快速、敏感、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于肺炎支原體，可檢測(cè)IgM和IgG抗體，方法敏感，特異性高，是診斷肺炎支原體感染實(shí)用可靠的手段。肺炎支原體感染后可產(chǎn)生特異性的IgM、IgG類(lèi)抗體，其中IgM類(lèi)抗體出現(xiàn)最早，檢測(cè)MP-IgM可作為早期感染的診斷指標(biāo)，但重癥感染及再感染者可能無(wú)此抗體產(chǎn)生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)肺炎支原體核酸及耐藥突變的引物、探針、方法及試劑盒，解決現(xiàn)有技術(shù)中培養(yǎng)法是檢測(cè)肺炎支原體耗時(shí)長(zhǎng)、生長(zhǎng)條件苛刻、檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確的技術(shù)問(wèn)題。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)肺炎支原體核酸及耐藥突變的引物和探針，檢測(cè)肺炎支原體特異性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，檢測(cè)肺炎支原體特異性P1基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2063(A/G)基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2064(A/G)基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；檢測(cè)內(nèi)標(biāo)基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：12～13所示，檢測(cè)內(nèi)標(biāo)基因int的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示。

一種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)肺炎支原體核酸及耐藥突變的方法，包括：

樣本核酸制備，以獲得核酸模板；

分別針對(duì)肺炎支原體特異性P1基因、2063(A/G)基因、2064(A/G)基因、內(nèi)標(biāo)基因int設(shè)計(jì)特異性引物和熒光標(biāo)記探針，其中，檢測(cè)肺炎支原體特異性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，檢測(cè)肺炎支原體特異性P1基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2063(A/G)基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2064(A/G)基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；檢測(cè)內(nèi)標(biāo)基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：12～13所示，檢測(cè)內(nèi)標(biāo)基因int的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示；

取陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品置于離心管中，分別加入核酸抽提液充分混勻，并進(jìn)行加熱和離心處理，取上清液用于熒光PCR檢測(cè)；

配置酶試劑，其中，所述酶試劑由水生棲熱菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合組成；

將P1基因PCR檢測(cè)混合液與酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心混勻；將2063(A/G)基因PCR檢測(cè)混合液與酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心處理；將2064(A/G)基因PCR檢測(cè)混合液與酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心處理

分別取加酶混勻后的PCR檢測(cè)混合液置于熒光PCR管中，取樣本核酸抽提上清液、陰性對(duì)照品核酸抽提上清液、陽(yáng)性對(duì)照品核酸抽提上清液和內(nèi)標(biāo)加入已有PCR檢測(cè)混合液的熒光PCR管中，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：37℃×2min，94℃×2min，循環(huán)1次；93℃×15s，60℃×30s，循環(huán)40次；單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60℃，并在此采集熒光信號(hào)，所述內(nèi)標(biāo)為含有內(nèi)標(biāo)int基因片段的質(zhì)粒；

對(duì)于P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因，采用熒光PCR儀上的FAM通道進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)于int基因，采用熒光PCR儀上的VIC通道進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)熒光定量PCR儀所收集數(shù)據(jù)確定檢測(cè)位點(diǎn)的基因型。

一種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)肺炎支原體核酸及耐藥突變的試劑盒，包括核酸抽提液、第一引物探針混合液、第二引物探針混合液、第三引物探針混合液、PCR反應(yīng)酶系、內(nèi)標(biāo)、陰性對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品和分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中，所述第一引物探針混合液由脫氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、P1基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針、內(nèi)標(biāo)基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針組成；所述第二引物探針混合液由脫氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、2063(A/G)基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針、內(nèi)標(biāo)基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針組成；所述第三引物探針混合液由脫氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、2064(A/G)基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針、內(nèi)標(biāo)基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針組成。

其中，檢測(cè)肺炎支原體特異性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，檢測(cè)肺炎支原體特異性P1基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2063(A/G)基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2064(A/G)基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；檢測(cè)內(nèi)標(biāo)基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：12～13所示，檢測(cè)內(nèi)標(biāo)基因int的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示。

本發(fā)明的有益效果為：采用Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR法，分別針對(duì)肺炎支原體特異性P1基因、23S rRNA基因耐藥突變基因(2063A/G，2064A/G)、內(nèi)標(biāo)核酸設(shè)計(jì)引物和熒光標(biāo)記探針，通過(guò)PCR反應(yīng)檢測(cè)熒光信號(hào)，擴(kuò)增曲線(xiàn)結(jié)合CT值判斷檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)目的基因的檢測(cè)。本發(fā)明具有準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，能夠?qū)ρ适米訕颖局械姆窝字гw及耐藥突變位點(diǎn)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例四的肺炎支原體感染樣本的熒光定量PCR曲線(xiàn)圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例四的2063(A/G)突變陽(yáng)性樣本的熒光定量PCR曲線(xiàn)圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例四的2064(A/G)突變陽(yáng)性樣本的熒光定量PCR曲線(xiàn)圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

實(shí)施例一

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)肺炎支原體核酸及耐藥突變的引物和探針，檢測(cè)肺炎支原體特異性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，檢測(cè)肺炎支原體特異性P1基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2063(A/G)基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2064(A/G)基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；檢測(cè)內(nèi)標(biāo)基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：12～13所示，檢測(cè)內(nèi)標(biāo)基因int的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示；

其中，P1基因設(shè)計(jì)的特異性引物的序列如下：

上游引物P-P1-F：5’-TAAGTTCGTTGGTAGGGAAC-3’

下游引物P-P1-R：5’-CAACCTGAACTTAGTAGCGCAA-3’

針對(duì)P1基因的TaqMan熒光標(biāo)記探針序列如下：

T-P1：5’-FAM-ATGGGTGATACCGCT-MGB-3’

針對(duì)2063(A/G)基因設(shè)計(jì)的特異性引物的序列如下：

上游引物P-23S-F：5’-ATCCAGGTACGGGTGAAGAC-3’

下游引物P-23S-R：5’-CGCATCAACAAGTCCTAGCGAA-3’

針對(duì)2063(A/G)基因的TaqMan熒光標(biāo)記探針序列如下：

T-2063(A/G)：5’-FAM-CGGGACGGGAAGAC-MGB-3’

針對(duì)2064(A/G)基因的特異性引物與2063(A/G)基因的特異性引物相同，針對(duì)2064(A/G)基因的TaqMan熒光標(biāo)記探針序列如下：

T-2064(A/G)：5’-FAM-GACGGAGAGACCCC-MGB-3’

int基因設(shè)計(jì)的特異性引物的序列如下：

上游引物P-int-F：5’-CCACACGACTCTCGGCAAC-3’

下游引物P-int-R：5’-TCGATGGTTCACGGGATTCT-3’

針對(duì)int基因的TaqMan熒光標(biāo)記探針序列如下：

T-int：5’-VIC-CTCGGCTCTCGCATC-MGB-3’

P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因探針的核苷酸序列5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，3’端標(biāo)記MGB基團(tuán)；int基因探針的核苷酸序列5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為VIC，3’端標(biāo)記MGB基團(tuán)。

實(shí)施例二

本發(fā)明實(shí)施例中又提供了一種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)肺炎支原體核酸及耐藥突變的方法，包括：

步驟101、樣本核酸制備，以獲得核酸模板；

步驟102、分別針對(duì)肺炎支原體特異性P1基因、2063(A/G)基因、2064(A/G)基因、內(nèi)標(biāo)基因int設(shè)計(jì)特異性引物和熒光標(biāo)記探針；

其中，檢測(cè)肺炎支原體特異性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，檢測(cè)肺炎支原體特異性P1基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2063(A/G)基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2064(A/G)基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；檢測(cè)內(nèi)標(biāo)基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：12～13所示，檢測(cè)內(nèi)標(biāo)基因int的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示；

本發(fā)明實(shí)施例中的內(nèi)標(biāo)基因(internal amplification control，int)，是鑒別儀器故障、試劑因素、聚合酶活性因素或樣本中存在抑制物等造成的結(jié)果不理想的原因。水稻核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1基因與目的基因同源性極低，可以選取該基因片段作為內(nèi)標(biāo)。對(duì)P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，選取保守片段分別設(shè)計(jì)針對(duì)這3個(gè)基因的特異性引物和熒光標(biāo)記探針。

步驟103、取陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品置于離心管中，分別加入核酸抽提液充分混勻，并進(jìn)行加熱和離心處理，取上清液用于熒光PCR檢測(cè)；

步驟104、配置酶試劑；

其中，所述酶由水生棲熱菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合組成；

步驟105、將P1基因PCR檢測(cè)混合液與酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心混勻；將2063(A/G)基因PCR檢測(cè)混合液與酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心處理；將2064(A/G)基因PCR檢測(cè)混合液與酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心處理；

步驟106、分別取加酶混勻后的PCR檢測(cè)混合液置于熒光PCR管中，取樣本核酸抽提上清液、陰性對(duì)照品核酸抽提上清液、陽(yáng)性對(duì)照品核酸抽提上清液和內(nèi)標(biāo)加入已有PCR檢測(cè)混合液的熒光PCR管中，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增；

其中，反應(yīng)條件為：37℃×2min，94℃×2min，循環(huán)1次；93℃×15s，60℃×30s，循環(huán)40次；單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60℃，并在此采集熒光信號(hào)，所述內(nèi)標(biāo)為含有內(nèi)標(biāo)int基因片段的質(zhì)粒；

步驟107、對(duì)于P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因，采用熒光PCR儀上的FAM通道進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)于int基因，采用熒光PCR儀上的VIC通道進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)熒光定量PCR儀所收集數(shù)據(jù)確定檢測(cè)位點(diǎn)的基因型。

其中，檢測(cè)結(jié)果根據(jù)C_T值進(jìn)行判定，儀器FAM通道C_T欄顯示Undet.同時(shí)VIC通道C_T值≤35，表示檢測(cè)樣品低于檢測(cè)限，報(bào)告為陰性；待檢樣品在FAM通道、VIC通道C_T值均≤35，檢測(cè)結(jié)果報(bào)告為陽(yáng)性；待檢樣品FAM通道C_T顯示在35～40之間，VIC通道C_T值≤35，需重復(fù)測(cè)定，F(xiàn)AM通道C_T顯示仍在35～40之間，且擴(kuò)增曲線(xiàn)呈S型，則判斷為陽(yáng)性；若擴(kuò)增結(jié)果為一直線(xiàn)，則判斷為陰性。

本發(fā)明采用Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法。NCBI blast同源性比對(duì)肺炎支原體特異性P1基因、耐藥突變位點(diǎn)2063(A/G)、2064(A/G)、內(nèi)標(biāo)int基因，選取P1、2063(A/G)、2064(A/G)、int基因保守片段設(shè)計(jì)引物和熒光標(biāo)記探針。P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因探針5’端標(biāo)記FAM熒光素為熒光報(bào)告基團(tuán)(用R表示)，3’端標(biāo)記MGB基團(tuán)(用Q表示)；int基因設(shè)計(jì)的探針5’端標(biāo)記VIC熒光素為熒光報(bào)告基團(tuán)(用R表示)，3’端標(biāo)記MGB基團(tuán)(用Q表示)，Q基團(tuán)能在近距離吸收R基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)。PCR反應(yīng)進(jìn)入退火階段時(shí)，探針先與模板結(jié)合，隨后引物模板結(jié)合，此時(shí)探針上R基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被Q基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到熒光信號(hào)；當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時(shí)，Taq DNA聚合酶5’→3’外切酶將探針降解，探針上的R基團(tuán)游離出來(lái)，Q基團(tuán)無(wú)法吸收R基團(tuán)發(fā)出的的熒光信號(hào)，檢測(cè)器能檢測(cè)到熒光信號(hào)。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR產(chǎn)物的增加與熒光信號(hào)的增長(zhǎng)呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系。通過(guò)熒光信號(hào)增長(zhǎng)曲線(xiàn)，實(shí)現(xiàn)目的基因的檢測(cè)。

實(shí)施例三

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)肺炎支原體核酸及耐藥突變的試劑盒，包括核酸抽提液、第一引物探針混合液、第二引物探針混合液、第三引物探針混合液、PCR反應(yīng)酶系、內(nèi)標(biāo)、陰性對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品和分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中，所述第一引物探針混合液由脫氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、P1基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針組成、內(nèi)標(biāo)基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針組成；所述第二引物探針混合液由脫氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、2063(A/G)基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針、內(nèi)標(biāo)基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針組成；所述第三引物探針混合液由脫氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、2064(A/G)基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針、內(nèi)標(biāo)基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針組成。

其中，檢測(cè)肺炎支原體特異性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，檢測(cè)肺炎支原體特異性P1基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2063(A/G)基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)2064(A/G)基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；檢測(cè)內(nèi)標(biāo)基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：12～13所示，檢測(cè)內(nèi)標(biāo)基因int的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示。

所述核酸抽提液由3％(M/V)Chelex-100、1％(V/V)Tris-HCl，1M，pH9.0組成。

所述第一引物探針混合液、所述第二引物探針混合液和所述第三引物探針混合液分別由2μL 10×PCR Buffer、2μL25mmol/LMgCl₂、3.4μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.8μL 10μmol/L目的基因引物、0.2μL 10μmol/L目的基因探針、0.4μL 10μmol/L內(nèi)標(biāo)基因引物、0.2μL 10μmol/L內(nèi)標(biāo)基因探針和5.75μL滅菌純化水組成。

PCR反應(yīng)酶系由5U/μL Taq DNA聚合酶和1U/μL UNG酶按體積比3∶2比例混合組成。

PCR擴(kuò)增的條件為：37℃×2min，94℃×2min，循環(huán)1次；93℃×15s，60℃×30s，循環(huán)40次；單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60℃，對(duì)于P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因，采用熒光PCR儀上的FAM通道進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)于int基因，采用熒光PCR儀上的VIC通道進(jìn)行擴(kuò)增。

所述陽(yáng)性對(duì)照品為含有滅活的E-P1、E-23S(2063A/G)、E-23S(2064A/G)菌的混合液，菌濃度為10⁵CFU/mL；陰性對(duì)照品為含有滅活的大腸桿菌溶液，菌濃度為10⁵CFU/mL，其中，E-P1為含有P1基因片段的工程菌，E-23S(2063A/G)為含有23S(2063A/G)基因片段的工程菌，E-23S(2064A/G)為含有23S(2064A/G)基因片段的工程菌。

本試劑盒具有準(zhǔn)確率高，臨床試驗(yàn)結(jié)果與DNA測(cè)序結(jié)果總符合率99％以上；特異性強(qiáng)，與咽拭子中常見(jiàn)致病菌肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、單純皰疹病毒、衣原體均無(wú)交叉反應(yīng)；靈敏度高，按照質(zhì)?？截悢?shù)確定的最低檢測(cè)限為10³copies/mL，按照菌培養(yǎng)法確定的最低檢測(cè)限為10³CFU/mL。本產(chǎn)品用于體外定性檢測(cè)人咽拭子樣本中肺炎支原體特異性P1基因及耐藥突變位點(diǎn)2063(A/G)和2064(A/G)基因。為臨床確定肺炎支原體感染及其耐藥突變提供輔助診斷方法，為臨床醫(yī)生用藥提供參考。

實(shí)施例四

本實(shí)施例結(jié)合具體檢測(cè)案例說(shuō)明本發(fā)明的具體應(yīng)用方式，首先收集人痰液和咽拭子樣，采用發(fā)明實(shí)施例三中提供的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果符合率。

1、樣本核酸制備

(1)痰液：取痰液加入2倍體積的4％NaOH(自備)，搖勻，室溫下放置30min液化，12,000rpm 5min。沉淀加無(wú)菌生理鹽水1mL打勻，12,000rpm 5min；去盡上清，沉淀中直接加入50μL核酸抽提液，充分混勻，98℃ 10min(誤差不超過(guò)1min)。12,000rpm 5min，取上清2μL做PCR反應(yīng)。

(2)咽拭子：取1mL樣本，12,000rpm 2min；棄去上清，沉淀中直接加入50μL核酸抽提液，充分混勻，98℃ 10min(誤差不超過(guò)1min)。12,000rpm 5min，取上清2μL做PCR反應(yīng)。

2、對(duì)照品準(zhǔn)備

取陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品各50μL分別置于1.5mL(或0.5mL)離心管中(凍存試劑融化后振蕩混勻10sec)，分別加入核酸抽提液50μL充分混勻，98℃ 10min，然后12,000rpm 5min，取上清2μL做PCR反應(yīng)。

3、酶試劑配制

取n×16μL肺炎支原體P1基因PCR檢測(cè)混合液與n×0.2μL酶(水生棲熱菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心混勻數(shù)秒；取n×16μL 23S核糖體RNA基因耐藥突變(2063A/G)PCR檢測(cè)混合液與n×0.2μL酶(水生棲熱菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心混勻數(shù)秒；取n×16μL 23S核糖體RNA基因耐藥突變(2064A/G)PCR檢測(cè)混合液與n×0.2μL酶(水生棲熱菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心混勻數(shù)秒。

4、加樣

分別取上述混合液16μL置于PCR管中，然后將樣本、陰性對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品的處理上清液各2μL分別加入各個(gè)已有混合液的PCR管中，同時(shí)分別向樣本、陰性對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品PCR管中加入2μL內(nèi)標(biāo)，蓋好管蓋，立即進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

5、PCR擴(kuò)增

反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀上，推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

37℃×2min，94℃×2min，循環(huán)1次；93℃×15sec，60℃×30s，循環(huán)40次；單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60℃，反應(yīng)體系為20μL。

熒光通道檢測(cè)選擇：P1基因、2063(A/G)、2064(A/G)選用FAM通道，內(nèi)標(biāo)基因選用VIC通道。

6、結(jié)果判定

檢測(cè)結(jié)束后，基線(xiàn)調(diào)整取6-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值設(shè)定原則以閾值線(xiàn)剛好超過(guò)陰性對(duì)照品檢測(cè)熒光曲線(xiàn)的最高點(diǎn)。儀器FAM通道C_T欄顯示Undet.同時(shí)VIC通道C_T值≤35，表示檢測(cè)樣品低于檢測(cè)限，報(bào)告為陰性；待檢樣品在FAM通道、VIC通道C_T值均≤35，檢測(cè)結(jié)果報(bào)告為陽(yáng)性；待檢樣品FAM通道C_T顯示在35～40之間，VIC通道C_T值≤35，需重復(fù)測(cè)定，F(xiàn)AM通道C_T顯示仍在35～40之間，且擴(kuò)增曲線(xiàn)呈S型，則判斷為陽(yáng)性；若擴(kuò)增結(jié)果為一直線(xiàn)，則判斷為陰性。

7、檢測(cè)結(jié)果檢驗(yàn)

本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果與細(xì)菌培養(yǎng)鑒定與藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致，熒光PCR檢測(cè)結(jié)果如圖1-3所示，圖1為肺炎支原體感染樣本的熒光定量PCR曲線(xiàn)圖，可見(jiàn)隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，P1基因?qū)?yīng)的PCR產(chǎn)物與熒光信號(hào)的增長(zhǎng)呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系，可判斷P1基因?yàn)殛?yáng)性，2063(A/G)基因和2064(A/G)基因?yàn)殛幮?。圖2為2063(A/G)突變陽(yáng)性樣本的熒光定量PCR曲線(xiàn)圖，可判斷P1基因和2063(A/G)基因均為陽(yáng)性，2064(A/G)基因?yàn)殛幮?。圖3為2064(A/G)突變陽(yáng)性樣本的熒光定量PCR曲線(xiàn)圖，可判斷P1基因和2064(A/G)基因均為陽(yáng)性，2063(A/G)基因?yàn)殛幮浴?/p>

以上對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時(shí)，對(duì)于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實(shí)施方式及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，綜上所述，本說(shuō)明書(shū)內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。