本發(fā)明涉及用于對暴露(exposure)于顆粒物2.5(PM2.5)進(jìn)行鑒別的微RNA(microRNA)及使用該微RNA進(jìn)行鑒別的方法。
背景技術(shù)：
：最近，微RNA(miR、miRNA)上升為參與基因表達(dá)調(diào)控的重要的調(diào)控RNA。此類小的非編碼RNA分子(通常由18-24個(gè)核苷酸組成)可通過參與RNA降解、mRNA翻譯和基因轉(zhuǎn)錄來調(diào)控蛋白表達(dá)模式。所述微RNA調(diào)控多種生物過程，例如發(fā)育、分化、細(xì)胞增殖、應(yīng)激應(yīng)答等。已知高等真核生物包含約1000種微RNA。微RNA由RNA聚合酶II(polII)或RNA聚合酶III(polIII；Qi，P.等，Cell.Mol.Immunol.3，411-419，2006)轉(zhuǎn)錄，可由各miRNA基因的此類轉(zhuǎn)錄物、編碼蛋白的基因的內(nèi)含子或多順反子編碼的緊密相關(guān)的miRNA誘導(dǎo)。借助RNApolII或polIII進(jìn)行的miRNA基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生長度為數(shù)千個(gè)核苷酸的第一轉(zhuǎn)錄物，該第一轉(zhuǎn)錄物被稱為初級miRNA轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)。在細(xì)胞核中，由RNase和Drosha對pri-miRNA進(jìn)行加工，生成由70-100個(gè)核苷酸構(gòu)成的發(fā)卡類型的pre-miRNA。一旦轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中，由dicer對發(fā)卡pre-miRNA進(jìn)行再次加工，生成雙鏈miRNA。成熟miRNA鏈混入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中。隨后，成熟miRNA在RISC中通過堿基對互補(bǔ)與靶mRNA結(jié)合。當(dāng)miRNA堿基對與mRNA靶標(biāo)完美匹配時(shí)(非常罕見)，促進(jìn)mRNA降解。一般而言，miRNA與靶mRNA形成不完全的異源雙鏈，這影響mRNA翻譯。miRNA機(jī)制對癌癥發(fā)展、細(xì)胞衰老和器官生長等具有重要影響。因此，對miRNA的研究不僅對于研究癌癥發(fā)展、衰老及其對人類壽命的影響而言是重要的，還應(yīng)用在對使用干細(xì)胞的細(xì)胞治療產(chǎn)品進(jìn)行篩選、以及發(fā)育、分化的研究中，這表明miRNA可作為韓國生物研究的核心靶標(biāo)。因此，微RNA標(biāo)志物的篩選對于包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的預(yù)測或早期診斷而言將是非常有幫助的。大家還認(rèn)為，微RNA標(biāo)志物對于預(yù)測暴露于特定的環(huán)境有害物質(zhì)而言將是有用的。直到最近，研究主要關(guān)注于由暴露于環(huán)境有害物質(zhì)誘導(dǎo)的mRNA的改變，以及改變的mRNA與疾病的關(guān)聯(lián)。根據(jù)最近提出并引人關(guān)注的微RNA與疾病的牽連，研究了暴露于有害物質(zhì)(例如苯、砷或RDX)的情況下微RNA的表達(dá)模式。其結(jié)果是，表達(dá)模式呈靶標(biāo)特異性改變的微RNA及其靶基因已被提議作為所述有害物質(zhì)的標(biāo)志物(Baccarelli，A.和Bollati，V.Curr.Opin.Prediatr.，21，243-251，2009)。所鑒別的微RNA不僅是用于對暴露進(jìn)行預(yù)測的標(biāo)志物，還是能夠調(diào)控靶基因表達(dá)的基因表達(dá)調(diào)控子，表明微RNA也可有利地作為對由環(huán)境有害物質(zhì)導(dǎo)致的毒性進(jìn)行預(yù)測的標(biāo)志物。雖然微RNA在對暴露于環(huán)境有害物質(zhì)及由此所導(dǎo)致的毒性進(jìn)行預(yù)測方面起到重要作用，對微RNA的研究還局限于利用微RNA開發(fā)疾病診斷的標(biāo)志物。特別地，還未對當(dāng)暴露于環(huán)境物質(zhì)(例如由自然和環(huán)境來源產(chǎn)生、且一直存在而使暴露持續(xù)的顆粒物)時(shí)作為改變主體的微RNA表達(dá)模式進(jìn)行透徹研究。表觀遺傳改變并不像遺傳修飾(如基因表達(dá)模式改變)那樣廣泛。因此，與需要大量標(biāo)志物的基因表達(dá)譜相比，表觀遺傳標(biāo)志物(例如微RNA或DNA甲基化)可簡單地利用僅一個(gè)標(biāo)志物來促進(jìn)對暴露于有害物質(zhì)的早期鑒別，并且對于非侵入性方法而言是有利的。各微RNA調(diào)控多個(gè)靶基因。在高等真核生物中存在上千個(gè)微RNA。因此，預(yù)期存在大量可被微RNA調(diào)控的潛在循環(huán)通路(cycles)。尺寸為10μm(1μm＝0.001mm)以下的灰塵被稱為顆粒物。由燃料燃燒人為產(chǎn)生的顆粒物大致分為兩組：直徑10μm以下為PM10，直徑2.5μm以下為PM2.5，PM2.5被稱為細(xì)顆粒物。一般而言，可能對人類造成嚴(yán)重危害的PM2.5是由燃料燃燒產(chǎn)生的。鍋爐、汽車和電廠也為主要來源。從建筑工地和道路彌散的灰塵也構(gòu)成PM2.5的一大部分。由于PM2.5的尺寸更小，在空氣中移動(dòng)速度更快。據(jù)推測，1/3的PM2.5來自于遠(yuǎn)距離遷移，1/3由本地直接產(chǎn)生，1/3歸因于空氣中的反應(yīng)。由于PM2.5具有2.5μm以下的直徑，極難通過肉眼分辨。PM2.5能夠深入侵入肺泡。PM2.5主要通過呼吸被吸入人體內(nèi)。PM2.5由燃料燃燒產(chǎn)生，因此，特別是在制造業(yè)工廠、交通繁忙的道路和電廠等處，暴 露于PM2.5的風(fēng)險(xiǎn)很高。PM2.5是以呼吸系統(tǒng)為途徑誘發(fā)肺病的物質(zhì)之一。由于顆粒非常小，PM2.5可不被鼻黏膜過濾而侵入肺泡，長時(shí)間暴露于PM2.5可能是多種疾病(包括哮喘、過敏(atopy)和肺癌等)的原因，從而可能增加早逝率。由于該風(fēng)險(xiǎn)，根據(jù)室內(nèi)空氣質(zhì)量管理法，對于PM2.5而言，新公寓式住宅的室內(nèi)空氣質(zhì)量的環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格限制在年平均值為25μg/m3以下且日平均值為50μg/m3以下。最近涌現(xiàn)的報(bào)道指出，PM2.5顯著威脅我們的健康，因而新環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)(年平均值25μg/m3)從2015年生效。由于PM2.5具有細(xì)顆粒物的特征(例如高流動(dòng)性；并且，取決于地區(qū)，分布、濃度和組成具有高度的多樣性和差異)，韓國關(guān)于PM2.5污染水平的記錄信息不足。韓國環(huán)境部迫切地進(jìn)行調(diào)查，試圖通過收集PM2.5的遠(yuǎn)距離遷移性以及區(qū)域組成的差別方面的信息(特別關(guān)注于產(chǎn)生大量PM2.5的設(shè)施)來提供有效的計(jì)劃。雖然一些研究報(bào)道了PM10對人的毒性、PM10的組成及PM10造成的基因表達(dá)模式改變，對PM2.5的研究目前僅局限于其組成。雖然對人而言PM2.5具有潛在風(fēng)險(xiǎn)，對PM2.5的風(fēng)險(xiǎn)評估數(shù)據(jù)仍然不足，對健康益處(假定WHO推薦的PM2.5濃度滿足空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，該健康益處由改良PM2.5濃度所實(shí)現(xiàn)的過早死亡的降低而產(chǎn)生)進(jìn)行計(jì)算的分析方法仍然存在不確定性和局限性。因此，非常迫切地需要通過使用微陣列芯片或借助引物的實(shí)時(shí)PCR來對人類風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行快速評估，以開發(fā)出對人類毒性以及參與多種疾病發(fā)展(特別包括癌癥)的微RNA的表達(dá)模式進(jìn)行篩選的分子標(biāo)志物；并非常迫切地需要基于在小鼠模型中對PM2.5暴露進(jìn)行評估的方法，利用所述標(biāo)志物制定和管理針對暴露于PM2.5的合適對策。自1997年微RNA首次被鑒別以來，已快速鑒別了哺乳動(dòng)物和微生物中的大量微RNA，并已報(bào)告至SangermiRBASE數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/index.shtml)?；谝呀⒌奈NA數(shù)據(jù)，采用一次即可對數(shù)千基因的表達(dá)同時(shí)進(jìn)行分析的微陣列實(shí)施的基因組范圍的 表達(dá)研究(Schena，M等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，93，10614-10619，1996)正在進(jìn)行，以揭示基因功能。通過將cDNA(互補(bǔ)DNA)或20-25個(gè)堿基對長度的寡核苷酸組整合在玻璃上來制備微陣列。學(xué)?；蚬?包括Agilent或GenomicSolutions)的實(shí)驗(yàn)室已通過將cDNA集合機(jī)械固定在芯片上或利用噴墨(inkjetting)制備了cDNA微陣列(SellheyerK.等，J.Am.Acad.Dermatol.，51，681-692，2004)。由AffymetrixCo.制備的寡核苷酸微陣列使用了借助光刻(photolithography)直接在芯片上合成寡核苷酸的方法。由AgilentCo.制備的寡核苷酸微陣列利用了將預(yù)先合成的寡核苷酸固定在芯片上的方法(Sellheyer，K.等，J.Am.Acad.Dermatol.，51，681-692，2004)。為分析基因表達(dá)，將獲得自樣品(例如組織)的微RNA與微陣列上的寡核苷酸雜交。用熒光或同位素對獲得的微RNA進(jìn)行標(biāo)記。借助于毒理基因組學(xué)(使用DNA微陣列的先進(jìn)技術(shù))，能夠?qū)τ苫瘜W(xué)品(包括藥物和新候選藥物以及污染物)誘導(dǎo)的特定組織或細(xì)胞系中表達(dá)的微RNA的表達(dá)模式進(jìn)行定量和高通量分析。因此，現(xiàn)在能夠通過對細(xì)胞特異性的微RNA表達(dá)進(jìn)行分析來對與藥物的副作用和污染物的人類毒性特異性相關(guān)的基因進(jìn)行鑒別，從而理解藥物的作用和副作用以及污染物毒性的分子機(jī)制，并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對造成毒性和副作用的物質(zhì)進(jìn)行篩選和鑒別。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明人使用寡核苷酸微陣列來對PM2.5微RNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，所述寡核苷酸微陣列上整合有用于檢測1,247個(gè)小鼠微RNA的探針；肺組織樣品取自暴露于兩種不同類型PM2.5(水溶性和有機(jī)可溶性(organicsoluble))的小鼠，隨后對微RNA的表達(dá)模式進(jìn)行分析。其結(jié)果是，發(fā)明人鑒別了在暴露于兩種不同類型的PM2.5的小鼠中表達(dá)均改變的微RNA。隨后，本發(fā)明人確定了用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的生物標(biāo)志物以及使用該生物標(biāo)志物對所述暴露進(jìn)行鑒別的方法，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供微陣列芯片在對暴露于顆粒物2.5(PM2.5)進(jìn)行鑒別方面的用途，所述微陣列芯片上整合有如下微RNA (miRNA)的cDNA：微RNA登記號(miRbase)MIMAT0017342(Mm-miR-1943-3p)。本發(fā)明的另一目的在于提供試劑盒在對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別方面的用途，所述試劑盒包含與如下微RNA的cDNA或所述cDNA的互補(bǔ)鏈分子互補(bǔ)并能夠擴(kuò)增所述cDNA的引物：微RNA登記號(miRbase)MIMAT0017342(Mm-miR-1943-3p)。本發(fā)明的又一目的在于提供用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的方法，所述方法包含如下步驟：1)從獲得自實(shí)驗(yàn)受試者的體細(xì)胞以及獲得自對照正常受試者的體細(xì)胞分離RNA；2)用不同熒光物質(zhì)標(biāo)記步驟1)的獲得自實(shí)驗(yàn)組和對照的各RNA；3)將步驟2)的標(biāo)記有熒光物質(zhì)的RNA與微RNA微陣列芯片雜交；4)對步驟3)中反應(yīng)的微RNA微陣列芯片進(jìn)行分析；以及5)利用步驟4)中分析的數(shù)據(jù)，對實(shí)驗(yàn)組和對照中Mm-miR-1943-3p的表達(dá)進(jìn)行比較。本發(fā)明的再一目的在于提供用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的方法，所述方法包含如下步驟：1)從獲得自實(shí)驗(yàn)受試者的體細(xì)胞以及獲得自對照正常受試者的體細(xì)胞分離RNA；2)從實(shí)驗(yàn)組的各RNA和對照的各RNA合成cDNA；3)使用能夠擴(kuò)增Mm-miR-1943-3p的cDNA的引物，利用步驟2)的實(shí)驗(yàn)組和對照的cDNA進(jìn)行RT-PCR(實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))；以及4)對步驟3)的實(shí)驗(yàn)組和對照的擴(kuò)增產(chǎn)物的表達(dá)進(jìn)行比較。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了微陣列芯片在對暴露于顆粒物2.5(PM2.5)進(jìn)行鑒別方面的用途，所述微陣列芯片上整合有如下微RNA(miRNA)的cDNA：微RNA登記號(miRbase)MIMAT0017342(Mm-miR-1943-3p)。本發(fā)明還提供了試劑盒在對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別方面的用途，所 述試劑盒包含與如下微RNA的cDNA或所述cDNA的互補(bǔ)鏈分子互補(bǔ)并能夠擴(kuò)增所述cDNA的引物：微RNA登記號(miRbase)MIMAT0017342(Mm-miR-1943-3p)。本發(fā)明還提供了用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的方法，所述方法包含如下步驟：1)從獲得自實(shí)驗(yàn)受試者的體細(xì)胞以及獲得自對照正常受試者的體細(xì)胞分離RNA；2)用不同熒光物質(zhì)標(biāo)記步驟1)的獲得自實(shí)驗(yàn)組和對照的各RNA；3)將步驟2)的標(biāo)記有熒光物質(zhì)的RNA與微RNA微陣列芯片雜交；4)對步驟3)中反應(yīng)的微RNA微陣列芯片進(jìn)行分析；以及5)利用步驟4)中分析的數(shù)據(jù)，對實(shí)驗(yàn)組和對照中Mm-miR-1943-3p的表達(dá)進(jìn)行比較。此外，本發(fā)明提供了用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的方法，所述方法包含如下步驟：1)從獲得自實(shí)驗(yàn)受試者的體細(xì)胞以及獲得自對照正常受試者的體細(xì)胞分離RNA；2)從實(shí)驗(yàn)組的各RNA和對照的各RNA合成cDNA；3)使用能夠擴(kuò)增Mm-miR-1943-3p的cDNA的引物，利用步驟2)的實(shí)驗(yàn)組和對照的cDNA進(jìn)行RT-PCR(實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))；以及4)對步驟3)的實(shí)驗(yàn)組和對照的擴(kuò)增產(chǎn)物的表達(dá)進(jìn)行比較。有益效果用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的生物標(biāo)志物(所述生物標(biāo)志物的表達(dá)模式在暴露于兩種不同類型的PM2.5(水溶性或有機(jī)可溶性)時(shí)均發(fā)生改變)以及使用該生物標(biāo)志物對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的方法對于監(jiān)測和評估PM2.5風(fēng)險(xiǎn)而言是有用的，這是由于它們使用了由微RNA微陣列芯片選出的僅有的反應(yīng)性微RNA生物標(biāo)志物，從而，它們可作為研究PM2.5毒性機(jī)制的有用工具。附圖說明參照附圖來最好地理解本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的應(yīng)用，其中：圖1為示出從環(huán)境提取水溶性提取物和有機(jī)可溶性提取物的提取過程的圖表。圖2為示出利用微RNA微陣列芯片實(shí)施的、對暴露于PM2.5的小鼠肺組織樣品的微RNA表達(dá)模式進(jìn)行分析的結(jié)果的圖。具體實(shí)施方式下面對本發(fā)明進(jìn)行具體說明。本發(fā)明提供了用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的生物標(biāo)志物，所述生物標(biāo)志物的表達(dá)在暴露于兩種不同類型的PM2.5(水溶性或有機(jī)可溶性)時(shí)均發(fā)生改變。所述生物標(biāo)志物優(yōu)選由此類微RNA組成：在暴露于PM2.5時(shí)，所述微RNA的表達(dá)上調(diào)至少1.3倍或下調(diào)至少1.3倍。微RNA登記號(miRbase)MIMAT0017342(Mm-miR-1943-3p)(SEQ.ID.NO：1)。所述微RNA的序列由CAGGUGCCAGCUCCUCCCUUC組成。本文的PM2.5優(yōu)選為PM2.5水溶性提取物或PM2.5有機(jī)可溶性提取物。本文的顆粒物優(yōu)選為直徑在2.5μm以下(包括超細(xì)顆粒物(UFP))，更優(yōu)選直徑為0.1-2.5μm，但不總是限于此。優(yōu)選通過包含如下步驟的方法制備顆粒物提取物，但不總是限于此：1)收集尺寸在2.5μm以下的顆粒物；2)使用提取溶劑提取步驟1)中收集的顆粒物；以及3)對步驟2)中獲得的提取物進(jìn)行過濾。在上述方法中，步驟2)的提取溶劑優(yōu)選為水、醇、二氯甲烷或以上溶劑的混合物。本文的水優(yōu)選為純凈水(purifiedwater)或蒸餾水，更優(yōu)選為經(jīng)三次蒸餾的水。本文的醇優(yōu)選為C1-C2低級醇，本文的低級醇優(yōu)選為乙醇或甲醇。該提取方法優(yōu)選使用超聲發(fā)生器和高容量空氣采樣器(highvolumeairsampler)，但不總是限于此。超聲發(fā)生器的運(yùn)行時(shí)間優(yōu)選為20-60分鐘，更優(yōu)選為30分鐘，但不總是限于此。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，利用PM2.5提取物對BALB/C小鼠模型進(jìn)行處理。隨后，從小鼠肺組織提取包含微RNA的總RNA，并用熒光物質(zhì)(Cy3)進(jìn)行標(biāo)記。在將熒光標(biāo)記的微RNA與微陣列芯片進(jìn)行雜交后，掃描熒光圖像以研究基因表達(dá)模式。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組的信號強(qiáng)度與對照的信號強(qiáng)度之比為至少1.3倍差異時(shí)，認(rèn)為基因表達(dá)升高。所選擇的由于PM2.5水溶性提取物或PM2.5有機(jī)可溶性提取物而顯示出過表達(dá)的微RNA如下所示：微RNA登記號(miRbase)MIMAT0017342(Mm-miR-1943-3p)(SEQ.ID.NO：1)。因此，證實(shí)了本發(fā)明的生物標(biāo)志物為由于PM2.5而特異性過表達(dá)的微RNA。因此，本發(fā)明的生物標(biāo)志物可為對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別、監(jiān)測PM2.5、評估PM2.5風(fēng)險(xiǎn)、以及研究PM2.5毒性機(jī)制的有效工具。本發(fā)明還提供了用于對暴露于PM2.5進(jìn)行特異性鑒別的微RNA微陣列芯片，所述微RNA微陣列芯片上合成/整合了包含所述生物標(biāo)志物微RNA的cDNA的部分或全部序列的寡核苷酸。所述寡核苷酸包含所述生物標(biāo)志物微RNA的cDNA的15-20個(gè)核苷酸?？衫帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的傳統(tǒng)方法制備本發(fā)明的用于鑒別PM2.5的微RNA微陣列芯片。用于制備微陣列芯片的方法優(yōu)選為將篩選的生物標(biāo)志物的cDNA固定在芯片上作為微RNA分子的探針的噴墨法，更優(yōu)選為sureprint噴墨微墨滴微陣列(sureprintinkjetmicrodroppingmicroarray)，但不總是限于此。DNA微陣列芯片的支撐板(board)優(yōu)選涂覆有選自于由如下活性基團(tuán)所組成的組中的活性基團(tuán)之一：環(huán)氧化物(epoxy)、氨基硅烷、聚-L-賴氨酸和醛，但不總是限于此。芯片支撐板優(yōu)選選自于由如下材料所組成的組：載玻片、塑料、金屬、硅、尼龍膜和硝化纖維素膜，更優(yōu)選為涂覆有環(huán)氧化物的載玻片，但不總是限于此。本發(fā)明還提供了微RNA微陣列芯片在對暴露于PM2.5進(jìn)行特異性鑒別方面的用途，所述微RNA微陣列芯片上合成/整合了包含所述生物 標(biāo)志物微RNA的cDNA的部分或全部序列的寡核苷酸。所述寡核苷酸包含所述生物標(biāo)志物微RNA的cDNA的15-20個(gè)核苷酸。可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的傳統(tǒng)方法制備本發(fā)明的用于鑒別PM2.5的微RNA微陣列芯片。用于制備微陣列芯片的方法優(yōu)選為將篩選的生物標(biāo)志物的cDNA固定在芯片上作為微RNA分子的探針的噴墨法，更優(yōu)選為sureprint噴墨微墨滴微陣列，但不總是限于此。DNA微陣列芯片的支撐板優(yōu)選涂覆有選自于由如下活性基團(tuán)所組成的組中的活性基團(tuán)之一：環(huán)氧化物、氨基硅烷、聚-L-賴氨酸和醛，但不總是限于此。芯片支撐板優(yōu)選選自于由如下材料所組成的組：載玻片、塑料、金屬、硅、尼龍膜和硝化纖維素膜，更優(yōu)選為涂覆有環(huán)氧化物的載玻片，但不總是限于此。本發(fā)明的微RNA微陣列芯片能夠檢測由于PM2.5而特異性地上調(diào)或下調(diào)的miRNA，從而能夠作為對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別、監(jiān)測PM2.5、評估PM2.5風(fēng)險(xiǎn)、以及研究PM2.5毒性機(jī)制的有用工具。本發(fā)明還提供了利用所述微陣列芯片對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的方法。本發(fā)明還提供了用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的方法，所述方法包含如下步驟：1)從獲得自實(shí)驗(yàn)受試者的體細(xì)胞以及獲得自對照正常受試者的體細(xì)胞分離RNA；2)用不同熒光物質(zhì)標(biāo)記步驟1)的獲得自實(shí)驗(yàn)組和對照的各RNA；3)將步驟2)的標(biāo)記有熒光物質(zhì)的RNA與微RNA微陣列芯片雜交；4)對步驟3)中反應(yīng)的微RNA微陣列芯片進(jìn)行分析；以及5)利用步驟4)中分析的數(shù)據(jù)，對實(shí)驗(yàn)組和對照中Mm-miR-1943-3p的表達(dá)進(jìn)行比較。在用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的上述方法中，步驟1)的體細(xì)胞樣品優(yōu)選獲得自暴露或未暴露于PM2.5的各小鼠組。在用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的上述方法中，步驟2)的熒光物質(zhì)優(yōu)選選自于由如下物質(zhì)所組成的組：Cy3、Cy5、FITC(聚L-賴氨酸-異硫氰酸熒光素)、RITC(羅丹明-B-異硫氰酸鹽)以及羅丹明，但不總是限于此，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的任何熒光物質(zhì)。在用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的上述方法中，步驟5)的微RNA微陣列芯片優(yōu)選為小鼠miRNA8×60K(Rel19.0)(Agilent，USA)，但不總是限于此。可使用能夠檢測表達(dá)模式在兩種不同PM2.5(見表1)作用下均發(fā)生改變的微RNA的任何微陣列芯片，然而本發(fā)明人構(gòu)建的微RNA微陣列芯片是最優(yōu)選的。在上述方法的步驟4)中，優(yōu)選使用GeneSpringGX12.6.1軟件(Agilent，USA)，但不總是限于此，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的任何分析軟件。本發(fā)明中鑒別miRNA表達(dá)的方法使用了便于對由PM2.5特異性誘導(dǎo)的微RNA的下調(diào)或上調(diào)進(jìn)行鑒別的微RNA微陣列芯片，從而，本發(fā)明的方法能夠作為對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別、監(jiān)測PM2.5、評估PM2.5風(fēng)險(xiǎn)、以及研究PM2.5毒性機(jī)制的有用工具。本發(fā)明提供了用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的試劑盒，所述試劑盒包含所述微陣列芯片。本發(fā)明的用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的試劑盒還可包含小鼠肺細(xì)胞或組織。本發(fā)明的用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的試劑盒還包含與如下微RNA的cDNA或所述cDNA的互補(bǔ)鏈分子互補(bǔ)并能夠擴(kuò)增所述cDNA的引物：微RNA登記號(miRbase)MIMAT0017342(Mm-miR-1943-3p)。小鼠模型肺組織樣品優(yōu)選獲得自暴露或未暴露于PM2.5的小鼠組。所述試劑盒還可包含熒光物質(zhì)。本文的熒光物質(zhì)優(yōu)選選自于由如下物質(zhì)所組成的組：鏈霉親和素樣磷酸酶綴合物、化學(xué)熒光物質(zhì)和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，但不總是限于此。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用Cy3。所述試劑盒還可包含反應(yīng)試劑，此時(shí)，所述反應(yīng)試劑優(yōu)選由雜交緩 沖液、標(biāo)記試劑(例如熒光素染料的化學(xué)誘導(dǎo)劑)和洗滌緩沖液組成，但不總是限于此，可包括本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的對于微RNA微陣列芯片雜交所必需的任何反應(yīng)試劑。因此，證實(shí)了本發(fā)明的試劑盒包含由于PM2.5而特異性地過表達(dá)的微RNA，從而能夠作為對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別、監(jiān)測PM2.5、評估PM2.5風(fēng)險(xiǎn)、以及研究PM2.5毒性機(jī)制的有效工具。本發(fā)明還提供了所述試劑盒在對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別方面的用途，所述試劑盒包含所述微陣列芯片。本發(fā)明的用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的試劑盒還可包含小鼠肺細(xì)胞或組織。本發(fā)明的用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的試劑盒還包含與如下微RNA的cDNA或所述cDNA的互補(bǔ)鏈分子互補(bǔ)并能夠擴(kuò)增所述cDNA的引物：微RNA登記號(miRbase)MIMAT0017342(Mm-miR-1943-3p)。小鼠模型肺組織樣品優(yōu)選獲得自暴露或未暴露于PM2.5的小鼠組。所述試劑盒還可包含熒光物質(zhì)。本文的熒光物質(zhì)優(yōu)選選自于由如下物質(zhì)所組成的組：鏈霉親和素樣磷酸酶綴合物、化學(xué)熒光物質(zhì)和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，但不總是限于此。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用Cy3。所述試劑盒還可包含反應(yīng)試劑，此時(shí)，所述反應(yīng)試劑優(yōu)選由雜交緩沖液、標(biāo)記試劑(例如熒光素染料的化學(xué)誘導(dǎo)劑)和洗滌緩沖液組成，但不總是限于此，可包括本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的對于微RNA微陣列芯片雜交所必需的任何反應(yīng)試劑。因此，證實(shí)了本發(fā)明的試劑盒包含由于PM2.5而特異性地過表達(dá)的微RNA，從而能夠作為對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別、監(jiān)測PM2.5、評估PM2.5風(fēng)險(xiǎn)、以及研究PM2.5毒性機(jī)制的有效工具。此外，本發(fā)明還提供了用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的方法，所述方法包含如下步驟：1)從獲得自實(shí)驗(yàn)受試者的體細(xì)胞以及獲得自對照正常受試者的體細(xì) 胞分離RNA；2)從實(shí)驗(yàn)組的各RNA和對照的各RNA合成cDNA；3)使用能夠擴(kuò)增Mm-miR-1943-3p的cDNA的引物，利用步驟2)的實(shí)驗(yàn)組和對照的cDNA進(jìn)行RT-PCR(實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))；以及4)對步驟3)的實(shí)驗(yàn)組和對照的擴(kuò)增產(chǎn)物的表達(dá)進(jìn)行比較。在上述方法中，步驟1)的體細(xì)胞特別地為小鼠肺細(xì)胞或組織。利用本發(fā)明的微RNA和cDNA，通過比較擴(kuò)增產(chǎn)物的表達(dá)來對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的方法使用了對研究由于PM2.5而特異性上調(diào)或下調(diào)的微RNA的分布而言有用的微陣列芯片，從而能夠被有效地用作對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別、監(jiān)測PM2.5、評估PM2.5風(fēng)險(xiǎn)、以及研究PM2.5毒性機(jī)制的工具。以下實(shí)施例中示出的本發(fā)明的實(shí)用和目前優(yōu)選的實(shí)施方式是說明性的。然而，將理解的是，在考慮了本公開內(nèi)容的基礎(chǔ)之上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)作出變化和改進(jìn)。實(shí)施例實(shí)施例1：PM2.5的收集和提取<1-1>收集地點(diǎn)的選擇為了篩選用于對暴露于PM2.5進(jìn)行鑒別的生物標(biāo)志物，選擇韓國科學(xué)技術(shù)研究所(KIST)體育館(Hawolgok-dong，Sungbuk-gu，首爾)的屋頂作為收集PM2.5的收集地點(diǎn)，該體育館臨近位于城北區(qū)(Sungbuk-gu)的Wolgok站附近的Naebu高速路，該處交通流量高達(dá)十一月時(shí)工作日平均70,000輛汽車經(jīng)過、十二月時(shí)工作日平均69,000輛汽車經(jīng)過(2011)。對于體外測試，需要相當(dāng)大量的PM2.5。由于低容量空氣采樣器運(yùn)行24小時(shí)僅能夠獲得數(shù)mg的PM2.5，低容量空氣采樣器不適于PM2.5的收集。因此，對于PM2.5的體外測試，使用高容量空氣采樣器，以便于收集高容量的顆粒物。通過使用僅允許PM2.5通過的涂覆有特氟龍(teflon)的玻璃纖維濾器，使得超過2.5μm的顆粒物由于質(zhì)量慣性(weightinertia)而被油阻止，PM2.5專一性入口(TischInstrument公司)收集到PM2.5。<1-2>收集濾器對于高容量空氣采樣器，選擇不允許大于8×10英寸的任何顆粒通過的涂覆有特氟龍的玻璃纖維濾器。用蒸餾水(18.2MΩ)和二氯甲烷作為提取溶劑。為使水分(moisture)造成的誤差最小化，在干燥器中將濾器完全干燥48小時(shí)。隨后，使用高精度天平(MettlerToledo公司)對濾器進(jìn)行稱重，該高精度天平能夠稱量至0.1mg的重量。將濾器以內(nèi)側(cè)彼此面對的方式對折，放入避光密封的帶拉鏈的袋子。將處于帶拉鏈的袋子中的濾器儲(chǔ)存于-80℃。當(dāng)需要將其轉(zhuǎn)移至收集地點(diǎn)時(shí)，用冰盒攜帶。為了收集PM2.5，維持合適的流速(1.13m3/min±10％)。<1-3>收集時(shí)間使用高容量空氣采樣器對PM2.5收集5個(gè)月。第一次收集在2011年11月11日完成，最后一次收集(第50次收集)在2012年3月28日完成。排除在雨天濾器顯示出20μg/m3以下的空氣PM濃度的情況。將總共10個(gè)濾器分至同一組中，并準(zhǔn)備好了總共5組濾器。<1-4>對收集的顆粒物進(jìn)行提取為對收集的PM2.5的組成進(jìn)行分析，將一片濾器分為兩半。分別將用于提取水溶性成分的超純水(蒸餾水)和用于提取有機(jī)可溶性成分的二氯甲烷加入至各半片濾器。由此，通過提取過程制備了PM2.5水溶性提取物和PM2.5有機(jī)可溶性提取物(圖1)。實(shí)施例2：PM2.5暴露模型的選擇以及小鼠肺組織樣品的獲取<2-1>PM2.5暴露模型PM2.5是空氣中的懸浮顆粒物，是環(huán)境有害物質(zhì)中的一種。一旦顆粒物進(jìn)入肺，將誘發(fā)典型的顆粒誘導(dǎo)型炎癥。根據(jù)之前的報(bào)道，將BALB/C模型用于測量此類應(yīng)答具有高靈敏度。BALB/C易于感染慢性肺炎，并對輻射具有高敏感性。這種動(dòng)物比較馴服和溫順，并顯示較低的乳腺癌發(fā)病率。因此，最終選定該動(dòng)物作為合適的模型。具體而言，將<實(shí)施例1>中收集的PM2.5分為兩個(gè)不同的組，即水溶性組和有機(jī)可溶性組。也將小鼠模型分為兩組，其中一組暴露于 PM2.5，另一組未暴露于PM2.5。暴露組暴露于低劑量的PM2.5或高劑量的PM2.5。因此，準(zhǔn)備了總共6組，包括未暴露組和暴露于不同劑量的PM2.5的暴露組(表1)。[表1]PM2.5暴露劑量和小鼠分組實(shí)驗(yàn)組劑量(μg)數(shù)量(BALB/C)對照024低劑量2024高劑量16424<2-2>確定用于小鼠模型暴露的PM2.5劑量在研究BALB/C小鼠模型暴露于PM2.5的在先研究中，確定了暴露劑量基于絕對量為不超過100μg。通過參考之前報(bào)道的研究方法和結(jié)果(HansHedrich，Thelaboratorymouse，2004)、小鼠死亡率和分布在真實(shí)環(huán)境中的PM2.5的濃度等，本發(fā)明人用所選的三種不同的PM濃度(0μg(對照)、20μg(低劑量)和164μg(高劑量))進(jìn)行暴露測試(表2)。對于暴露方法，優(yōu)選PM2.5被吸入。然而，當(dāng)PM2.5確實(shí)被吸入時(shí)，幾乎不可能將所有不同的小鼠等同地暴露于所期望的PM2.5濃度。因此，將收集的兩組PM2.5制成液相，將其直接經(jīng)由BALB/C小鼠模型的氣道插入(氣管滴注)。各組暴露劑量的計(jì)算示于下方。各小鼠組的PM2.5劑量的計(jì)算小鼠的每分鐘呼吸容量(ml)＝33.5-47.5ml/min小鼠的每周呼吸容量(ml)＝337,680-478,800ml/周暴露于20μg的劑量：20μg/337,680ml＝0.0000592277μg/ml20μg/478,800ml＝0.0000417711μg/mlPM2.5的每日大氣環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)：50μg/m3人的每分鐘呼吸容量(ml)＝6000ml人的每周呼吸容量(ml)＝6000×60分鐘×24小時(shí)×7天 ＝60,480,000ml＝60m3暴露于25μg/m3-50μg/m3的濃度一周：25μg/m3×60m3/60,480,000ml＝0.0000248016μg/ml50μg/m3×60m3/60,480,000ml＝0.0000496032μg/ml因此，當(dāng)將小鼠暴露于20μg劑量的PM2.5時(shí)，所計(jì)算的值為(41-59)×10-6μg/ml，通過將該劑量與采用針對人類的PM2.5大氣環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)獲得的暴露劑量(24-49)×10-6μg/ml進(jìn)行比較，判定該劑量為可施用劑量。該低劑量的原因在于將細(xì)胞毒性最小化，以避免任何可能的遺傳轉(zhuǎn)變(即使未觀察到組織病理學(xué)改變)。在164μg的劑量下，預(yù)期具有細(xì)胞毒性和組織病理學(xué)改變。此外，還預(yù)期發(fā)生遺傳修飾。因此，認(rèn)為這是暴露的高劑量。<2-3>肺組織樣品利用BALB/C小鼠模型所做實(shí)驗(yàn)的最首要的目的在于有效提取高品質(zhì)的包含微RNA的總RNA。為實(shí)現(xiàn)該目的，獲得無損傷的肺組織樣品。在對肺組織樣品進(jìn)行提取后，將其儲(chǔ)存在Allprotect溶液(Qiagen)中，該溶液可使其在-20℃避光儲(chǔ)存6個(gè)月，在-80℃避光儲(chǔ)存1年。使用前在-80℃儲(chǔ)存該肺組織樣品。實(shí)施例3：微陣列測定<3-1>靶微RNA的分離和熒光物質(zhì)標(biāo)記使用trizol從PM2.5暴露組和PM2.5未暴露組的血樣提取RNA。使用RNeasyMini試劑盒(CatNO.74106，Qiagen)對提取的RNA進(jìn)行純化。在RNA純化過程中，使用不含RNase的DNaseSet(Qiagen，USA)去除基因組DNA。用NanoDropND1000分光光度計(jì)(NanoDropTechnologiesInc.，USA)測量各總RNA的濃度。使用Agilent2100生物分析儀測量RNA的品質(zhì)。<3-2>標(biāo)記的微RNA的制備對于寡核苷酸微陣列測定，用熒光物質(zhì)標(biāo)記獲得自實(shí)施例<3-1>的PM2.5暴露組和PM2.5未暴露組的總RNA。按照制造商方案，使用miRNA 完全標(biāo)記及雜交試劑盒(Agilent)實(shí)施所述標(biāo)記。將獲得的總RNA(100ng)與0.4μl10×CIP緩沖液、1.1μl不含核酸酶的水以及0.5μl小牛腸磷酸酶混合，隨后37℃反應(yīng)30分鐘。隨后在其中加入2.8μl100％DMSO，隨后100℃反應(yīng)5-10分鐘。立即將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至冰上。對于標(biāo)記，在上述混合物中加入1μl10×T4連接酶緩沖液、3μlcyanine-3-pCp和0.5μlT4RNA連接酶，隨后16℃反應(yīng)2小時(shí)。使用microbio-spin6柱將標(biāo)記的樣品純化。在55℃的真空濃縮器中將純化的RNA完全干燥，隨后將其溶解于18μl不含核酸酶的水中。在獲得的溶液中加入4.5μl10×GE封閉劑，在其中加入22.5μl2×Hi-RPM雜交緩沖液。所制備的樣品在100℃反應(yīng)5分鐘，隨后再次立刻轉(zhuǎn)移至冰上，然后反應(yīng)5分鐘。隨后將該樣品用于下一步的雜交。<3-3>雜交按照EBIOGENInc.的說明進(jìn)行雜交和洗滌過程。雜交在55℃誘導(dǎo)20小時(shí)。將小鼠miRNA8×60K(Rel19.0)(Agilent，USA)用作DNA微陣列芯片。<3-4>熒光圖像的獲取使用AgilentC掃描儀(Agilenttechnologies，USA)掃描玻片上的雜交圖像。使用AgilentGeneSpringGX12.6.1(Agilenttechnologies)對提取數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，隨后研究各微RNA的表達(dá)模式。其結(jié)果是，如圖2所示，使用GeneSpringGX12.6.1軟件，在寡核苷酸芯片上研究了約1,247個(gè)微RNA的表達(dá)模式，對暴露組和未暴露組之間的微RNA表達(dá)模式進(jìn)行了比較(圖2)。其結(jié)果是，僅有一種微RNA被確認(rèn)為與正常表達(dá)水平相比上調(diào)了至少1.3倍。同時(shí)，在四種情況下，所述微RNA的表達(dá)均未被下調(diào)(表2)。沒有報(bào)道提及上述微RNA與將小鼠模型暴露于PM2.5時(shí)觀察到的毒性相關(guān)。[表2]因暴露于PM2.5而引起表達(dá)改變的微RNA本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解的是，可容易地將在以上描述中公開的構(gòu)思和具體實(shí)施方式用作修改或設(shè)計(jì)其它實(shí)施方式的基礎(chǔ)，以實(shí)現(xiàn)與本發(fā)明相同的目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解的是，此類等同實(shí)施方式并未背離如所附權(quán)利要求書中闡明的本發(fā)明的精神和范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3