本發(fā)明涉及一種用于食管癌易感基因檢測(cè)的試劑盒。
背景技術(shù)：
食管癌是發(fā)生在食管上皮組織的惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的2％。全世界每年約有20萬(wàn)人死于食管癌，我國(guó)是食管癌高發(fā)區(qū)，因食管癌死亡者僅次于胃癌居第二位，發(fā)病年齡多在40歲以上，男性多于女性，但近年來(lái)40歲以下發(fā)病者有增長(zhǎng)趨勢(shì)。食管癌的發(fā)生與亞硝胺慢性刺激、炎癥與創(chuàng)傷，遺傳因素以及飲水、糧食和蔬菜中的微量元素含量有關(guān)。
基因測(cè)序是一種新型基因檢測(cè)技術(shù)，能夠從血液或唾液中分析測(cè)定基因全序列，預(yù)測(cè)罹患多種疾病的可能性，從而實(shí)現(xiàn)提前預(yù)防和治療。
中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200810039260.4提供了一種檢測(cè)食管癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)細(xì)胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)、細(xì)胞色素P450 2E1基因(CYP2E1)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶M1基因(GSTM1)、5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)、還原型輔酶I醌類(lèi)氧化還原酶基因(NQ01)、腫瘤蛋白53基因(P53)、X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1(XRCC1)、著色性干皮病互補(bǔ)組A基因(XPA)上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、熒光定量PCR常規(guī)組件、PCR反應(yīng)組件等。
上述技術(shù)方案的缺陷在于，相關(guān)基因的獨(dú)立性差，存在連鎖不平衡。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于食管癌易感基因檢測(cè)的試劑盒，以及其檢測(cè)結(jié)果的評(píng)估方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種用于食管癌易感基因檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒包括：
針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10052657的引物，以及
針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2274223的引物。
本發(fā)明的試劑盒通過(guò)檢測(cè)與食管癌發(fā)生密切相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，來(lái)評(píng)估受試者食管癌患病風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并最終根據(jù)每個(gè)受試者的基因檢測(cè)結(jié)果，從基因?qū)用嬷笇?dǎo)受試者有針對(duì)性地預(yù)防和早期診斷食管癌，降低食管癌的發(fā)病率，進(jìn)行早期治療，提高生存率。
本發(fā)明所選取的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在亞洲人群中具有顯著相關(guān)性，并且彼此獨(dú)立，不存在連鎖不平衡，因此本發(fā)明的位點(diǎn)選擇具有代表性、獨(dú)立性和風(fēng)險(xiǎn)值可積累性。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs4785204的引物。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10052657的引物包括：
rs10052657上游引物：AAGGCTCTTAATGGGAAACC(SEQ ID NO:19)；
rs10052657下游引物：ATGCATCGCACATTAATACC(SEQ ID NO:20)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2274223的引物包括：
rs2274223上游引物：GGTGACTTTGATCCCTTTTG(SEQ ID NO:21)；
rs2274223下游引物：CATCCATCACCTAGCTACAAC(SEQ ID NO:22)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs4785204的引物包括：
rs4785204上游引物：TTCAGTAGTACCTGGATTGA(SEQ ID NO:23)；
rs4785204下游引物：GATGAAATAAGAGCTTCTACC(SEQ ID NO:24)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs738722的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs738722的引物包括，例如， rs738722上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG(SEQ ID NO:1)；rs738722下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG(SEQ ID NO:2)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10058728的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10058728的引物包括，例如，rs10058728上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT(SEQ ID NO:3)；rs10058728下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT(SEQ ID NO:4)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9288520的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9288520的引物包括，例如，rs9288520上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC(SEQ ID NO:5)；rs9288520下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC(SEQ ID NO:6)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs17761864的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs17761864的引物包括，例如，rs17761864上游引物：AGGCATGTGCTACTGTGT(SEQ ID NO:7)；rs17761864下游引物：CACCCAATATTTTCTTTAGACT(SEQ ID NO:8)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2847281的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2847281的引物包括，例如，rs2847281上游引物：TGGTCCTTGCCTCCTTGT(SEQ ID NO:9)；rs2847281下游引物：TCATTGGGTATTTCCTCTACAC(SEQ ID NO:10)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs6503659的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs8030672的引物包括，例如，rs8030672上游引物：CGTCAAAGTGCAGAAATCAG(SEQ ID NO:11)；rs8030672下游引物：CAGCTCAGAACTCAGAGACTC(SEQ ID NO:12)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10484761的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10484761的引物包括，例如，rs10484761上游引物：TGCAACGCTGTTAGAAGT(SEQ ID NO:13)；rs10484761下游引物：TCTTGTCTCTATTCACTATTCC(SEQ ID NO:14)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位 點(diǎn)rs2239612的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2239612的引物包括，例如，rs2239612上游引物：TGGTCACACAGCGTCATCAT(SEQ ID NO:15)；rs2239612下游引物：CATTGGCTGATTGATGGAGT(SEQ ID NO:16)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs6503659的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs6503659的引物包括，例如，rs6503659上游引物：GCTCACTGGGTTTGCTTC(SEQ ID NO:17)；rs6503659下游引物：CAAGGCAGGCTCAGATACTA(SEQ ID NO:18)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2014300的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2014300的引物包括，例如，rs2014300上游引物：TCACCATGAAGACGGCAA(SEQ ID NO:25)；rs2014300下游引物：CATTCATAACAGTCCCTGTCTG(SEQ ID NO:26)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2074356的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2074356的引物包括，例如，rs2074356上游引物：TCAGGAGAGACTCATCTAATG(SEQ ID NO:27)；rs2074356下游引物：ATCAGGGAACAGTGAGAGAC(SEQ ID NO:28)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs1229984的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs1229984的引物包括，例如，rs1229984上游引物：GGAATAGTAGGGATTAGTAGC(SEQ ID NO:29)；rs1229984下游引物：AAATCCTGGATGGTGAAC(SEQ ID NO:30)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒的組分和含量包括：PCR反應(yīng)體系、PCR產(chǎn)物純化體系、測(cè)序反應(yīng)體系。其中，前述引物屬于PCR反應(yīng)體系；PCR產(chǎn)物純化體系用于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化；測(cè)序反應(yīng)體系用于DNA測(cè)序，進(jìn)而確定單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。例如，PCR反應(yīng)體系包括10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5ul；25mM dNTP混合液0.2ul；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul；20uM引物對(duì)，每條引物0.25ul；ddH2O 19.175ul。例如，PCR產(chǎn)物純化體系包括：1U/ul SAP酶0.75ul；10U/ul ExoI酶0.375ul；ddH2O 3.875ul。例如，測(cè)序反應(yīng)體系包括：25％BigDye mix lul；3.2uM DNA測(cè)序引物1ul；125mM EDTA溶液1ul；100％ 乙醇溶液15ul；70％乙醇溶液30ul；HIDI溶液8ul；ddH20 2ul。值得注意的是，這里的DNA測(cè)序引物可為現(xiàn)有技術(shù)已公開(kāi)或披露的多種引物，在此不再贅述。
另一方面，本發(fā)明提供了上述試劑盒的檢測(cè)結(jié)果的評(píng)估方法，其包括如下步驟：
A、將單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10052657、rs2274223、rs4785204的不同基因型進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)度賦值；
B、提取受檢者的DNA；
C、使用以下引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：
(1)rs10052657上游引物：AAGGCTCTTAATGGGAAACC；
rs10052657下游引物：ATGCATCGCACATTAATACC；
(2)rs2274223上游引物：GGTGACTTTGATCCCTTTTG；
rs2274223下游引物：CATCCATCACCTAGCTACAAC；
(3)rs4785204上游引物：TTCAGTAGTACCTGGATTGA；
rs4785204下游引物：GATGAAATAAGAGCTTCTACC；
D、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化；
E、DNA測(cè)序，確定單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10052657、rs2274223、rs4785204的基因型；
F、根據(jù)步驟A，確定步驟E所測(cè)得的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10052657、rs2274223、rs4785204的基因型的風(fēng)險(xiǎn)值Risk(rs10052657)、Risk(rs2274223)、Risk(rs4785204)；
G、根據(jù)步驟F得到的三個(gè)風(fēng)險(xiǎn)值Risk(rs10052657)、Risk(rs2274223)、Risk(rs4785204)判斷受檢者的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別。
進(jìn)一步地，步驟G具體包括如下步驟：
G1、計(jì)算三個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的總風(fēng)險(xiǎn)值R，計(jì)算公式為
總風(fēng)險(xiǎn)值R＝Risk(rs10052657)×Risk(rs2274223)×Risk(rs4785204)；
G2、根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)判斷風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別：
總風(fēng)險(xiǎn)值R<0.78 風(fēng)險(xiǎn)較低
0.78≤總風(fēng)險(xiǎn)值R≤1.34 風(fēng)險(xiǎn)一般
總風(fēng)險(xiǎn)值R>1.34 風(fēng)險(xiǎn)較高。
本發(fā)明所采用的方法是口腔粘膜細(xì)胞采樣，無(wú)痛、無(wú)創(chuàng)、避免交叉感染。檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，方法易普及、推廣。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備如下有益效果：
本發(fā)明所選取的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在亞洲人群中具有顯著相關(guān)性，并且彼此獨(dú)立、不存在連鎖不平衡，因此本發(fā)明的位點(diǎn)選擇具有代表性、獨(dú)立性和風(fēng)險(xiǎn)值可積累性。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供了一種用于食管癌易感基因檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒包括：PCR反應(yīng)體系、PCR產(chǎn)物純化體系、測(cè)序反應(yīng)體系。
其中，PCR反應(yīng)體系包括如下引物：
(1)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10052657的引物：
rs10052657上游引物：AAGGCTCTTAATGGGAAACC(SEQ ID NO:19)；
rs10052657下游引物：ATGCATCGCACATTAATACC(SEQ ID NO:20)；
(2)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2274223的引物：
rs2274223上游引物：GGTGACTTTGATCCCTTTTG(SEQ ID NO:21)；
rs2274223下游引物：CATCCATCACCTAGCTACAAC(SEQ ID NO:22)；
(3)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs4785204的引物：
rs4785204上游引物：TTCAGTAGTACCTGGATTGA(SEQ ID NO:23)；
rs4785204下游引物：GATGAAATAAGAGCTTCTACC(SEQ ID NO:24)；
PCR反應(yīng)體系進(jìn)一步包括10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5ul；25mM dNTP混合液0.2ul；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul；20uM引物對(duì)，每條引物0.25ul；ddH2O19.175ul。
PCR產(chǎn)物純化體系用于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化，其包括：1U/ul SAP酶0.75ul； 10U/ul ExoI酶0.375ul；ddH2O 3.875ul。
測(cè)序反應(yīng)體系用于DNA測(cè)序，進(jìn)而確定單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，其包括：25％BigDye mix lul；3.2uM DNA測(cè)序引物1ul；125mM EDTA溶液1ul；100％乙醇溶液15ul；70％乙醇溶液30ul；HIDI溶液8ul；ddH20 2ul。
本實(shí)施例試劑盒的檢測(cè)結(jié)果的評(píng)估方法包括如下步驟：
A、將單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10052657、rs2274223、rs4785204的不同基因型進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)度賦值；具體風(fēng)險(xiǎn)值如表1所示，
表1
B、提取受檢者的DNA；
C、使用以下引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：
(1)rs10052657上游引物：AAGGCTCTTAATGGGAAACC；
rs10052657下游引物：ATGCATCGCACATTAATACC；
(2)rs2274223上游引物：GGTGACTTTGATCCCTTTTG；
rs2274223下游引物：CATCCATCACCTAGCTACAAC；
(3)rs4785204上游引物：TTCAGTAGTACCTGGATTGA；
rs4785204下游引物：GATGAAATAAGAGCTTCTACC；
D、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化；
E、DNA測(cè)序，確定單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10052657、rs2274223、rs4785204的基因型；
F、根據(jù)步驟A，確定步驟E所測(cè)得的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10052657、rs2274223、rs4785204的基因型的風(fēng)險(xiǎn)值Risk(rs10052657)、Risk(rs2274223)、Risk(rs4785204)；
G、根據(jù)步驟F得到的三個(gè)風(fēng)險(xiǎn)值Risk(rs10052657)、Risk(rs2274223)、 Risk(rs4785204)判斷受檢者的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別。步驟G具體包括如下步驟：
G1、計(jì)算三個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的總風(fēng)險(xiǎn)值R，計(jì)算公式為
總風(fēng)險(xiǎn)值R＝Risk(rs10052657)×Risk(rs2274223)×Risk(rs4785204)；
G2、根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)判斷風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別：
總風(fēng)險(xiǎn)值R<0.78 風(fēng)險(xiǎn)較低
0.78≤總風(fēng)險(xiǎn)值R≤1.34 風(fēng)險(xiǎn)一般
總風(fēng)險(xiǎn)值R>1.34 風(fēng)險(xiǎn)較高。
按照上述方法采集五個(gè)樣本，每個(gè)樣本各個(gè)位點(diǎn)的基因型及風(fēng)險(xiǎn)值、總風(fēng)險(xiǎn)值、風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別如表2所示，
表2
實(shí)施例2
本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于，PCR反應(yīng)體系包括如下引物，
(1)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs738722的引物：
rs738722上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG(SEQ ID NO:1)；
rs738722下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG(SEQ ID NO:2)；
(2)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10058728的引物：
rs10058728上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT(SEQ ID NO:3)；
rs10058728下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT(SEQ ID NO:4)；
(3)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9288520的引物：
rs9288520上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC(SEQ ID NO:5)；
rs9288520下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC(SEQ ID NO:6)；
(4)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs17761864的引物：
rs17761864上游引物：AGGCATGTGCTACTGTGT(SEQ ID NO:7)；
rs17761864下游引物：CACCCAATATTTTCTTTAGACT(SEQ ID NO:8)；
(5)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2847281的引物：
rs2847281上游引物：TGGTCCTTGCCTCCTTGT(SEQ ID NO:9)；
rs2847281下游引物：TCATTGGGTATTTCCTCTACAC(SEQ ID NO:10)；
(6)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs8030672的引物：
rs8030672上游引物：CGTCAAAGTGCAGAAATCAG(SEQ ID NO:11)；
rs8030672下游引物：CAGCTCAGAACTCAGAGACTC(SEQ ID NO:12)；
(7)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10484761的引物：
rs10484761上游引物：TGCAACGCTGTTAGAAGT(SEQ ID NO:13)；
rs10484761下游引物：TCTTGTCTCTATTCACTATTCC(SEQ ID NO:14)；
(8)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2239612的引物：
rs2239612上游引物：TGGTCACACAGCGTCATCAT(SEQ ID NO:15)；
rs2239612下游引物：CATTGGCTGATTGATGGAGT(SEQ ID NO:16)；
(9)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs6503659的引物：
rs6503659上游引物：GCTCACTGGGTTTGCTTC(SEQ ID NO:17)；
rs6503659下游引物：CAAGGCAGGCTCAGATACTA(SEQ ID NO:18)；
(10)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10052657的引物：
rs10052657上游引物：AAGGCTCTTAATGGGAAACC(SEQ ID NO:19)；
rs10052657下游引物：ATGCATCGCACATTAATACC(SEQ ID NO:20)；
(11)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2274223的引物：
rs2274223上游引物：GGTGACTTTGATCCCTTTTG(SEQ ID NO:21)；
rs2274223下游引物：CATCCATCACCTAGCTACAAC(SEQ ID NO:22)；
(12)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs4785204的引物：
rs4785204上游引物：TTCAGTAGTACCTGGATTGA(SEQ ID NO:23)；
rs4785204下游引物：GATGAAATAAGAGCTTCTACC(SEQ ID NO:24)；
(13)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2014300的引物：
rs2014300上游引物：TCACCATGAAGACGGCAA(SEQ ID NO:25)；
rs2014300下游引物：CATTCATAACAGTCCCTGTCTG(SEQ ID NO:26)；
(14)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2074356的引物：
rs2074356上游引物：TCAGGAGAGACTCATCTAATG(SEQ ID NO:27)；
rs2074356下游引物：ATCAGGGAACAGTGAGAGAC(SEQ ID NO:28)；
(15)針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs1229984的引物：
rs1229984上游引物：GGAATAGTAGGGATTAGTAGC(SEQ ID NO:29)；
rs1229984下游引物：AAATCCTGGATGGTGAAC(SEQ ID NO:30)。
本實(shí)施例試劑盒的檢測(cè)結(jié)果的評(píng)估方法包括如下步驟：
A、將每個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的不同基因型進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)度賦值，具體風(fēng)險(xiǎn)值如表3所示；
表3
B、提取受檢者的DNA；
C、使用以下引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：
(1)rs738722上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG(SEQ ID NO:1)；
rs738722下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG(SEQ ID NO:2)；
(2)rs10058728上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT(SEQ ID NO:3)；
rs10058728下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT(SEQ ID NO:4)；
(3)rs9288520上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC(SEQ ID NO:5)；
rs9288520下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC(SEQ ID NO:6)；
(4)rs17761864上游引物：AGGCATGTGCTACTGTGT(SEQ ID NO:7)；
rs17761864下游引物：CACCCAATATTTTCTTTAGACT(SEQ ID NO:8)；
(5)rs2847281上游引物：TGGTCCTTGCCTCCTTGT(SEQ ID NO:9)；
rs2847281下游引物：TCATTGGGTATTTCCTCTACAC(SEQ ID NO:10)；
(6)rs8030672上游引物：CGTCAAAGTGCAGAAATCAG(SEQ ID NO:11)；
rs8030672下游引物：CAGCTCAGAACTCAGAGACTC(SEQ ID NO:12)；
(7)rs10484761上游引物：TGCAACGCTGTTAGAAGT(SEQ ID NO:13)；
rs10484761下游引物：TCTTGTCTCTATTCACTATTCC(SEQ ID NO:14)；
(8)rs2239612上游引物：TGGTCACACAGCGTCATCAT(SEQ ID NO:15)；
rs2239612下游引物：CATTGGCTGATTGATGGAGT(SEQ ID NO:16)；
(9)rs6503659上游引物：GCTCACTGGGTTTGCTTC(SEQ ID NO:17)；
rs6503659下游引物：CAAGGCAGGCTCAGATACTA(SEQ ID NO:18)；
(10)rs10052657上游引物：AAGGCTCTTAATGGGAAACC(SEQ ID NO:19)；
rs10052657下游引物：ATGCATCGCACATTAATACC(SEQ ID NO:20)；
(11)rs2274223上游引物：GGTGACTTTGATCCCTTTTG(SEQ ID NO:21)；
rs2274223下游引物：CATCCATCACCTAGCTACAAC(SEQ ID NO:22)；
(12)rs4785204上游引物：TTCAGTAGTACCTGGATTGA(SEQ ID NO:23)；
rs4785204下游引物：GATGAAATAAGAGCTTCTACC(SEQ ID NO:24)；
(13)rs2014300上游引物：TCACCATGAAGACGGCAA(SEQ ID NO:25)；
rs2014300下游引物：CATTCATAACAGTCCCTGTCTG(SEQ ID NO:26)；
(14)rs2074356上游引物：TCAGGAGAGACTCATCTAATG(SEQ ID NO:27)；
rs2074356下游引物：ATCAGGGAACAGTGAGAGAC(SEQ ID NO:28)；
(15)rs1229984上游引物：GGAATAGTAGGGATTAGTAGC(SEQ ID NO:29)；
rs1229984下游引物：AAATCCTGGATGGTGAAC(SEQ ID NO:30)。
D、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化；
E、DNA測(cè)序，確定十五個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型；
F、根據(jù)步驟A，確定步驟E所測(cè)得的十五個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型的風(fēng)險(xiǎn)值Risk(rs738722)、Risk(rs10058728)、Risk(rs9288520)、Risk(rs17761864)、Risk(rs2847281)、Risk(rs8030672)、Risk(rs10484761)、Risk(rs2239612)、Risk(rs6503659)、Risk(rs10052657)、Risk(rs2274223)、Risk(rs4785204)、Risk(rs2014300)、Risk(rs2074356)、Risk(rs1229984)；
G、根據(jù)步驟F得到的十五個(gè)風(fēng)險(xiǎn)值判斷受檢者的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，其具體包括如下步驟：
G1、計(jì)算十五個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的總風(fēng)險(xiǎn)值R，計(jì)算公式為
總風(fēng)險(xiǎn)值R＝Risk(rs738722)×Risk(rs10058728)×Risk(rs9288520)×Risk(rs17761864)×Risk(rs2847281)×Risk(rs8030672)×Risk(rs10484761)×Risk(rs2239612)×Risk(rs6503659)×Risk(rs10052657)×Risk(rs2274223)×Risk(rs4785204)×Risk(rs2014300)×Risk(rs2074356)×Risk(rs1229984)；
G2、根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)判斷風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別：
總風(fēng)險(xiǎn)值R<0.57 風(fēng)險(xiǎn)較低
0.57≤總風(fēng)險(xiǎn)值R≤1.74 風(fēng)險(xiǎn)一般
總風(fēng)險(xiǎn)值R>1.74 風(fēng)險(xiǎn)較高。
按照上述方法采集五個(gè)樣本，每個(gè)樣本各個(gè)位點(diǎn)的基因型及風(fēng)險(xiǎn)值、總風(fēng)險(xiǎn)值、風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別如表4所示，
表4
雖然本發(fā)明以較佳實(shí)施例揭露如上，但并非用以限定本發(fā)明實(shí)施的范圍。任何本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的發(fā)明范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許的改進(jìn)，即凡是依照本發(fā)明所做的同等改進(jìn)，應(yīng)為本發(fā)明的范圍所涵蓋。