本發(fā)明涉及腫瘤類器官的培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種基于人食管癌組織用于體外培養(yǎng)食管癌腫瘤類器官的專用培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的2％。全世界每年約有20～30萬人死于食管癌。食管癌在我國消化系統(tǒng)腫瘤中應(yīng)該是排第一位的，在整個(gè)腫瘤排序中位次也很高，約四五位水平。與其他國家相比較，我國的食管癌發(fā)病率是比較高的，全球近一半的食管癌發(fā)生在中國。我國是食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，每年食管癌發(fā)病和死亡人數(shù)都占全球人數(shù)一半以上?？梢?，食管癌可以算做最具中國特色的惡性腫瘤之一。食管癌的發(fā)病與環(huán)境和遺傳因素有關(guān)，但確切原因和發(fā)病機(jī)制還不清楚。與胃癌，肝癌類似，由于西方國家的發(fā)病率相對(duì)較低，致使世界范圍內(nèi)食管癌的研究較其他西方高發(fā)的腫瘤落后。而作為我國發(fā)生率最高，致死率最高的幾種腫瘤之一，加強(qiáng)食管癌的發(fā)病機(jī)理研究和藥物研發(fā)有非常重大的現(xiàn)實(shí)意義。
現(xiàn)有的食管癌細(xì)胞系主要通過長(zhǎng)期培養(yǎng)，自發(fā)永生化或者轉(zhuǎn)染促使正常細(xì)胞永生化的癌基因獲得。例如Het-1A是一株由人正常食管上皮細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)染Sv40病毒的大T抗原，使細(xì)胞得到永生化而獲得。這些方法改變了細(xì)胞的遺傳背景，長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞系，也容易造成基因組不穩(wěn)定，可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞系的表型和體內(nèi)腫瘤細(xì)胞發(fā)生人為的改變，影響食管癌科學(xué)研究和藥法研發(fā)的準(zhǔn)確性。
之前的食管癌原代培養(yǎng)模式，把腫瘤細(xì)胞與其它細(xì)胞分離后，種植于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞失去了原有的微環(huán)境。因此細(xì)胞很難長(zhǎng)期穩(wěn)定培養(yǎng)。因此，在體外模擬腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境，提供腫瘤賴以生存的三維支撐和多種生存通路，有可能實(shí)現(xiàn)在體外長(zhǎng)期穩(wěn)定的培養(yǎng)腫瘤組織。
體外原代腫瘤細(xì)胞類器官的培養(yǎng)，需要提供模擬腫瘤在體內(nèi)的微環(huán)境。這些微環(huán)境包括維持三維立體培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)、維持生存重要通路的生長(zhǎng)因子、抑制細(xì)胞分化的因子、各種維生素、微量元素、激素、能量代謝、抗氧化因子、精細(xì)的化學(xué)同步信號(hào)和抗調(diào)亡物質(zhì)。每一種腫瘤類型，甚至不同的腫瘤細(xì)胞亞型，這些微環(huán)境因素都可能大不相同，因此，不同腫瘤類型的細(xì)胞原代類器官培養(yǎng)，需要針對(duì)這種腫瘤的類型，逐一優(yōu)化。
原有類器官培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用到人食管癌類器官培養(yǎng)有如下問題：第一代培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，需要2至6周才能完成第一代培養(yǎng)；傳代后類器官的活力迅速下降，生長(zhǎng)速度明顯減慢；凍存后復(fù)蘇效率低，容易死亡，活力降低，生長(zhǎng)速度減慢；培養(yǎng)的成功率不高，手術(shù)獲取的新鮮標(biāo)本不足60％；對(duì)于活檢標(biāo)本，原有類器官培養(yǎng)技術(shù)幾乎無法有效培養(yǎng)。
食管癌細(xì)胞的腫瘤類器官培養(yǎng)，使在小鼠和人干細(xì)胞類器官培養(yǎng)的條件基礎(chǔ)上，結(jié)合食管癌細(xì)胞的特點(diǎn)，進(jìn)一步優(yōu)化條件，以利用更小的組織，在更短的時(shí)間內(nèi)，獲得更好的細(xì)胞活力和更高的成功率。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于人食管癌組織用于體外培養(yǎng)食管癌腫瘤類器官的專用培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種基于人食管癌組織用于體外培養(yǎng)食管癌腫瘤類器官的專用培養(yǎng)基，所述專用培養(yǎng)基包括以下組分：
(1)受體酪氨酸激酶配體，
(2)Rho相關(guān)的卷曲蛋白激酶(ROCK1、ROCK2)抑制劑，
(3)維生素和激素，
(4)抗氧化劑，
(5)抑制細(xì)胞分化的通路的激動(dòng)劑。
優(yōu)選地，所述受體酪氨酸激酶配體包括人或動(dòng)物的表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、人或動(dòng)物肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和人或動(dòng)物堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)中的一種或多種。
優(yōu)選地，所述
人或動(dòng)物的表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度范圍為2ng/mL～100ng/mL；
人或動(dòng)物肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度范圍為10ng/mL～200ng/mL；
人或動(dòng)物堿性成纖維生長(zhǎng)因子的濃度范圍為5ng/mL～100ng/mL。
優(yōu)選地，所述Rho相關(guān)的卷曲蛋白激酶抑制劑包括Fasudil、Y-27632、RKI-1447和GSK429286A中的一種或多種。
優(yōu)選地，所述維生素和激素包括腐胺、腎上腺酮、煙酰胺和維生素A醋酸酯中的一種或多種。
優(yōu)選地，所述
腐胺的濃度范圍為0.1μg/mL～100μg/mL；
腎上腺酮的濃度范圍為10ng/mL～10μg/mL；
煙酰胺的濃度范圍為1μg/mL～2mg/mL；
維生素A醋酸酯的濃度范圍在10ng/mL～500ng/mL。
優(yōu)選地，所述抗氧化劑包括還原型谷胱甘肽(GSH)、維生素C、維生素E和β-巰基乙醇中的一種或多種。
優(yōu)選地，所述β-巰基乙醇的濃度范圍為0.01mM～1.5mM。
優(yōu)選地，所述抑制細(xì)胞分化的通路的激動(dòng)劑包括人激活素A蛋白、Wnt通路激動(dòng)劑、Hedgehog通路激動(dòng)劑中的一種或多種。
優(yōu)選地，所述
人激活素A(activin A)蛋白的濃度范圍為5ng/mL～200ng/mL；
Wnt通路激動(dòng)劑包括重組人或動(dòng)物的Wnt3a蛋白、重組人或動(dòng)物RSPO-1蛋白、GSK-3β抑制劑中的一種或多種；
Hedgehog通路激動(dòng)劑包括重組人或動(dòng)物SHH蛋白，SMO蛋白的激動(dòng)劑SAG中的一種或多種。
優(yōu)選地，所述專用培養(yǎng)基包括以下組分：
ECRM-I：DMEM/F12培養(yǎng)基，添加2.5％胎牛血清(FBS)、1x B27添加劑、抗壞血酸、維生素A醋酸酯、腎上腺酮、腐胺、煙酰胺、胰島素、氫化可的松、人激活素A、FGF2、Wnt3a、EGF、視黃酸和Y27632；或者
ECRM-II：DMEM/F12培養(yǎng)基，添加2.5％胎牛血清、1x B27添加劑、煙酰胺、腎上腺酮、BMP4、EGF、Wnt3a、IGF、丁酸鈉、腐胺、維生素A醋酸酯、胰島素、地塞米松、β-巰基乙醇、FGF2、人激活素A、視黃酸和Y27632；或者
ECRM-III：DMEM/F12培養(yǎng)基，添加1％牛血清白蛋白(BSA)、1x B27添加劑、過氧化氫霉、維生素A醋酸酯、煙酰胺、腎上腺酮、丁酸鈉、胰島素、地塞米松、腐胺、還原型谷胱甘肽、人激活素A、EGF、BMP4、FGF1、NOG、SAG、RSPO1、Wnt3a和Y27632；或者
EDM-1：DMEM/F12培養(yǎng)基，添加2.5％胎牛血清、1x B27添加劑、HGF、IGF、Wnt3a、EGF、人激活素A、腎上腺酮、維生素A醋酸酯、煙酰胺、胰島素、還原型谷胱甘肽。
一種利用基于人食管癌組織用于體外培養(yǎng)食管癌腫瘤類器官的專用培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)將新鮮獲取的食管癌標(biāo)本組織，用組織清洗液清洗；
(2)經(jīng)清洗后的食管癌標(biāo)本組織轉(zhuǎn)移入組織轉(zhuǎn)移液中，置于0到4攝氏度轉(zhuǎn)移或短期保存；
(3)從組織轉(zhuǎn)移液中取出組織塊，在組織清洗液中漂洗后，轉(zhuǎn)移到無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，吸掉多余液體；
(4)根據(jù)組織塊的大小，加入組織消化液，用滅菌剪反復(fù)剪碎組織；
(5)把剪碎的組織轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，繼續(xù)加入2～10mL組織消化液，清洗轉(zhuǎn)移培養(yǎng)皿中的腫瘤組織，并入無菌離心管中；
(6)將無菌離心管置于37攝氏度搖床中消化，不時(shí)取出觀察，消化到多以寡細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞為止；
(7)將無菌離心管中的懸浮液經(jīng)過70μm細(xì)胞篩網(wǎng)，濾過液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中；
(8)向50mL離心管中加入10～30mL PBS，100～300g離心2～5分鐘，棄上清，用10～30mL PBS重懸，再次100～300g離心2～5分鐘；
(9)小心地吸去離心管中的上清液，加入3～8mL食管癌腫瘤類器官的專用培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞；
(10)取50～200μL細(xì)胞懸液加入臺(tái)盼藍(lán)，用血小板計(jì)數(shù)器計(jì)算活細(xì)胞的數(shù)量；
(11)計(jì)數(shù)后的細(xì)胞懸液用食管癌腫瘤類器官的專用培養(yǎng)基進(jìn)行重懸調(diào)整細(xì)胞密度，加入細(xì)胞懸液0.1至1倍的4℃解凍的Matrigel；
(12)細(xì)胞懸液與Matrigel重懸后，接種于24孔板，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，15～30分鐘后，待Matrigel凝固，加入食管癌腫瘤類器官的專用培養(yǎng)基，隔天換液；
(13)4～10天后，食管癌類器官長(zhǎng)成多球體形狀，有上皮樣細(xì)胞層。
優(yōu)選地，步驟(1)和(3)所述組織清洗液的配制方法為：在生理鹽水或磷酸鹽緩沖液中加入500U/mL的青霉素、2.5μg/mL的兩性霉素B和500μg/mL的鏈霉素，過濾除菌。
優(yōu)選地，步驟(2)所述組織轉(zhuǎn)移液的配制方法為：在DMEM培養(yǎng)基中加入5％胎牛血清，再加入500U/mL的青霉素、2.5μg/mL的兩性霉素B和500μg/mL的鏈霉素。
優(yōu)選地，步驟(4)和(5)所述組織消化液的配制方法為：
EM-BS-1：在DMEM培養(yǎng)基中加入2.5％胎牛血清、1μg/mL～10μg/mL的IX型膠原、50μg/mL-500μg/mL的中性蛋白水解酶；或者
EM-BS-2：在DMEM培養(yǎng)基中加入2.5％胎牛血清、1x青霉素和鏈霉素、0.01mg/mL-1mg/mL的IV型膠原酶、0.001mg/mL～0.2mg/mL的透明質(zhì)酸酶和0.001mg/mL～0.2mg/mL的DNA酶I；或者
EM-3：在DMEM培養(yǎng)基中加入2.5％胎牛血清、1x青霉素和鏈霉素、20U/mL～200U/mL的XI型膠原酶、1μg/mL～100μg/mL的分散酶中性蛋白水解酶I和0.01mg/mL～1mg/mL的DNA酶I。
本發(fā)明的有益效果在于：
本發(fā)明通過條件去分化的分步培養(yǎng)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)快速擴(kuò)增成類器官。這一分步培養(yǎng)的技術(shù)使得原代細(xì)胞可以快速形成類器官，并在有效地時(shí)間內(nèi)獲得足夠多的細(xì)胞開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。把食管癌原代細(xì)胞實(shí)現(xiàn)快速擴(kuò)增的ECRM-I、ECRM-II、ECRM-III培養(yǎng)基和在放大培養(yǎng)和藥物敏感型檢測(cè)時(shí)使用的EDM-1培養(yǎng)基結(jié)合使用。
在腫瘤類器官培養(yǎng)過程中，腫瘤代謝旺盛，會(huì)產(chǎn)生氧自由基并對(duì)細(xì)胞造成傷害，降低細(xì)胞活力，引起分化、凋亡。本發(fā)明食管癌原代類器官培養(yǎng)液中添加了抗氧化劑，谷胱甘肽或維生素C或維生素E都是細(xì)胞在體內(nèi)可獲取的物質(zhì)或者是細(xì)胞的自然代謝產(chǎn)物，可以維持環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)的氧化壓力平衡，清除氧自由基，具有保護(hù)細(xì)胞膜完整性的作用。β-巰基乙醇也是細(xì)胞培養(yǎng)、特別是干細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見的添加劑。研究表明，抗氧化劑的缺乏將使細(xì)胞對(duì)氧化壓力的反應(yīng)性增強(qiáng)，使類器官活力下降，容易老化，功能恢復(fù)延遲。長(zhǎng)期培養(yǎng)的食管癌類器官會(huì)有一定比例的出現(xiàn)更多碎片，細(xì)胞中出現(xiàn)囊泡，生長(zhǎng)速度明顯降低等問題?？寡趸瘎┠芴岣呒?xì)胞的活力，降低產(chǎn)生老化的比例。
本發(fā)明可以提高類器官的生長(zhǎng)速度，由原來的2至6周縮短為1至2周。
本發(fā)明提高類器官培養(yǎng)的成功率，手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本提高至80％以上。
本發(fā)明通過優(yōu)化組織消化液的配方和使用方法，從微小的標(biāo)本中獲取足夠培養(yǎng)的活腫瘤細(xì)胞，使得原來無法培養(yǎng)的活檢標(biāo)本成為可能。
本發(fā)明通過優(yōu)化傳代和凍存的配方和技術(shù)，使得類器官傳代和復(fù)蘇后保持良好的活力。
本發(fā)明中，某些特定條件下優(yōu)化了葡萄糖的濃度，相配合的，通過添加抗氧化自由基試劑，減少長(zhǎng)期培養(yǎng)中引起的細(xì)胞衰老。
附圖說明
圖1為多種添加物配方體外培養(yǎng)形成類器官率數(shù)目的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
其中，B為基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，BW為在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加Wnt3a培養(yǎng)，B27為在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加B27添加劑培養(yǎng)，BM為在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加BMP4培養(yǎng)，BE為在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加EGF培養(yǎng)，BF為在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加FGF2培養(yǎng)，BH為在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加HGF培養(yǎng)，BEW為在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加Wnt3a和EGF培養(yǎng)，EDM-I、ECRM-I、ECRM-II、ECRM-III分別為對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)。
具體實(shí)施方式
為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，以下實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明而非對(duì)其加以限定。
實(shí)施例一 專用培養(yǎng)基的配制
本發(fā)明所述培養(yǎng)基中包含有
一種或幾種受體酪氨酸激酶配體：包括人或動(dòng)物的表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，濃度范圍在2ng/mL至100ng/mL；人或動(dòng)物肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，濃度范圍在10ng/mL至200ng/mL；人或動(dòng)物堿性成纖維生長(zhǎng)因子，濃度范圍為5ng/mL至100ng/mL；
Rho相關(guān)的卷曲蛋白激酶抑制劑：選自Fasudil、Y-27632、RKI-1447和GSK429286A；
多種維生素和激素：腐胺，濃度范圍在0.1μg/mL至100μg/mL；腎上腺酮，濃度范圍在10ng/mL至10μg/mL；煙酰胺，濃度范圍在1μg/mL至2mg/mL；維生素A醋酸酯，濃度范圍在10ng/mL至500ng/mL；
抗氧化劑：選自還原型谷胱甘肽；維生素C；維生素E；β-巰基乙醇(0.01mM至1.5mM)；
抑制細(xì)胞分化的通路的激動(dòng)劑：人激活素A蛋白，濃度范圍為5n/mL至200ng/mL；Wnt通路激動(dòng)劑，包括重組人或動(dòng)物的Wnt3a蛋白，重組人或動(dòng)物RSPO-1蛋白；GSK-3β抑制劑，選自CHIR-99021(CAS號(hào)：252917-06-9)、SB216763(CAS號(hào)：280744-09-4)等；Hedgehog通路激動(dòng)劑，包括重組人或動(dòng)物SHH(Sonic hedgehog)蛋白，SMO蛋白的激動(dòng)劑SAG(CAS號(hào)：912545-86-9)。
實(shí)施例二 食管癌原代細(xì)胞實(shí)現(xiàn)快速擴(kuò)增的ECRM-I、ECRM-II、ECRM-III培養(yǎng)基和在放大培養(yǎng)和藥物敏感型檢測(cè)時(shí)使用的EDM-1培養(yǎng)基的配制
ECRM-I的配方包括DMEM/F12培養(yǎng)基，添加2.5％FBS、1x B27添加劑、抗壞血酸、維生素A醋酸酯、腎上腺酮、腐胺、煙酰胺、胰島素、氫化可的松、人激活素A、FGF2、Wnt3a、EGF、視黃酸和Y27632。
ECRM-II培養(yǎng)基的配方包括DMEM/F12培養(yǎng)基，添加2.5％FBS、1x B27添加劑、煙酰胺、腎上腺酮、BMP4、EGF、Wnt3a、IGF、丁酸鈉、腐胺、維生素A醋酸酯、胰島素、地塞米松、β-巰基乙醇、FGF2、人激活素A、視黃酸和Y27632。
ECRM-III培養(yǎng)基的配方包括DMEM/F12培養(yǎng)基，添加1％BSA、1x B27添加劑、過氧化氫霉、維生素A醋酸酯、煙酰胺、腎上腺酮、丁酸鈉、胰島素、地塞米松、腐胺、還原型谷胱甘肽、人激活素A、EGF、BMP4、FGF1、NOG、SAG、RSPO1、Wnt3a和Y27632。
EDM-I培養(yǎng)基配方包括DMEM/F12培養(yǎng)基中添加2.5％FBS、B27添加劑、HGF、IGF、Wnt3a、EGF、人激活素A、腎上腺酮、維生素A醋酸酯、煙酰胺、胰島素、還原型谷胱甘肽。
實(shí)施例三 組織消化液的配制
優(yōu)化手術(shù)和活檢組織消化液，可實(shí)現(xiàn)保持腫瘤活力情況下的最大獲取率。
EM-BS-1組織酶解液的配方如下：在DMEM培養(yǎng)基中加入2.5％FBS、IX型膠原(1μg/mL-10μg/mL)、中性蛋白水解酶(50μg/mL-500μg/mL)。
EM-BS-2組織酶解液的配方如下：DMEM培養(yǎng)基中加入2.5％FBS、1x青霉素和鏈霉素、IV型膠原酶(0.01mg/mL-1mg/mL)、透明質(zhì)酸酶(0.001mg/mL-0.2mg/mL)和DNA酶I(0.001mg/mL-0.2mg/mL)。
EM-3酶解液的配方如下：DMEM培養(yǎng)基中加入2.5％FBS、1x青霉素和鏈霉素、XI型膠原酶(20U/mL-200U/mL)、分散酶中性蛋白水解酶I(1μg/mL-100μg/mL)和DNA酶I(0.01mg/mL-1mg/mL)。
實(shí)施例四 食管癌腫瘤類器官的培養(yǎng)方法
本發(fā)明獲取處理食管癌組織的具體步驟如下：將新鮮獲取的食管癌標(biāo)本組織(包括手術(shù)切除組織，活檢組織或PDX模型中獲取的食管癌組織)，用組織清洗液清洗，清洗三遍后轉(zhuǎn)移入組織轉(zhuǎn)移液中，置于0到4攝氏度轉(zhuǎn)移或短期保存。組織在有空氣凈化裝置的細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)，二級(jí)以上生物安全柜內(nèi)操作。對(duì)比較大的手術(shù)組織，在含有70％～75％乙醇的醫(yī)用消毒液中浸泡組織10秒，取出后置于PBS中，清洗3次，去除殘余乙醇，轉(zhuǎn)移到無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，吸掉多余液體，用消毒眼科剪去處結(jié)締組織，選擇較硬、色白的腫瘤位置，取10mm見方左右腫瘤組織。加入0.5mL組織消化液，用滅菌眼科剪反復(fù)剪碎組織50次以上，剪切成1mm見方的小塊，至1mL移液器槍頭能順利吸入。把剪碎的組織轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，繼續(xù)加入2～10mL酶解液，清洗轉(zhuǎn)移培養(yǎng)皿中的腫瘤組織，并入離心管中。置于37攝氏度搖床中消化，不時(shí)取出觀察，消化到多以寡細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞為止。經(jīng)過70μm細(xì)胞篩網(wǎng)，濾過液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加入20mL PBS，200g離心3分鐘，棄上清，用20mL PBS重懸，再次200g離心3分鐘。小心地吸去上清，加入5mL本發(fā)明所述食管癌類器官培養(yǎng)專用培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞。取100μL細(xì)胞懸液加入臺(tái)盼藍(lán)，用血小板計(jì)數(shù)器計(jì)算活細(xì)胞的數(shù)量。
本發(fā)明所述食管癌細(xì)胞類器官的培養(yǎng)階段具體操作步驟：食管癌組織經(jīng)過機(jī)械剪切和酶消化后，獲得單細(xì)胞和寡細(xì)胞團(tuán)懸液，計(jì)數(shù)后用培養(yǎng)基重懸調(diào)整細(xì)胞密度，加入等體積4℃解凍的Matrigel混合，在某些實(shí)施方案中，Marigel加入體積調(diào)整為細(xì)胞懸液的0.1倍至1倍。細(xì)胞懸液與Matrigel重懸后，接種于24孔板，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，20分鐘后，待Matrigel凝固，加入培養(yǎng)基，隔天換液。4-10天后，食管癌類器官長(zhǎng)成多球體形狀，有上皮樣細(xì)胞層。
食管癌原代細(xì)胞標(biāo)本采集是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵步驟，標(biāo)本采集和運(yùn)輸不當(dāng)，將會(huì)直接影響腫瘤類器官的成功與否，腫瘤標(biāo)本采集的基本要求和注意事項(xiàng)敘述如下：(1)防控細(xì)菌和真菌污染。手術(shù)操作環(huán)境并非無菌操作，環(huán)境和體內(nèi)都有很多微生物，正確的采集和處理方式可以最大限度的降低污染。配制組織清洗液：生理鹽水(0.9％氯化鈉)或者磷酸鹽緩沖液(PBS)中加入青霉素(500U/mL)、兩性霉素B(2.5μg/mL)和鏈霉素(500μg/mL)，過濾除菌。配制組織轉(zhuǎn)移液：DMEM培養(yǎng)基中加入5％胎牛血清，加入青霉素(500U/mL)、兩性霉素B(2.5μg/mL)和鏈霉素(500μg/mL)。取材用的剪刀、鑷子、刀片等器械高壓滅菌后烘干。(2)標(biāo)本采集要盡量選取包膜完整，生長(zhǎng)旺盛的區(qū)域，避免腐爛組織、壞死組織、脂肪和結(jié)締組織。預(yù)處理時(shí)要仔細(xì)去除組織上的血液、脂肪、壞死組織及結(jié)締組織。(3)操作運(yùn)輸過程要盡量快，組織離體后的時(shí)間越久，體外構(gòu)建腫瘤類器官的成功率越低，一般在離體后4小時(shí)內(nèi)完成培養(yǎng)操作。必要時(shí)，標(biāo)本可在標(biāo)本轉(zhuǎn)移液中4攝氏度過夜儲(chǔ)存，但是會(huì)大大降低成功率，增加污染幾率。
通過條件去分化的分步培養(yǎng)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)快速擴(kuò)增成類器官。這一分步培養(yǎng)的技術(shù)使得原代細(xì)胞可以快速形成類器官，并在有效地時(shí)間內(nèi)獲得足夠多的細(xì)胞開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。在一些實(shí)施方案中，從獲取手術(shù)或活檢標(biāo)本制備的單細(xì)胞或寡細(xì)胞使用ECRM-I、ECRM-II、ECRM-III培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的部分去分化和快速擴(kuò)增，這一過程在3-10天不等。例如第0-7日，第0-6日，第0-5日，第0-4日，第0-3日，第0-2日，第0-1日，其中第0日是細(xì)胞從其來源組織分離的那一日，第1日是隨后的那一日，或者使用EDM-I培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞1周或更久，例如2、3、4周或更久，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個(gè)月或更久。在一些實(shí)施方案中，EDM-I培養(yǎng)基在培養(yǎng)的第一日即可使用，在使用EDM-I培養(yǎng)基的條件下，進(jìn)行對(duì)腫瘤類器官生物學(xué)或者藥效的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例五 測(cè)試多種添加物配方對(duì)類器官體外培養(yǎng)形成率的影響
在DMEM/F12培養(yǎng)基中加入2.5％FBS、腎上腺酮、煙酰胺、抗壞血酸和抗生素作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(B)，在此基礎(chǔ)上分別添加Wnt3a(BW)、添加B27添加劑(B27)、添加BMP4(BM)、添加EGF(BE)、添加FGF2(BF)、添加HGF(BH)、添加Wnt3a和EGF(BEW)。此外還有如上文所述的ECRM-I、ECRM-II、ECRM-III和EDM-I培養(yǎng)條件。在這些培養(yǎng)條件下，測(cè)試P1代類器官的形成率，P0帶類器官的單細(xì)胞5x104與基質(zhì)膠混合后鋪在預(yù)先濕潤(rùn)的24孔板中，在37攝氏度靜止10分鐘后，待基質(zhì)膠固化后，分別在不同孔中加入1mL上述培養(yǎng)基。分別在培養(yǎng)的第五天和第七天記錄擴(kuò)增的類器官數(shù)目。
如圖1所示，ECRM-I、ECRM-II、ECRM-III和EDM-I培養(yǎng)條件下，明顯優(yōu)于B、BW、B27、BM、BF、BH、BEW培養(yǎng)條件，其中ECRM-II的培養(yǎng)條件效果最佳。
以上所述實(shí)施方式僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。