本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及離體擴(kuò)培非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物造血干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
：干細(xì)胞(StemCells)是一類具有自我更新及多向分化潛能的細(xì)胞群體，即這些細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞分裂維持自身細(xì)胞群的大小，同時(shí)又可以進(jìn)一步分化成為各種不同的組織細(xì)胞，從而醫(yī)學(xué)界稱之為“萬(wàn)能細(xì)胞”。這種獨(dú)一無(wú)二的特性使其成為再生醫(yī)學(xué)和移植醫(yī)學(xué)的一個(gè)不可缺少的細(xì)胞來(lái)源。也使它成為眾多疾病，如血液疾病、帕金森病，糖尿病，脊髓損傷、癌癥和心臟病等細(xì)胞治療的最佳候選者，因此對(duì)于干細(xì)胞的研究在臨床應(yīng)用領(lǐng)域中意義重大。造血干細(xì)胞(HemopoieticStemCells，HSCs)是存在于造血組織中的一群原始造血細(xì)胞，造血干細(xì)胞在臨床上的骨髓移植和惡性血液疾病治療方面發(fā)揮著重要作用，主要來(lái)源有臍帶血，骨髓及動(dòng)員后的外周血。但由于這些來(lái)源中所含的造血干細(xì)胞數(shù)量有限，不能滿足臨床醫(yī)治的需求。并且，造血干細(xì)胞在應(yīng)用過(guò)程中一個(gè)瓶頸是不能夠有效的體外擴(kuò)增并且在體外擴(kuò)增中會(huì)失去其干性。已知的造血干細(xì)胞的擴(kuò)增方法有使用飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法，此方法不能使子干細(xì)胞維持與母干細(xì)胞相同的成熟狀態(tài)，最佳可以擴(kuò)增干細(xì)胞5倍左右，且引入了外源性的細(xì)胞干擾，不利于擴(kuò)增后用于臨床移植，易提高移植物抗宿主反應(yīng)(GVHD)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。所以，將造血干細(xì)胞進(jìn)行體外安全有效地?cái)U(kuò)增，并且擴(kuò)增出能夠切實(shí)地應(yīng)用于動(dòng)物、特別是靈長(zhǎng)類動(dòng)物的造血干細(xì)胞，仍是目前本領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供離體擴(kuò)培非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物造血干細(xì)胞的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種離體培養(yǎng)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的造血干細(xì)胞的方法，所述方法包括：利用包含細(xì)胞因子組合物的培養(yǎng)基培養(yǎng)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的CD34+造血干細(xì)胞；所述的細(xì)胞因子組合物包括：在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞因子組合物包括：在另一優(yōu)選例中，所述的包含細(xì)胞因子組合物的培養(yǎng)基是：添加有所述細(xì)胞因子組合物的IMDM培養(yǎng)基；較佳地，該培養(yǎng)基中還包括胎牛血清(較佳地為5～15％(v/v)，如10％(v/v)胎牛血清)。在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括：將CD34+造血干細(xì)胞接種于多孔板(如6孔板)中，接種密度為(1-10)×105個(gè)/孔，培養(yǎng)起始后第2～3天后以及第5～6天后分別更換新鮮培養(yǎng)基，適時(shí)分孔。在本發(fā)明的另一方面，提供一種如前所述的包含細(xì)胞因子組合物的培養(yǎng) 基在離體培養(yǎng)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的CD34+造血干細(xì)胞中的用途。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的包含細(xì)胞因子組合物的培養(yǎng)基是：添加有所述細(xì)胞因子組合物的IMDM培養(yǎng)基；較佳地，該培養(yǎng)基中還包括胎牛血清(較佳地為5～15％(v/v)，如10％(v/v)胎牛血清)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種包含細(xì)胞因子組合物的培養(yǎng)基在制備用于離體培養(yǎng)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的CD34+造血干細(xì)胞的試劑盒中的用途；所述的細(xì)胞因子組合物包括：在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的靈長(zhǎng)類動(dòng)物是猴。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。附圖說(shuō)明圖1、猴外周血來(lái)源的造血干細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增9天后的倍數(shù)及CD34陽(yáng)性率。A、體外擴(kuò)增9天后，總細(xì)胞及CD34+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)；B、擴(kuò)增前即第0天和擴(kuò)增九天后CD34+比例。圖中代表11只猴的平均擴(kuò)增數(shù)據(jù)。圖2、猴外周血來(lái)源的造血干細(xì)胞擴(kuò)增前(Pre-expansion)及體外擴(kuò)增后(Post-expansion)的各系集落形成數(shù)目，包括粒系祖細(xì)胞集落(CFU-G)、粒系巨 核系祖細(xì)胞集落(CFU-GM)、造血祖細(xì)胞集落(CFU-GEMM)、巨核系祖細(xì)胞集落(CFU-M)、紅系祖細(xì)胞集落(BFU-E)。圖中數(shù)據(jù)代表11只猴的平均數(shù)據(jù)。圖3、猴造血干細(xì)胞自體移植后，血象恢復(fù)時(shí)間圖。血象指標(biāo)包括：A、白細(xì)胞(WBC)；B、血小板(PLT)；C、中性粒細(xì)胞(NEU)；D、淋巴細(xì)胞(LMP)。包括了空白對(duì)照組(BlankCtrl)、陰性對(duì)照組(NegativeCtrl)和實(shí)驗(yàn)組(ExperimentGroup)的各個(gè)動(dòng)物在移植后指標(biāo)恢復(fù)正常的時(shí)間。圖中每一個(gè)點(diǎn)代表1只猴的數(shù)據(jù)，總共是9只存活并恢復(fù)正常的猴的數(shù)據(jù)。因?yàn)榭瞻讓?duì)照(共3只)和陰性對(duì)照(共3只)在自體移植后5天各有1只死亡，所以這兩組各剩2只存活。實(shí)驗(yàn)組(共5只)全部存活。例如：空白對(duì)照組2只存活，則有2個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，對(duì)應(yīng)這2只在這個(gè)指標(biāo)的恢復(fù)時(shí)間。圖4、實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物(5只食蟹猴，編號(hào)E-1～E-5)造血干細(xì)胞自體移植一個(gè)月，流式檢測(cè)外周血和骨髓中，GFP(+)細(xì)胞在CD45+細(xì)胞群中的比例。A、移植一個(gè)月內(nèi)，不同時(shí)間點(diǎn)采集外周血，流式檢測(cè)CD45+細(xì)胞群中GFP(+)比例；B、移植一個(gè)月后，采集5只動(dòng)物骨髓，流式檢測(cè)各個(gè)動(dòng)物骨髓CD45+細(xì)胞群中GFP(+)比例。具體實(shí)施方式針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中難以實(shí)現(xiàn)靈長(zhǎng)類動(dòng)物(如猴)的造血干細(xì)胞高效擴(kuò)增的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，開(kāi)發(fā)了一種離體擴(kuò)增造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，通過(guò)所述培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法可使非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物造血干細(xì)胞在保持原來(lái)干性特征的基礎(chǔ)上進(jìn)行有效和大量的擴(kuò)增，大大提高造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增效率。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由…… 構(gòu)成(制成)”“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”。細(xì)胞因子組合物及培養(yǎng)基本發(fā)明人優(yōu)化了用于離體擴(kuò)增造血干細(xì)胞的細(xì)胞因子。提供了一種細(xì)胞因子組合物。所述的細(xì)胞因子組合物包括：干細(xì)胞因子(SCF)、flt3-配體(FLT-3L)、血小板因子(TPO)、中性粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素3(IL3)、白介素6(IL6)和Sall樣蛋白4B(Sall4B)。上述各細(xì)胞因子以適合的比例添加到細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，可為非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物造血干細(xì)胞提供適合的離體生長(zhǎng)環(huán)境的培養(yǎng)基，促進(jìn)造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)增。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，用于配制本發(fā)明的培養(yǎng)基的各組分的用量如表1所示。表1表1配方的細(xì)胞因子被溶于細(xì)胞培養(yǎng)基中，得到適宜培養(yǎng)的培養(yǎng)基，從而為非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的造血干細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)和擴(kuò)增環(huán)境。所述的細(xì)胞培養(yǎng)基可以選擇IMDM培養(yǎng)基或類似的細(xì)胞培養(yǎng)基。用于配制培養(yǎng)基的Sall4B、SCF、TPO、Flt-3L、G-CSF、IL3和IL6均是本領(lǐng)域技術(shù)人員易于獲得的，例如可通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)，或可通過(guò)人工合成或重組表達(dá)獲得。培養(yǎng)方法本發(fā)明還提供了一種擴(kuò)增培養(yǎng)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的造血干細(xì)胞的方法，所述方法包括：應(yīng)用所述的細(xì)胞因子組合物添加到細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)造血干細(xì)胞。較佳地，所述方法包括：將CD34+造血干細(xì)胞接種于多孔板(如6孔板)中，接種密度為(1-10)×105個(gè)/孔，培養(yǎng)起始后第2～3天后以及第5～6天后分別更換新鮮培養(yǎng)基，適時(shí)分孔。本發(fā)明將非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的造血干細(xì)胞通過(guò)優(yōu)化的干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基于體外安全高效擴(kuò)增，可以大量獲得可供干細(xì)胞研究實(shí)驗(yàn)室科研研究或供臨床試驗(yàn)的細(xì)胞。本領(lǐng)域臨床實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)存在一些方案來(lái)擴(kuò)增造血干細(xì)胞，但在干細(xì)胞的分裂過(guò)程當(dāng)中，一個(gè)子細(xì)胞保留與母干細(xì)胞相同成熟狀態(tài)，但另一個(gè)則出現(xiàn)了分化的情況，已經(jīng)存在的方案就是會(huì)使干細(xì)胞擴(kuò)增僅僅一代或兩代，在此之后保持原來(lái)干性的細(xì)胞數(shù)量大大下降。本發(fā)明使用含有Sall4B、SCF、TPO、Flt-3L、G-CSF、IL3和IL6的體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞的配方來(lái)高效擴(kuò)增造血干細(xì)胞的技術(shù)，與傳統(tǒng)的造血干細(xì)胞擴(kuò)增方法相比，具有如下幾個(gè)主要特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)：第一，不引入外源性基因表達(dá)，避免了外源基因?qū)υ杉?xì)胞的基因組穩(wěn)定性的干擾；第二，不涉及飼養(yǎng)層細(xì)胞等外源性細(xì)胞混雜而導(dǎo)致的干細(xì)胞移植安全問(wèn)題；第三，本發(fā)明可使干細(xì)胞體外培養(yǎng)9天內(nèi)將CD34+干祖細(xì)胞數(shù)量增加接近70倍，總有核細(xì)胞總數(shù)在培養(yǎng)9天時(shí)增加至少160倍，培養(yǎng)16天時(shí)總有核細(xì)胞可增加數(shù)百倍或更多。目前使用已經(jīng)發(fā)明的離體干細(xì)胞的培養(yǎng)基擴(kuò)增干細(xì)胞其擴(kuò)增效率目前報(bào)道的為5倍左右，需要引入外源性基因表達(dá)而進(jìn)行的干細(xì)胞擴(kuò)增最佳可以達(dá)到160倍至200倍的擴(kuò)增效果，并且對(duì)于造血干細(xì)胞的干性和基因穩(wěn)定性造成了干擾。而本發(fā)明因使用了特定配方的培養(yǎng)物擴(kuò)增造血干細(xì)胞使擴(kuò)增效率大大提高，與傳統(tǒng)培養(yǎng)配方相比具有顯著的更高的擴(kuò)增效率，而且能夠很好的保持干細(xì)胞自我更新和多能分化等基本特征。本發(fā)明人利用新型的對(duì)造血干細(xì)胞進(jìn)行體外有效擴(kuò)增的技術(shù)，使造血干細(xì)胞在保持原來(lái)干性特征的基礎(chǔ)上進(jìn)行有效和大量的擴(kuò)增。對(duì)于擴(kuò)增后的造血干細(xì)胞，需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)驗(yàn)證其在體內(nèi)的安全有效性。因此，針對(duì)擴(kuò)增獲得的細(xì)胞，本發(fā)明人進(jìn)一步進(jìn)行了臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以 確認(rèn)擴(kuò)增后造血干細(xì)胞的體內(nèi)外干性和造血重建能力。所述的臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)主要包括：通過(guò)建立猴骨髓抑制模型，擴(kuò)增后的獲得的造血干細(xì)胞在動(dòng)物自體移植上的應(yīng)用價(jià)值。造血干細(xì)胞來(lái)源于食蟹猴動(dòng)員后外周血(主要是CD34+細(xì)胞)，通過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后，可滿足自身移植需求。食蟹猴經(jīng)環(huán)磷酰胺注射造成骨髓抑制，通過(guò)回輸之前擴(kuò)增的造血干細(xì)胞，可有效幫助動(dòng)物血象恢復(fù)。移植前的細(xì)胞體外多系克隆形成實(shí)驗(yàn)，及移植后動(dòng)物血常規(guī)的監(jiān)測(cè)、流式監(jiān)測(cè)結(jié)果說(shuō)明采用該技術(shù)擴(kuò)增后的造血干細(xì)胞能保持多系分化潛能，體內(nèi)能幫助骨髓抑制動(dòng)物的血象恢復(fù)。本發(fā)明因使用了特定配方的培養(yǎng)物擴(kuò)增猴造血干細(xì)胞，能夠很好的保持干細(xì)胞自我更新和多能分化等基本特征，而且不需引入外源基因和飼養(yǎng)層細(xì)胞，降低了GVHD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。另外，本發(fā)明用食蟹猴做骨髓抑制模型進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，從移植后的血象恢復(fù)等指標(biāo)對(duì)擴(kuò)增后的造血干細(xì)胞在體內(nèi)的功能發(fā)揮進(jìn)行有效評(píng)價(jià)。與常規(guī)進(jìn)行的NOD/SCID小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相比，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物食蟹猴模型更適于臨床前實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)結(jié)果更能為該技術(shù)的臨床應(yīng)用的安全性和穩(wěn)定性提供參考資料。使用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物作為造血干細(xì)胞移植的模型，傳統(tǒng)手法是對(duì)動(dòng)物進(jìn)行高劑量的輻射徹底破壞動(dòng)物自身骨髓造血功能，因?yàn)檩椛鋭┝枯^高，動(dòng)物免疫力完全破壞，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)動(dòng)物并發(fā)癥感染或者死亡。本發(fā)明人采用環(huán)磷酰胺對(duì)動(dòng)物造成骨髓抑制模型，在動(dòng)物血象恢復(fù)的觀察窗內(nèi)可獲得有效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過(guò)比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的各指標(biāo)恢復(fù)所需時(shí)間，即可說(shuō)明擴(kuò)增后的造血干細(xì)胞在體內(nèi)的功能發(fā)揮。另外，由于環(huán)磷酰胺的毒性有限，動(dòng)物自身也具有一定的恢復(fù)能力，可以避免由于輻射引發(fā)的較高死亡率。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1、造血干細(xì)胞的分離試驗(yàn)用11只食蟹猴，按照體重每天皮下注射G-CSF(200μg/kg)和SCF(200μg/kg)，連續(xù)注射五天動(dòng)員骨髓釋放CD34+造血干細(xì)胞到外周血中，于注射第6天和第7天，連續(xù)兩天每天采集猴外周血15ml，使用美天旎公司MACS磁珠分選系統(tǒng)分離CD34+細(xì)胞，針對(duì)11只猴，分離所得的造血干細(xì)胞分別約2～3×106個(gè)細(xì)胞/只。實(shí)施例2、造血干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)以Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium(IMDM)作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在其中加入10％胎牛血清(v/v)以及終濃度如表1的細(xì)胞因子。表1配方1(單位：ng/ml)Sall4B3ng/mlSCF100ng/mlFLT-3L100ng/mlTPO20ng/mlG-CSF12.5ng/mlIL325ng/mlIL612.5ng/ml在康寧公司低吸附6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，細(xì)胞接種密度為5×105個(gè)/孔，每孔含培養(yǎng)基2ml，培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中(37℃，5％CO2)。在培養(yǎng)第3天和第5天，對(duì)培養(yǎng)板每孔更換新鮮培養(yǎng)基，并適時(shí)分孔以保持孔內(nèi)細(xì)胞密度處于合適狀態(tài)。在培養(yǎng)第6天，將擴(kuò)增后的細(xì)胞(僅對(duì)實(shí)驗(yàn)組的5只猴來(lái)源的細(xì)胞)進(jìn)行GFP慢病毒轉(zhuǎn)染標(biāo)記：用移液槍吸棄每孔培養(yǎng)基上清約800μl后，再加入GFP慢病毒60μl和Polybrene5μl，進(jìn)行GFP慢病毒轉(zhuǎn)染標(biāo)記，放入培養(yǎng)箱12h后取出培養(yǎng)板，將細(xì)胞板內(nèi)細(xì)胞吸出，1200rpm/min離心5min，棄去上清，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，并再次接種到6孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。慢病毒構(gòu)建所需質(zhì)粒(psPAX2質(zhì)粒，pMD2G質(zhì)粒和GFP基因組質(zhì)粒)來(lái)源于紐約州立大學(xué)石溪分校(Aguila,J.R.,Liao,W.,Yang,J.,Avila,C.,Hagag,N.,Senzel,L.,andMa,Y.(2011)SALL4isarobuststimulatorfortheexpansion ofhematopoieticstemcells.Blood118,576-585)。體外培養(yǎng)9天后，總細(xì)胞擴(kuò)增約8.6倍，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增約8倍，可達(dá)到自體移植所需細(xì)胞量(2×106/kgCD34+細(xì)胞)，CD34+比例與擴(kuò)增前相比仍保持較高水平(擴(kuò)增前CD34+比例70％，擴(kuò)增后63％)，如圖1。(1)293T細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)基為DMEM，加10％胎牛血清，加1％青鏈霉素。培養(yǎng)容器為T(mén)75cm2培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)至細(xì)胞密度在70％左右，可進(jìn)行轉(zhuǎn)染病毒質(zhì)粒，進(jìn)行病毒包裝的過(guò)程。(2)病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及病毒包裝。(a)提前30分鐘將293T的培養(yǎng)基換成不含有青鏈霉素的DMEM加20％胎牛血清的培養(yǎng)基；(b)準(zhǔn)備以下兩個(gè)溶液，一是1.8mlOpti-MEM中加入75微升脂質(zhì)體2000；二是在1.8mlOpti-MEM中加入10微克psPAX2質(zhì)粒，5微克pMD2G質(zhì)粒和15微克病毒的基因組質(zhì)粒，混勻；(c)將兩種溶液混合，室溫孵育20-30分鐘，不要超過(guò)30分鐘；(d)將混合溶液加入到293T細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；(e)12-16小時(shí)之后將培養(yǎng)基換成如下培養(yǎng)基：DMEM加20％胎牛血清，加1％青鏈霉素，加1mM濃度的丙酮酸鈉；(3)慢病毒的收集在上一步換液之后的12小時(shí)，36小時(shí)和60小時(shí)分別收集培養(yǎng)液。前兩次收集的同時(shí)，再加入培養(yǎng)基(DMEM加20％胎牛血清，1％青鏈霉素和1mM濃度的丙酮酸鈉。(4)病毒的濃縮(a)將收集的病毒液離心，速度300g，時(shí)間10分鐘；(b)收集上清，用0.22微米的濾膜過(guò)濾；(c)將過(guò)濾后的病毒液進(jìn)行離心，速度23000rpm，時(shí)間3小時(shí)；(d)棄上清，加入500ulDMEM培養(yǎng)基，室溫放置30分鐘，然后重選病毒；(e)濃縮后病毒的滴度約為108IU；(5)病毒的保存：-80℃冰箱。凍存GFP慢病毒轉(zhuǎn)染標(biāo)記后的細(xì)胞。在自體移植前復(fù)蘇細(xì)胞，進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，各細(xì)胞系克隆數(shù)目與之前未擴(kuò)增的造血干細(xì)胞形成的克隆進(jìn)行比 較，無(wú)顯著差異，如圖2。該結(jié)果說(shuō)明擴(kuò)增后，細(xì)胞在體外仍保持了多系分化潛能。實(shí)施例3、回輸試驗(yàn)檢測(cè)11只試驗(yàn)猴的血常規(guī)及生命體征，在各指標(biāo)處于正常水平時(shí)，根據(jù)猴體重連續(xù)2天靜脈注射環(huán)磷酰胺(50mg/Kg)造成骨髓抑制，即白細(xì)胞總數(shù)，粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，血小板均顯著下降。繼續(xù)注射環(huán)磷酰胺，在環(huán)磷酰胺注射后第5天，對(duì)猴實(shí)施造血干細(xì)胞自體移植術(shù)，其中空白對(duì)照組3只，只給予生理鹽水回輸；陰性對(duì)照組3只，回輸?shù)攘可睇}水，內(nèi)含CD34-細(xì)胞(2×107/kg)(在使用美天旎公司MACS磁珠分選系統(tǒng)分離CD34+細(xì)胞過(guò)程中，收集流出液即CD34-細(xì)胞)；實(shí)驗(yàn)組5只，回輸?shù)攘可睇}水，內(nèi)含如前擴(kuò)增培養(yǎng)的CD34+細(xì)胞(2×106/kg)和CD34-細(xì)胞(2×107/kg)。在回輸后血常規(guī)監(jiān)測(cè)各組血象恢復(fù)情況，及動(dòng)物身體狀態(tài)，11只食蟹猴的狀況如表1。移植后5天，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組各有一只死亡，病理解剖死亡病因一致，疑似急性腎衰，實(shí)驗(yàn)組全部存活。從自體移植術(shù)后開(kāi)始至移植后一個(gè)月內(nèi)，每隔3到5天對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采集外周血，進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，觀察血象恢復(fù)情況。實(shí)驗(yàn)組白細(xì)胞總數(shù)，中性粒細(xì)胞恢復(fù)時(shí)間約在移植后兩周恢復(fù)正常，較空白組及陰性對(duì)照組快1周。血小板恢復(fù)時(shí)間，空白組14天，陰性對(duì)照11天，實(shí)驗(yàn)組10天。三組的淋巴細(xì)胞恢復(fù)時(shí)間均在移植后三周左右，無(wú)明顯差異(圖3)。移植后一個(gè)月內(nèi)，每隔3～5天采集外周血樣本檢測(cè)其中CD45細(xì)胞群(CD45是白細(xì)胞共同抗原標(biāo)志物，即表達(dá)在)中GFP+比例，維持在1％～2％，說(shuō)明回輸細(xì)胞在猴體內(nèi)持續(xù)存活增殖。移植后一個(gè)月抽取實(shí)驗(yàn)組猴骨髓，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其中CD45細(xì)胞群中GFP+比例，在1.8％～4.1％，說(shuō)明并有少數(shù)細(xì)胞植入骨髓中(圖4)。由此，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，采用該新型技術(shù)擴(kuò)增后的造血干細(xì)胞能保持多系分化潛能，體內(nèi)能幫助骨髓抑制動(dòng)物的血象恢復(fù)。在后續(xù)的檢測(cè)點(diǎn)(移植后三個(gè)月，六個(gè)月，九個(gè)月，及一年)，對(duì)動(dòng)物生命體征如血常規(guī)，體重，廢食情況等繼續(xù)監(jiān)測(cè)，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均無(wú)異常，進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明的新型離體擴(kuò)增造血干細(xì)胞技術(shù)的安全性，有效性和穩(wěn)定性。表2B-1～B-3為：空白對(duì)照組，自體移植時(shí)僅回輸約50ml的生理鹽水。N-1～N-3為：陰性對(duì)照組，自體移植時(shí)回輸?shù)攘康纳睇}水，其中含有自身CD34-細(xì)胞。E-1～E-5為：實(shí)驗(yàn)組，自體移植時(shí)回輸?shù)攘康纳睇}水，其中含有自身CD34-細(xì)胞和體外擴(kuò)培后的CD34+細(xì)胞。實(shí)施例4、其它配方培養(yǎng)猴造血干細(xì)胞基于所述的細(xì)胞因子，發(fā)明人還配制了其它一些配方，以Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium(IMDM)作為細(xì)胞培養(yǎng)基，添加10％胎牛血清(v/v)其中分別加入如表3所示配方的細(xì)胞因子。獲得配方。表3配方2(ng/ml)配方3(ng/ml)配方4(ng/ml)Sall4B3ng/ml3ng/ml3ng/mlSCF100ng/ml150ng/ml150ng/mlFLT-3L150ng/ml150ng/ml200ng/mlTPO25ng/ml50ng/ml50ng/mlG-CSF12.5ng/ml25ng/ml50ng/mlIL325ng/ml50ng/ml100ng/mlIL625ng/ml50ng/ml50ng/ml采用如實(shí)施例2相同的培養(yǎng)條件，分別應(yīng)用配方2、3或4作為培養(yǎng)基，培養(yǎng)猴造血干細(xì)胞。結(jié)果，CD34+細(xì)胞平均擴(kuò)增倍數(shù)高位數(shù)為10.9倍，低位數(shù)為5.6倍；因此，擴(kuò)繁效果較為理想。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3