專利名稱：：具有新世界靈長類區(qū)域的嵌合抗體的制作方法具有新世界靈長類區(qū)域的嵌合抗體發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗原結(jié)合部分包含至少2個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列和至少3個構(gòu)架區(qū)，其中至少一個CDR是新世界靈長類CDR;并且涉及所述抗體或其抗原結(jié)合部分在治療疾病或病癥中的用途。
背景技術(shù)：
：抗體(免疫球蛋白)在哺乳動物的免疫系統(tǒng)中起重要作用。它們由漿細(xì)胞生產(chǎn)，所述漿細(xì)胞由前體B細(xì)胞發(fā)育而成?？贵w由通過二硫橋連接的2個相同的多肽輕鏈和2個相同的多肽重鏈組成。輕鏈被稱為K或入輕鏈，和重鏈被稱為Y、JLi、5、ot或s。每條鏈由恒定區(qū)和可變區(qū)組成。可變區(qū)給予抗體以特異性。在每個可變區(qū)內(nèi)是具有髙可變性的區(qū)域或互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，其側(cè)翼是被稱為構(gòu)架區(qū)的更保守的區(qū)域。在每個可變區(qū)內(nèi)是3個CDRs和4個構(gòu)架區(qū)。抗體是雙功能分子，來自重和輕鏈的N-末端可變區(qū)段以特異性方式結(jié)合在一起，從而產(chǎn)生對抗原表面上的特定表位具有親和力的三維結(jié)構(gòu)。恒定區(qū)區(qū)段負(fù)責(zé)延長抗體的血清半衰期和效應(yīng)物功能，并且涉及補(bǔ)體結(jié)合、刺激吞噬作用、抗體依賴性細(xì)胞毒性和觸發(fā)粒細(xì)胞的顆粒釋放。雜交瘤技術(shù)的開發(fā)促進(jìn)了具有特定特異性的單克隆抗體的生產(chǎn)。通常，此類雜交瘤是鼠類雜交瘤。已產(chǎn)生了人/小鼠嵌合抗體，其中將來自小鼠基因組的抗體可變區(qū)序列與來自人基因組的抗體恒定區(qū)序列相組合。該嵌合抗體顯示出親本小鼠抗體的結(jié)合特征，以及與人恒定區(qū)相關(guān)的效應(yīng)物功能。通過在宿主細(xì)胞中表達(dá)來產(chǎn)生抗體，所述宿主細(xì)胞包括例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0)、NSO骨號瘤細(xì)胞、C0S細(xì)胞和SP2細(xì)胞。此類嵌合抗體已用于人治療中，然而，由人受者產(chǎn)生了針對這些嵌合抗體的抗體.此類抗嵌合抗體對使用嵌合抗體的持續(xù)治療是有害的。已提出，人單克隆抗體預(yù)期是用于體內(nèi)人治療的超過小鼠單克隆抗體的改進(jìn)。根據(jù)使用來自舊世界靈長類(恒河猴和黑猩猩)的抗體進(jìn)行的工作，假定這些非人靈長類抗體在人中將是耐受的，因?yàn)樗鼈冊诮Y(jié)構(gòu)上類似于人抗體(EhrlichPH等人，ClinChem.，1988，34:91681-1688)。此外，因?yàn)槿丝贵w是在恒河猴中是非免疫原性的(EhrlichPH等人，Rhesusmonkeyresponsestomultipleinjectionsofhumanmonoclonalantibodies.Hybridoma1987;6:151-60)，所以可能反過來也是可行的，并且靈長類抗體在人中將是非免疫原性的。這些單克隆抗體由雜交瘤分泌，所述雜交瘤通過使淋巴細(xì)胞與人x小鼠異骨髓瘤(heteromyeloma)相融合來構(gòu)建。EP0605442公開了結(jié)合人抗原的嵌合抗體。這些抗體包含來自舊世界猴的完整可變區(qū)和人或黑猩猩抗體的恒定區(qū)。在這個參考文獻(xiàn)中提出的關(guān)于這些構(gòu)建體的優(yōu)點(diǎn)之一是在舊世界猴中產(chǎn)生針對人抗原的抗體的能力，與在小鼠宿主中產(chǎn)生的抗體相比較，所述抗體在人中的免疫原性更低。新世界靈長類(廣鼻猴下目(/7a^rr力//7/))包含至少53個種，其通常分成2個科狨科(。//"力r/"Vae)和懸猴科(Ce^Vae)狨科由狨和谞組成。懸猴科包括松鼠猴、青猴、蜘蛛猴、絨毛猴、懸猴、殼猴、狐尾猴、夜或梟猴和吼猴。進(jìn)化上遙遠(yuǎn)的靈長類，例如新世界靈長類，不僅足夠不同于人以允許產(chǎn)生針對人抗原的抗體，還足以類似于人以具有類似于人抗體的抗體，從而使得當(dāng)衍生自此類靈長類的抗體被引入人中時，宿主不產(chǎn)生抗抗體免疫應(yīng)答。先前的研究已表征了表達(dá)的普通狨(CW7/^m的免疫球蛋白重鏈儲庫(vonBudingenH-C等人，CharacterizationoftheexpressedimmunoglobulinIGHVrepertoireintheNewWorldmarmoset""/f/Lr/jrJacc力i/s，Immunogenetics2001;53:557-563),鑒定了6個IGHV亞群，其顯示了與它們的人IGHV對應(yīng)物的高度序列相似性。當(dāng)與互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)相比較時，構(gòu)架區(qū)是更保守的。普通狨與人IGHV序列之間的相似性程度小于非人舊世界靈長類與人之間的相似性程度。結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)是功能性結(jié)合單元，其可以使用抗體構(gòu)架來制備，并且相應(yīng)于抗體的重鏈可變區(qū)(VH)或輕鏈可變區(qū)(VJ。結(jié)構(gòu)域抗體具有約13kDa的分子量，或小于完整抗體大小的十分之一。免疫球蛋白輕鏈被稱為K或入輕鏈，和重鏈被稱為v、|J、5、ot或e;?？勺儏^(qū)給予抗體以特異性。在每個可變區(qū)內(nèi)是具有高可變性的區(qū)域，或者被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，其側(cè)翼是被稱為構(gòu)架區(qū)的更保守的區(qū)域。在每個輕鏈和重鏈可變區(qū)內(nèi)是3個CDRs和4個構(gòu)架區(qū)，與常規(guī)抗體不同，結(jié)構(gòu)域抗體在細(xì)菌、酵母和哺乳動物系統(tǒng)中良好表達(dá)。它們的小尺寸允許更高的摩爾量/克產(chǎn)物，從而提供了效力的顯著增加。此外，結(jié)構(gòu)域抗體可以用作構(gòu)建部件，以制備治療產(chǎn)物例如多重靶向性結(jié)構(gòu)域抗體，其中包含2個或更多個可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體結(jié)合至2個或更多個治療靶，或靶向肺或口服施用的結(jié)構(gòu)域抗體。發(fā)明概述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，新世界靈長類提供了抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的豐富來源，所述抗體針對一系列抗原(包括人抗原)。此外，由于人和新世界靈長類之間的序列的相似性，可能這些新世界靈長類序列在人中將具有相對較低的免疫原性。在第一個方面，本發(fā)明提供了嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗原結(jié)合部分包含至少2個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和至少3個構(gòu)架區(qū)，其中至少一個CDR是新世界靈長類CDR。在另一個方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分的方法，所述方法包括從包含至少2個CDRs和至少3個構(gòu)架區(qū)的人抗體可變區(qū)中刪除CDR，并將它替換為預(yù)測具有低免疫原性的新世界靈長類CDR，以產(chǎn)生嵌合可變區(qū)。在一個相關(guān)方面，所述方法進(jìn)一步包括回收所述嵌合可變區(qū)的步在另外一個方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含有效量的根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，以及藥學(xué)上可接受的賦形刑或稀釋劑。在一個更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分在診斷應(yīng)用中的用途，所述診斷應(yīng)用用于檢測與特定疾病或病癥有關(guān)的抗原o在另一個方面，本發(fā)明提供了用于在人受試者中治療特征在于人TNF-ot活性的疾病或病癥的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用有效量的如本文所述的嵌合抗體或其藥物組合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合TNF-ot。附圖簡述圖l證實(shí)了AB138與大鼠脊髓裂解物(泳道2)中存在的大鼠MOG結(jié)合而不與CH0K1SV裂解物(泳道3)結(jié)合。泳道1包含分子量標(biāo)記。圖2證實(shí)了抗TNFcx單克隆抗體缺乏與大鼠脊髄裂解物(泳道2)和CH0K1SV裂解物(泳道3)中存在的大鼠MOG的相同樣品的非特異性結(jié)合。泳道1包含分子量標(biāo)記。圖3顯示了接納體(acceptor)結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸和核苷酸序列(2條鏈)。圖中指出了關(guān)于切除包括CDR2在內(nèi)的區(qū)域的KpnI和SanDI的限制消化位點(diǎn)。CDR2殘基以下劃線標(biāo)明。圖4是使用AUgnX(VectorNTI,Inv"rogen，Australia)進(jìn)行的結(jié)構(gòu)域抗體接納體序列與一組源自新世界靈長類的免疫球蛋白序列的序列比對.CDR2以粗體文本突出顯示。發(fā)明詳述在第一個方面，本發(fā)明提供了嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗原結(jié)合部分包含至少2個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和至少3個構(gòu)架區(qū)，其中至少一個CDR是新世界靈長類CDR。優(yōu)選地，所述抗原結(jié)合部分包含3個CDRs和4個構(gòu)架區(qū)。還優(yōu)選地，所述抗原結(jié)合部分包含至少一個，優(yōu)選2個人CDRs。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分包含1個新世界靈長類CDR。在其他實(shí)施方案中，所述嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分包含2個新世界靈長類CDRs。在其他實(shí)施方案中，所述抗體或抗原結(jié)合部分的CDR2是新世界靈長類CDR。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，所述至少一個新世界靈長類CDR不來自結(jié)合靶抗原的序列。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，所述構(gòu)架區(qū)是人序列。為人序列的構(gòu)架區(qū)包括衍生自人構(gòu)架區(qū)的序列，或基于人構(gòu)架區(qū)的合成序列。可以對抗原結(jié)合部分的序列進(jìn)一步實(shí)施親和力成熟，以便改善其抗原結(jié)合特征例如抗原結(jié)合或效力，這在本發(fā)明的范圍內(nèi)。結(jié)合的增加通過抗體或其抗原結(jié)合部分的KDU。,,/K。fl)的減少而得到證實(shí)。效力的增加在生物學(xué)測定法中得到證實(shí)。例如，可以用于測量抗體或其抗原結(jié)合部分的效力的測定法包括TNFoc誘導(dǎo)的L929細(xì)胞毒性中和測定法，IL-12誘導(dǎo)的人PHA活化的外周血單核細(xì)胞(PBMC)增殖測定法，和RANKL介導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞的破骨細(xì)胞分化(Stern，Proc.Natl,Acad.Sci.USA87:6808-6812(1990);Kong,Y-Y.等人，Nature397:315-323(1990);Matthews,N.和M.L.Neale，z戸/7力d/i7esfl/d//^er/"eraos,a戶rsc〃ca/J"roac力，1987，M.J.Clemens,A.G.Morris和A.J.H.Gearing,編輯，IRLPress,第221頁)。在一個進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一個構(gòu)架區(qū)被修飾，以增加結(jié)合和/或減少預(yù)測的在人中的免疫原性。在另一個實(shí)施方案中，至少一個CDR序列被修飾，以增加結(jié)合或效力和或減少預(yù)測的在人中的免疫原性。優(yōu)選地，其中被修飾的至少一個CDR序列不是新世界靈長類CDR。當(dāng)存在2個或更多個新世界靈長類CDRs時，優(yōu)選地至少一個新世界靈長類CDR是未經(jīng)修飾的。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，除了至少一個CDR序列外，至少一個構(gòu)架區(qū)被修飾，以增加結(jié)合和或減少預(yù)測的在人中的免疫原性。優(yōu)選地，被修飾的至少一個CDR序列不是新世界靈長類CDR序列。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合部分是結(jié)構(gòu)域抗體。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域抗體可以是多聚化的，如例如異或同二聚體(例如，VH/VH、Vl/Vl或Vh/Vl)，異或同三聚體(例如，VH/VH/VH、VL/VL/VL、Vh/Vh/Vl或Vh/Vl/Vl)，異或同四聚體(例如，Vh/Vh/仇、Vl/Vl/Vl/Vl、Vh/Vh/Vh，Vl、VH/VH/VL/Vjvh/vl/vl/vl),或更高次的異或同多聚體。多聚化可以增加抗原結(jié)合的強(qiáng)度，其中結(jié)合的強(qiáng)度與多個結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合親和力總和或其部分有關(guān)。因此，本發(fā)明提供了結(jié)構(gòu)域抗體，其中所述結(jié)構(gòu)域抗體與至少一個其他結(jié)構(gòu)域抗體連接。每個結(jié)構(gòu)域抗體可以與相同或不同的抗原結(jié)合。結(jié)構(gòu)域抗體多聚體可以進(jìn)一步包含一個或多個結(jié)構(gòu)域抗體，所述結(jié)構(gòu)域抗體是連接的并且其中每個結(jié)構(gòu)域抗體與不同的抗原結(jié)合，多特異性配體，包括所謂的"雙重特異性配體"。例如，雙重特異性配體可以包含一對VH結(jié)構(gòu)域或一對Vt結(jié)構(gòu)域。此類雙重特異性配體在DomantisLtd的WO2004/003019(PCT/GB2003/002804)中描述，所述專利整體引入本文作為參考。優(yōu)選地，所述抗體或抗原結(jié)合部分進(jìn)一步包含人或非人靈長類恒定區(qū)序列。非人靈長類的例子包括但不限于，黑猩猩、猩猩和狒狒。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分的方法，所述方法包括從包含至少2個CDRs和至少3個構(gòu)架區(qū)的人抗體可變區(qū)中刪除CDR，并將它替換為預(yù)測具有低免疫原性的新世界靈長類CDR，以產(chǎn)生嵌合可變區(qū)。在一個相關(guān)方面，所述方法進(jìn)一步包括回收所述嵌合可變區(qū)的步優(yōu)選地，所選擇的新世界靈長類CDR是CDR2。優(yōu)選地，CDR2序列選自KVSNRAS、RVSNRAS、KVSTRGP、AASNRAS、TSSNLQA、DASSLQP和YASFLQG。由于其預(yù)測的較低的免疫原性，特別優(yōu)選的序列是KVSNRAS、AASNRAS、TSSNLQA和KVSTRGP。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括修飾所述嵌合可變區(qū)的序列，以增加結(jié)合和/或減少在人中的免疫原性。優(yōu)選地，所述新世界靈長類CDR序列是未經(jīng)修飾的。當(dāng)存在2個或更多個新世界靈長類CDR序列時，優(yōu)選地至少一個新世界靈長類CDR是未經(jīng)修飾的。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，除了至少一個CDR序列外，至少一個構(gòu)架區(qū)被修飾，以增加結(jié)合和或減少預(yù)測的在人中的免疫原性。優(yōu)選地，被修飾的至少一個CDR序列不是新世界靈長類CDR序列。本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分。如本文所使用的，術(shù)語"抗體，，意指免疫球蛋白分子，其由通過二硫鍵鏈間連接的4條多肽鏈組成2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(HCVR或VJ和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)包含3個結(jié)構(gòu)域CH1、Ch2和CH3。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(LCVR或Vl)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由1個結(jié)構(gòu)域組成C"Vh和Vl區(qū)可以進(jìn)一步再分成稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的具有高可變性的區(qū)域，其中散布著稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守的區(qū)域。每個Vh和Vl由3個CDRs和4個FRs組成，從氨基末端到羧基末端以下列順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。如本文所使用的，術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"指免疫球蛋白的一個或多個組分或衍生物，其顯示出與抗原結(jié)合的能力。已顯示，抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長抗體的片段來執(zhí)行。包含在術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"內(nèi)的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段，由l、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab"2片段，包含在鉸鏈區(qū)通過二硫橋連接的2個Fab片段的二價片段；(iii)由Vh和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單個臂的Vl和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(v)由單個VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域(vandenBeukenT等人，2001，J.Mol.Biol，310，591)組成的dAb片段(Ward等人，1989，Nature341:544-546);和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的2個結(jié)構(gòu)域l和VH由分開的基因編碼，但它們可以使用重組方法通過合成的連接體來進(jìn)行連接，所述合成的連接體使得它們能夠制備為單條蛋白質(zhì)鏈，其中1和、區(qū)配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv);(參見例如Bird等人，1988，Science242:423-426和Huston等人，1988Proc.Natl.Acad.Sci,USA85:5879-5883)。此類單鏈Fvs也希望包含在術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"內(nèi)。還包含其他形式的單鏈Fvs和相關(guān)分子，例如雙抗體或三抗體。雙抗體是二價抗體，其中Vh和VL結(jié)構(gòu)域在單條多肽鏈上表達(dá)，但使用太短而不允許同一鏈上的所述2個結(jié)構(gòu)域之間配對的連接體，從而迫使所述結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對并形成2個抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見例如，Holliger，P.，等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448;Poljak，R.J.，等人，1994,Structure,2:1121-1123)。如本文所使用的，術(shù)語"嵌合"意指抗體或抗原結(jié)合部分包括來自2個不同物種的序列。在一個實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域抗體包含人構(gòu)架區(qū)和至少一個新世界靈長類CDRs，更優(yōu)選狨CDRs。優(yōu)選地，新世界靈長類選自狨、糈、松鼠猴、青猴(titimonkey)、蜘蛛猴、絨毛猴(woollymonkey)、懸猴、禿猴、狐尾猴、夜或梟猴和吼猴。更優(yōu)選地，新世界靈長類是狨。生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的嵌合抗體的方法將是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。參見例如，美國專利號4,816,567、美國專利號5,585,089和US20030039649，所述專利整體引入本文作為參考。此類方法需要使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分在人宿主中具有預(yù)測的低免疫原性。"低免疫原性"意指抗體在接受抗體的至少大多數(shù)個體中不產(chǎn)生"低免疫原性"意指抗體在接受該抗體的至少大多數(shù)個體中不產(chǎn)生這樣的抗體應(yīng)答，即所述抗體應(yīng)答的量級足以減少以達(dá)到治療效果來說足夠的時間連續(xù)施用所述抗體的功效。在人中的免疫原性水平可以使用MHCII類結(jié)合預(yù)測程序Propred(http://www.imtech.res.in/raghava/propred)來預(yù)領(lǐng)'J,使用所有等位基因的1%閾值分析?？梢允褂玫钠渌绦虬≧ankpep(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html)Epibase(Algonomics專有軟件algonomics.com)。低免疫原性的分子將不包含或包含低數(shù)目的被預(yù)測與MHCII類等位基因結(jié)合的肽，所述MHCII類等位基因在靶群體中是高度表達(dá)的(FlowerDR，DoytchinovaIA.(2004)Immunoinformaticsandthepredictionofimmunogenicity，DrugDiscovToday,9(2):82-90)。相對于起始供體分子，免疫原性減少的分子將不包含或包含數(shù)目減少的被預(yù)測與MHCII類等位基因結(jié)合的肽，所述匪CII類等位基因在耙群體中是高度表達(dá)的。MHCII類結(jié)合的功能分析可以通過下述方法來進(jìn)行產(chǎn)生相應(yīng)于目的蛋白質(zhì)的重疊肽，并就其引起T細(xì)胞活化(T細(xì)胞增殖測定法)或替換才艮道肽——已知的MHCII類結(jié)合肽(HammerJ等人，1994，LExp.Med.，180:2353)的能力來測試這些肽。本發(fā)明進(jìn)一步基于用于擴(kuò)增新世界靈長類免疫球蛋白基因的方法，例如使用對重和輕鏈可變區(qū)基因家族特異的引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從由新世界靈長類淋巴細(xì)胞中提取的核酸中進(jìn)行擴(kuò)增。隨后，將擴(kuò)增的可變區(qū)克隆到包含人或靈長類恒定區(qū)基因的表達(dá)載體內(nèi)，用于產(chǎn)生新世界靈長類嵌合重組抗體。使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA方法來獲得抗體重和輕鏈基因，將這些基因合并入重組表達(dá)載體中并且將載體引入宿主細(xì)胞中，所述宿主細(xì)胞例如為在Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis(編輯)，MolecularCloning:alaboratorymanual,第2版，ColdSpringHarbor,N,Y(1989)中描述的那些。合適的表達(dá)載體將是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。產(chǎn)生免疫球蛋白的新世界靈長類淋巴細(xì)胞通常通過與骨髓瘤細(xì)胞系融合以產(chǎn)生雜交瘤而變得永生。用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的優(yōu)選哺乳動物宿主細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0)、NSO骨髓瘤細(xì)胞、C0S細(xì)胞和SP2細(xì)胞。除了哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)外，本發(fā)明還考慮了非哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的使用，例如衍生自植物或原核生物(細(xì)菌)的那些表達(dá)系統(tǒng)。此類表達(dá)系統(tǒng)將是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。VH、、和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域儲庫可以是天然存在的免疫球蛋白序列儲庫或合成的儲庫。天然存在的儲庫是例如從表達(dá)免疫球蛋白的細(xì)胞制備的儲庫，所述表達(dá)免疫球蛋白的細(xì)胞從一種或多種靈長類中收獲。此類儲庫可以是原初的(naive)，即從新生的表達(dá)免疫球蛋白的細(xì)胞制備，或者是重排的，即從例如成年靈長類B細(xì)胞制備。需要時，隨后對從天然儲庫或任何儲庫中鑒定的結(jié)合靶抗原的克隆實(shí)施誘變并進(jìn)一步進(jìn)行篩選，以產(chǎn)生和選擇具有改善的結(jié)合特征的變體。免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的合成儲庫通過將多樣性人工引入經(jīng)克隆的可變結(jié)構(gòu)域中來制備。此類親和力成熟技術(shù)將是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的(IrvingR.A.等人(2001)Ribosomedisplayandaffinitymaturation:fromantibodiestosingleV-domainsandstepstowardscancertherapeutics,JournalofImmunologicalMethods,248:31-45)。新世界靈長類抗體基因的可變區(qū)或其CDR可以通過下述方法來克隆提供核酸例如cDNA，提供與編碼抗體基因的5'前導(dǎo)序列的cDNA序列互補(bǔ)的引物，使那種cDNA與引物接觸以形成雜交復(fù)合物，并擴(kuò)增cDNA以產(chǎn)生編碼新世界靈長類抗體基因的可變區(qū)(或CDR區(qū))的核酸。本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將會意識到，非新世界靈長類可變區(qū)序列可以用作接納體用于使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)來嫁接新世界靈長類序列，特別是CDR序列。例如，美國專利號5，585，089描述了用于制備低免疫原性的嵌合抗體的方法，所述嵌合抗體保留了非人親本抗體的高親和力，并且包含來自供體免疫球蛋白的一個或多個CDRs和來自人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)。美國公開號20030039649描述了用于制備低免疫原性的嵌合抗體(包含來自非人抗體的CDR序列和人抗體的構(gòu)架序列)的人源化方法，基于使用規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)類型的非人抗體，相對于種系規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)類型的人抗體，其作為用于選擇用于人源化抗體的合適的人構(gòu)架序列的基礎(chǔ)。因此，這些原則可以應(yīng)用于將一個或多個新世界靈長類CDRs嫁接到非新世界靈長類接納體可變區(qū)內(nèi)。CDR序列可以得自從抗體分離的基因組DM，或得自數(shù)據(jù)庫中存在的序列，所述數(shù)據(jù)庫例如為國家生物技術(shù)信息中心(NationalCentreforBiotechnologyInformation)蛋白質(zhì)和核苷酸數(shù)據(jù)庫，KabatDatabaseofSequencesofProteinsofI邁munologicalInterest,CDR序列可以是基因組DNA或cDNA。用于將替代CDR嫁接到接納體可變序列內(nèi)的方法將是本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉的。通常，對于每個可變輕鏈和可變重鏈或者在結(jié)構(gòu)域抗體的情況下對于單條鏈，將CDRs嫁接到接納體可變區(qū)序列內(nèi)。本發(fā)明的優(yōu)選方法涉及經(jīng)由引物指導(dǎo)的誘變來替換可變區(qū)序列中的CDR1,或更優(yōu)選地CDR2。該方法由下述步驟組成使編碼所需突變的合成寡核苷酸與靶區(qū)域退火，其中它充當(dāng)引物用于起始體外DNA合成；通過DNA聚合酶延伸寡核苷酸以產(chǎn)生攜帶所需突變的雙鏈DNA;和將該序列連接并克隆到合適的表達(dá)載體中(Sambrook,Joseph;和DavidW.Russell(2001).JZa60r"oiy船/7ws/，第3版，ColdSpringHarbor,N.Y，ColdSpringHarborLaboratoryPress)。更進(jìn)一步地，抗體或其抗原結(jié)合部分可以是較大的免疫粘附分子的一部分，所述較大的免疫粘附分子通過使抗體或抗體部分與一種或多種其他蛋白質(zhì)或肽共價或非共價結(jié)合來形成。此類免疫粘附分子的例子包括使用鏈霉抗生物素蛋白核心區(qū)來制備四聚scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等人(1995)HumanAntibodiesandHybridomas6:93-101)，以及使用半胱氨酸殘基、標(biāo)記肽和C-末端多組氨酸標(biāo)簽來制備二價和生物素化的scFv分子(Kipriyanov,S.M,，等人(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)。使用常規(guī)技術(shù)可以由完整抗體制備抗體部分例如Fab和F(ab')2片段，例如分別用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗體。此外，使用如本文所述的和技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)，可以獲得抗體、抗體部分和免疫粘附分子。恒定區(qū)序列(Fc部分)優(yōu)選從人或非人靈長類免疫球蛋白序列獲得。靈長類序列可以是新世界靈長類或舊世界靈長類序列。合適的舊世界靈長類包括黑猩猩，或其他類人猿例如大猩猩或猩猩，它們由于其與人的緊密的系統(tǒng)發(fā)生接近性而與人恒定區(qū)序列共享高度的同源性。編碼人或靈長類恒定區(qū)的序列可從數(shù)據(jù)庫中獲得，所述數(shù)據(jù)庫包括例如國家生物技術(shù)信息中心蛋白質(zhì)和核苷酸數(shù)據(jù)庫，KabatDatabaseofSequencesofProteinsofImmunologicalInterest,根據(jù)本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分能夠與人或非人抗原結(jié)合。優(yōu)選地，嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分所結(jié)合的抗原在性質(zhì)上是肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、糖蛋白、脂質(zhì)或糖脂，選自腫瘤相關(guān)抗原，包括癌胚抗原、EpCAM、Lewis-Y、Lewis-Y/b、PMSA、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、CD154、EGF-R、Her-2、TRAIL和VEGF受體，涉及免疫或炎性疾病或病癥的抗原，包括CD3、CD4、CD25、CD40、CD49d、MHCI類、MHCII類、GM-CSF、干擾素-y、IL-l、IL-12、IL-13、IL-23、TNF-ct和IgE，在宿主細(xì)胞上表達(dá)的抗原，包括糖蛋白IIb/IIIa、P-糖蛋白、噤呤能受體和粘附受體，包括CDlla、CDllb、CDllc、CD18、CD56、CD58、CD62或CD144,包含細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子或其他可溶性生理學(xué)調(diào)節(jié)劑或其受體的抗原，包括嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、IL-6、IL-8、TGF-P、C3a、C5a、VEGF、NGF及其受體，涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或病癥的抗原，包括p-淀粉樣蛋白和感染性蛋白質(zhì)，非人源的抗原例如微生物、納米生物或病毒抗原，或者毒素，包括呼吸道合胞病毒蛋白F、炭疽毒素、響尾蛇毒和地高辛；其中所述嵌合抗體充當(dāng)激動劑或拮抗劑，或者對于通過與補(bǔ)體或殺傷細(xì)胞(例如NK細(xì)胞)一起作用來消除(殺死或去除)不希望的細(xì)胞(例如，抗CD4)來說是有活性的，或者對于作為細(xì)胞毒劑或引起吞噬細(xì)胞對Fc受體的結(jié)合來說是有活性的，或者中和其靶的生物活性。更優(yōu)選地，抗原是TNFoc，優(yōu)選地人TNFot。備選地，所述嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分可以結(jié)合非人抗原。優(yōu)選地，所述非人抗原選自呼吸道合胞病毒F蛋白、巨細(xì)胞病毒、蛇毒和地高辛。如本文所使用的，術(shù)語"與……結(jié)合"意指通過抗體的免疫球蛋白可變區(qū)以1juM或更低的離解常數(shù)(Kd)與抗原結(jié)合，如通過表面等離子共振分析所測量的，使用例如BIAcoreTM表面等離子共振系統(tǒng)和BIAcoreTM動力學(xué)評估軟件(例如，版本2.1)。關(guān)于特異性結(jié)合相互作用的親和力或離解常數(shù)(Kd)優(yōu)選是約500nM-約50pM，更優(yōu)選約500nM或更低，更優(yōu)選約300nM或更低，和優(yōu)選至少約300nM-約50pM，約200nM-約50pM，和更優(yōu)選至少約100nM-約50pM，約75nM-約50pM，約10nM-約50pM。本發(fā)明的抗體在人治療中是有利的，因?yàn)檎T導(dǎo)人抗抗體應(yīng)答的可能性將被減少。通過篩選組合免疫球蛋白文庫(例如，噬菌體展示文庫)以分離顯示出所需結(jié)合特異性和功能行為的文庫成員，可以鑒定并分離根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的結(jié)合靶抗原的重組抗體。應(yīng)當(dāng)理解，其中使用抗原結(jié)合部分或抗體衍生物(例如Fabs、scFv和V結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域抗體)的所有方法都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。噬菌體展示技術(shù)在本領(lǐng)域中已廣泛地得到描述，并且用于產(chǎn)生并篩選此類文庫以及使其產(chǎn)物親和力成熟的方法和化合物的例子可以在下述參考文獻(xiàn)中找到例如，Barbas等人(1991)PNAS88:7978-7982;Clarkson等人(1991)Nature352:624-628;Dower等人PCT.91/17271,美國專利號5，427，908，美國專利號5，580，717和EP527,839;Fuchs等人(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Garrad等人(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Garrard等人PCTW092/09690;Gram等人(1992)PNAS89:3576-3580;Griffiths等人(1993)EMBOJ12:725-734;Griffiths等人，美國專利號5,885，793和EP589，877;Hawkins等人(1992)JMolBiol226:889-896;Hay等人(1992)Hu邁AntibodHybridomas3:81-85;Hoogenboom等人(1991)NucAcidRes19:4133-4137;Huse等人(1989)Science246:1275-1281;Knappik等人(2000)JMolBiol296:57-86;Knappik等人PCTWO97/08320;Ladner等人，美國專利號5，223，409，美國專利號5，403，484，美國專利號5，571，698，美國專利號5，837，500和EP436，597;McCafferty等人(1990)Nature348:552-554;McCafferty等人PCT.WO92/01047，美國專利號5,969,108和EP589,877;Salfeld等人PCTWO97/29131，美國臨時申請?zhí)?0/126，603;和Winter等人PCTWO92/20791和EP368，684。表達(dá)本發(fā)明的抗體的重組文庫可以在微生物例如酵母或細(xì)菌的表面上表達(dá)(參見PCT公開W099/36569和98/49286)。選擇的淋巴細(xì)胞抗體法(SelectedLymphocyteAntibodyMethod)或在現(xiàn)有技術(shù)中被稱為的SLAM,是快速產(chǎn)生高親和力抗體的另一種方法。與噬菌體展示方法不同，所有抗體全都是二價的。為了產(chǎn)生新世界靈長類抗體，用人抗原例如TNFot多肽免疫新世界靈長類。在免疫后，取出細(xì)胞并在獨(dú)個微量孔中進(jìn)行選擇性增殖。從孔中取出上清液并就結(jié)合和功能進(jìn)行測試?？梢曰厥栈蛐蛄杏糜诤罄m(xù)操作，例如人源化、Fab片段、scFv或結(jié)構(gòu)域抗體產(chǎn)生。因此，另一個例子是通過SLAM及其衍生形式(Babcook，J.S.等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci，USA93;7843-7848，美國專利5，627，052和PCT公開WO92/02551)來衍生本發(fā)明的配體。SLAM的調(diào)整形式，例如使用備選方法來測試上清液，例如淘選，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一種表達(dá)系統(tǒng)中，在核糖體上展示重組肽/蛋白質(zhì)文庫(例如參見Roberts，RW和Szostak，J.W.1997.Proc.Nat1.Acad.Sci.USA.94:12297-123202以及PCT公開號W098/31700)。因此，另一個例子涉及優(yōu)選但不限于從經(jīng)免疫的細(xì)胞制備的DNA文庫(例如抗體和衍生物)的產(chǎn)生和體外轉(zhuǎn)錄，翻譯該文庫，從而使得蛋白質(zhì)和"經(jīng)免疫的"mRNAs停留在核糖體上，親和力選擇(例如通過與RSP結(jié)合)，mRNA分離，反向翻譯和后續(xù)擴(kuò)增(例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或相關(guān)技術(shù))。必要時可以偶聯(lián)另外的選擇和擴(kuò)增循環(huán)，以通過在這種系統(tǒng)中引入體細(xì)胞突變或通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的其他親和力成熟方法來進(jìn)行親和力成熟。另一個例子考慮應(yīng)用乳狀液區(qū)室化技術(shù)(emulsioncompartmentalisationtechnology)以產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。在乳狀液區(qū)室化中，將體外和光學(xué)分選方法與在乳狀液的油滴內(nèi)的水相中翻譯的蛋白質(zhì)及其核苷酸編碼序列的共區(qū)室化相組合(參見PCT公開號WO99026711和W00040712)。用于生產(chǎn)和選擇抗體的主要要素基本上類似于核糖體展示的體外方法。根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以與另一種功能分子衍生或連接。例如，抗體或抗原結(jié)合部分可以通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價結(jié)合或其他方式與一種或多種其他分子實(shí)體進(jìn)行功能上連接，所述其他分子實(shí)體例如為另一種抗體、可檢測的試劑、細(xì)胞毒劑、藥物試劑和/或可以介導(dǎo)抗體或其抗原結(jié)合部分與另一種分子(例如鏈霉抗生物素蛋白核心區(qū)或多組氨酸標(biāo)簽)結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽?？贵w或其抗原結(jié)合部分可以與之衍生的有用的可檢測試劑包括熒光化合物。示例性的熒光可檢測試劑包括熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、5-二甲基胺-l-萘磺酰氯、藻紅蛋白等。抗體還可以用可檢測的酶進(jìn)行衍生化，例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶等。當(dāng)抗體用可檢測的酶進(jìn)行衍生化時，它通過添加該酶用于產(chǎn)生可檢測的反應(yīng)產(chǎn)物的另外試劑來檢測?？贵w還可以用生物素進(jìn)行衍生化，并通過間接測量抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合進(jìn)行檢測。本發(fā)明還擴(kuò)展至聚乙二醇化的抗體或抗原結(jié)合部分，其相對于非聚乙二醇化的抗體多肽而言提供了增加的半衰期和針對降解的抗性而無活性(例如結(jié)合親和力)的損失。如本文所述的抗體或抗原結(jié)合部分可以使用本領(lǐng)域已知的方法與聚合物分子(優(yōu)選PEG)偶聯(lián)，所述聚合物分子對于達(dá)到增加的半衰期和降解抗性性質(zhì)是有用的。可以在本發(fā)明中使用的聚合物部分可以是合成的或天然存在的，并且包括但不限于，直鏈或支化的聚亞烷基、聚亞烯基或聚氧化烯聚合物，或分支或未分支的多糖例如同或雜多糖。可以在本發(fā)明中使用的合成聚合物的優(yōu)選例子包括直鏈或支化的聚(乙二醇)(PEG)、聚(丙二醇)或聚(乙烯醇)，及其衍生物或取代的形式。用于與本文所述的抗體連接的特別優(yōu)選的取代的聚合物包括取代的PEG,包括曱氧基(聚乙二醇)。除PEG外可以使用的，或可以代替PEG使用的天然存在的聚合物部分包括乳糖、直鏈淀粉、葡聚糖或糖原，以及將由本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可的其衍生物。聚合物分子的衍生形式包括例如這樣的衍生物，其中存在另外的部分或反應(yīng)性基團(tuán)以允許與本文所述的抗體多肽的氨基酸殘基相互作用。此類衍生物包括N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活性酯，琥珀酰亞胺基丙酸酯聚合物，和巰基-選擇性反應(yīng)試劑例如馬來酰亞胺，乙烯砜和硫醇。特別優(yōu)選的衍生化的聚合物包括但不限于具有下式的PBG聚合物PEG-0-CH2CH2CH2-C02-NHS;PEG-0-CH2-NHS;PEG-0-CH2CH2,-NHS;PEG-S-CH2CH2-CO-NHS;PEG-02CNH-CH(R)-C02-NHS;PEG4HC0-CH2CH2-C0-NHS;和PEG-0-CH2-C02-NHS;其中R是(CH2)4)NHC02(mPEG)。PEG聚合物可以是線性分子，或可以是分支的，其中多個PEG部分存在于單個聚合物中。反應(yīng)性基團(tuán)(例如，MAL、NHS、SPA、VS或巰基)可以直接與PEG聚合物連接，或可以經(jīng)由連接體分子與PEG連接。在本發(fā)明中可用的聚合物的大小可以為500Da-60kDa，例如，lOOODa-60kDa，10kDa-60kDa,20kDa-60kDa，30kDa-60kDa，40kDa-60kDa,以及高達(dá)50kDa-60kDa。在本發(fā)明中4吏用的聚合物，特別是PEG，可以是直鏈聚合物或可以具有分支的構(gòu)象。在本發(fā)明中可用的聚合物(PEG)分子可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法與抗體或其抗原結(jié)合部分附著。在PEG或其他聚合物部分與本發(fā)明的抗體多肽單體或多聚體附著中的第一個步驟是用包含親電子體的官能團(tuán)替換PEG聚合物的羥基末端基團(tuán)。特別地，將PEG聚合物與抗體多肽單體或多聚體中存在的半胱氨酸或賴氨酸殘基附著。所述半胱氨酸和賴氨酸殘基可以是天然存在的，或可以被改造到抗體多肽分子中。例如，半胱氨酸殘基可以在抗體多肽的C-末端上進(jìn)行重組改造，或者在抗體多肽中特異的溶劑可接近位置處的殘基可以用半胱氨酸或賴氨酸置換?？梢詫⒖贵w與能夠增加其體內(nèi)半衰期的一種或多種分子連接。這些分子在抗體上除抗原結(jié)合位點(diǎn)外的位點(diǎn)處與抗體連接，從而它們不千擾/在空間上阻礙抗原結(jié)合位點(diǎn)。通常，此類分子是體內(nèi)天然存在并且抵抗經(jīng)由內(nèi)源性機(jī)制的降解或去除的多肽。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以使用此類天然存在的分子的片段或衍生物，并且某些可以不是多肽。增加半衰期的分子可以選自下述(a)來自細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)，例如，膠原，層粘連蛋白，整聯(lián)蛋白和纖連蛋白；(b)在血液中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，例如纖維蛋白，oc-2巨球蛋白，血清白蛋白，纖維蛋白原A，纖維蛋白原B，血清淀粉樣蛋白A,庚珠蛋白(heptaglobin)，蛋白質(zhì)，泛蛋白，子宮球蛋白(uteroglobulin)，p-2微球蛋白，纖溶酶原，溶菌酶，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，oc-l-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制劑；(c)免疫血清蛋白，例如IgE，IgG，IgM;(d)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，例如視黃醇結(jié)合蛋白，a-l微球蛋白；(e)防衛(wèi)素，例如p-防衛(wèi)素l，嗜中性粒細(xì)胞防衛(wèi)素l、2和3;(f)在血腦屏障處或在神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，例如黑皮質(zhì)素受體、髓磷脂、抗壞血酸轉(zhuǎn)運(yùn)體；(g)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性配體-神經(jīng)藥物試劑融合蛋白(參見US5977307);腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞受體，轉(zhuǎn)鐵蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，胰島素，胰島素樣生長因子1(IGF1)受體，胰島素樣生長因子2(IGF2)受體，胰烏素受體；(h)定位于腎的蛋白質(zhì)，例如多嚢蛋白，IV型膠原，有機(jī)陰離子運(yùn)栽體Kl，Heymann's抗原；(i)定位于肝的蛋白質(zhì)，例如乙醇脫氫酶，G250;(j)凝血因子X;(k)oc-l抗胰蛋白酶；(1)HNF1ot;(m)定位于肺的蛋白質(zhì)，例如分泌組分(結(jié)合IgA);(n)定位于心臟的蛋白質(zhì)，例如HSP27;(o)定位于皮膚的蛋白質(zhì)，例如角蛋白；(P)骨特異性蛋白質(zhì)，例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)，例如BMP-2、-4、-5、-6、-7(也稱為成骨蛋白(0P-1))和-8(0P-2);(q)腫瘤特異性蛋白質(zhì)，例如人滋養(yǎng)層抗原，赫賽汀(herceptin)受體，雌激素受體，組織蛋白酶例如組織蛋白酶B(在肝和脾中發(fā)現(xiàn))；(r)疾病特異性蛋白質(zhì)，例如僅在活化的T-細(xì)胞上表達(dá)的抗原包括LAG-3(淋巴細(xì)胞活化基因)；護(hù)骨蛋白配體(OPGL)，參見Nature402，304-309，1999;0X40(TNFa受體家族的成員，在活化的T細(xì)胞上表達(dá)，以及為已知在產(chǎn)生人T細(xì)胞白血病病毒I型(HTLV-I)的細(xì)胞中特異性地上調(diào)的唯一共刺激T細(xì)胞分子——參見J.Immunol.2000Jull;16561:263-70);金屬蛋白酶(與關(guān)節(jié)炎/癌癥相關(guān))，包括CG6512果蠅，人截癱蛋白，人FtsH，人AFG3L2，鼠類ftsH;血管生成生長因子，包括酸性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-1)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-2)，血管內(nèi)皮生長因子/血管通透性因子(VEGF/VPF)，轉(zhuǎn)化生長因子-a(TGF-a)，腫瘤壞死因子-a(TNF-a)，血管生成素，白介素-3(IL-3)，白介素-8(IL-8)，血小板衍生內(nèi)皮生長因子(PD-ECGF),胎盤生長因子(P1GF)，中期因子(midkine)血小板衍生生長因子-BB(PDGF)，CXXXC趨化分子(fractalkine);(s)應(yīng)激蛋白質(zhì)(熱休克蛋白)；(t)參與Fc轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)；和(u)維生素，例如B12，生物素。在另一個方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含有效量的根據(jù)本發(fā)明的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑或稀釋劑。"藥學(xué)上可接受的賦形劑或稀釋劑"包括生理學(xué)相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、涂覆劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。藥學(xué)上可接受的載體的例子包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合中的一種或多種。在許多情況下，優(yōu)選地將是在組合物中包括等滲劑，例如糖，多元醇例如甘露醇、山梨糖醇，或氯化鈉。藥學(xué)上可接受的物質(zhì)例如濕潤劑或者少量輔助物質(zhì)例如濕潤或乳化劑、防腐劑或緩沖劑。術(shù)語"有效量"指足以治療指定疾病或病癥或一種或多種其癥狀，和/或預(yù)防所述疾病或病癥發(fā)生的抗體或其抗原結(jié)合部分(包括包含抗體或其抗原結(jié)合部分的藥物組合物)的量。術(shù)語"診斷有效量"或"對于診斷來說有效的量，，及其同源術(shù)語指足以診斷指定疾病或病癥和/或一種或多種其表現(xiàn)的抗體或其抗原結(jié)合部分(包括包含抗體或其抗原結(jié)合部分的藥物組合物)的量，其程度或嚴(yán)重度。通常，診斷將相對于在沒有所述疾病或病癥的個體中觀察到的基線或背景檢測水平來進(jìn)行。超過背景或基線水平的檢測水平(升高的檢測水平)是存在的指示，并且在某些情況下是病狀嚴(yán)重度的指示。當(dāng)相關(guān)于治療方法以及抗體或其抗原結(jié)合部分(包括包含抗體或其抗原結(jié)合部分的藥物組合物)的用途進(jìn)行使用時，"有此需要的"個體可以是被診斷為患有待治療的疾病或病癥，或者先前對于待治療的疾病或病癥進(jìn)行治療的個體。相關(guān)于診斷方法，"有此需要的"個體可以是懷疑患有疾病或病癥，處于疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)中，或先前被診斷為具有所述疾病或病癥的個體(例如，診斷可以包括隨著時間過去和/或與治療一起地監(jiān)控疾病或病癥的嚴(yán)重度(例如，進(jìn)展/消退))。優(yōu)選的是，嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分阻斷或刺激受體功能或中和活性可溶性產(chǎn)物，例如一種或多種白介素，TNFoc或C5a。更優(yōu)選地，活性可溶性產(chǎn)物是人TNFot。所述組合物可以是各種形式，包括液體、半固體或固體劑型，例如液體溶液(例如的可注射和可輸注的溶液)，分散液或懸浮液，片劑，丸劑，粉劑，脂質(zhì)體或栓劑。優(yōu)選地，所述組合物是用于免疫接種的可注射溶液的形式。施用可以是靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)皮、鞘內(nèi)和動脈內(nèi)。優(yōu)選地，劑型為每天、每周、每二或三周或每月施用約0.001mg-約10mg/kg體重，更優(yōu)選地每周約0.05-約5mg/kg體重。所述組合物還可以配制為用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末。在某些實(shí)施方案中，活性化合物可以用載體來制備，所述載體將保護(hù)化合物不被快速釋放，例如受控釋放制劑，包括植入物，透皮貼劑和微膠嚢化的遞送系統(tǒng)?？梢允褂孟嗳莸木酆衔?，例如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，膠原，聚原酸酯或聚乳酸。所述組合物還可以配制用于口服施用。在這個實(shí)施方案中，抗體可以封裝在硬或軟殼明膠膠嚢中，壓縮成片劑，或直接摻入受試者的飲食內(nèi)。所述組合物還可以配制用于直腸施用。可以施用所述抗體以便在體外和體內(nèi)與所選擇的細(xì)胞結(jié)合并鑒定所選擇的細(xì)胞，在體內(nèi)與所選擇的細(xì)胞結(jié)合并破壞所選擇的細(xì)胞，或者在體內(nèi)滲透到所選擇的細(xì)胞內(nèi)并破壞所選擇的細(xì)胞。備選地，所述抗體可以用作免疫毒素，以將細(xì)胞毒劑例如毒素或化學(xué)治療劑遞送至特定細(xì)胞類型例如肺瘤細(xì)胞。免疫毒素的產(chǎn)生將是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。常用于產(chǎn)生免疫毒素的細(xì)胞毒劑包括放射性同位素例如出In或9°Y，硒，核糖核酸酶，刪除了結(jié)合結(jié)構(gòu)域的截短的微生物毒素例如假單胞菌外毒素或白喉毒素，微管蛋白抑制劑例如加利車霉素(ozagamicin)，美登木素生物堿(包括DM-1)，auristatins和紅豆杉醇類(taxoids)，核糖體滅活蛋白例如蓖麻毒素，ebulinl，肥皂草毒蛋白和白樹毒蛋白，和前體藥物例如美法侖。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物給人施用。本發(fā)明還提供了嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分在診斷應(yīng)用中的用途，所述診斷應(yīng)用用于檢測與特定疾病或病癥有關(guān)的抗原。更具體而言，根據(jù)第三個方面，本發(fā)明提供了嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分在用于診斷具有與特定疾病或病癥有關(guān)的抗原的受試者的方法中的用途，所述方法包括給所述受試者施用診斷有效量的藥物組合物。優(yōu)選地，受試者是人。例如，嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分(優(yōu)選地經(jīng)標(biāo)記的)可以用于檢測生物樣品例如血清或血漿中抗原的存在，或升高的抗原(例如TNF-ot)水平，使用常規(guī)的免疫測定法，例如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)或組織免疫組織化學(xué)。優(yōu)選地，嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分所結(jié)合的抗原在性質(zhì)上是肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、糖蛋白、脂質(zhì)或糖脂，選自腫瘤相關(guān)抗原，包括癌胚抗原、EpCAM、Lewis-Y、Lewis-Y/b、PMSA、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、CD154、EGF-R、Her-2、TRAIL和VEGF受體,涉及免疫或炎性疾病或病癥的抗原，包括CD3、CD4、CD25、CD40、CD49d、MHCI類、MHCII類、GM-CSF、干擾素-Y、IL-1、IL-12、IL-13、IL-23、TNF-ot和IgE，在宿主細(xì)胞上表達(dá)的抗原，包括糖蛋白1Ib/IIIa、P-糖蛋白、噪呤能受體和粘附受體，包括CDlla、CDllb、CDllc、CD18、CD56、CD58、CD62或CD144，包含細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子或其他可溶性生理學(xué)調(diào)節(jié)劑或其受體的抗原，包括嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、IL-6、IL-8、TGF-P、C3a、C5a、VEGF、NGF及其受體，涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或病癥的抗原，包括P-淀粉樣蛋白和感染性蛋白質(zhì)，非人源的抗原例如微生物、納米生物或病毒抗原，或者毒素，包括呼吸道合胞病毒蛋白F、炭疽毒素、響尾蛇毒和地高辛；其中所述嵌合抗體充當(dāng)激動劑或拮抗劑，或者對于通過與補(bǔ)體或殺傷細(xì)胞(例如NK細(xì)胞)一起作用來消除(殺死或去除)不希望的細(xì)胞(例如，抗CD4)來說是有活性的，或者對于作為細(xì)胞毒劑或引起吞噬細(xì)胞對Fc受體的結(jié)合來說是有活性的，或者中和其靶的生物活性。根據(jù)本發(fā)明的抗人TNFoc嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分還可以在其中希望抑制TNFoc活性的細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中使用。本發(fā)明還提供了用于在人受試者中治療特征在于人TNFoc活性的疾病或病癥的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合TNFa。如本文所使用的，術(shù)語"特征在于人TNFoc活性的疾病或病癥"意欲包括這樣的疾病或病癥，即其中在患有所述疾病或病癥的受試者中TNFa的存在已顯示負(fù)責(zé)或被懷疑負(fù)責(zé)所述疾病或病癥的病理生理學(xué)，或者已顯示是或被懷疑是促成所述疾病或病癥惡化的因素。因此，其中TNFot活性有害的疾病或病癥是其中預(yù)期TNFa活性的抑制將減輕所述疾病或病癥的癥狀和/或進(jìn)展的疾病或病癥。此類疾病或病癥可以由例如患有所述疾病或病癥的受試者中生物學(xué)液體中的TNFoc濃度增加(例如，受試者的血清、血漿、滑膜液等中的TNFa濃度增加)而得到證明，這可以例如使用對于TNFoc特異的本發(fā)明嵌合抗體來檢測。特征在于人TNFa活性的疾病或病癥意欲包括這樣的疾病或病癥以及其他疾病或病癥，即其中在患有所述疾病或病癥的受試者中TNFa的存在已顯示負(fù)責(zé)或被懷疑負(fù)責(zé)所述疾病或病癥的病理生理學(xué)，或者已顯示是或被懷疑是促成所述疾病或病癥惡化的因素。優(yōu)選地，特征在于人TNFoc活性的疾病或病癥選自敗血癥，包括敗血癥性休克、內(nèi)毒素性休克、革蘭氏陰性敗血癥和中毒性休克綜合征；自身免疫性疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊推炎、骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、過敏癥、多發(fā)性硬化癥、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和腎病綜合征；傳染病，包括由于感染和感染后繼發(fā)的惡病質(zhì)而引起的發(fā)熱和肌痛；移植物抗宿主?。荒[瘤生長或轉(zhuǎn)移；肺部疾病，包括成人呼吸窘迫綜合征、休克肺、慢性肺部炎性疾病、肺結(jié)節(jié)病、肺纖維化和硅肺??；炎性腸病，包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎；心臟??；炎性骨病，肝炎，凝血紊亂，燒傷，再灌注損傷，瘢痕瘤形成和瘢痕組織形成。還可以將補(bǔ)充的活性化合物摻入所述組合物中?？贵w或抗原結(jié)合部分可以與一種或多種另外的治療劑共配制和/或與一種或多種另外的治療劑同時、分開或順次施用，所述另外的治療劑例如為與其他靶例如細(xì)胞因子或細(xì)胞表面分子結(jié)合的抗體，或者備選地為抑制人TNFa產(chǎn)生或活性的一種或多種化學(xué)試劑。在另一個方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含治療有效量的本發(fā)明的嵌合抗體或抗原結(jié)合部分，或者含有治療有效量的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分的藥物組合物，以及包裝和使用說明書。在某些實(shí)施方案中，使用說明書包括關(guān)于如何有效地施用治療量的本發(fā)明嵌合抗體或抗原結(jié)合部分的指導(dǎo)。在本說明書自始至終，單詞"包含"或者變化形式"包括"或"含有"應(yīng)當(dāng)理解為暗示包括所述元素、整數(shù)或步驟，或者元素、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其他元素、整數(shù)或步驟，或者元素、整數(shù)或步驟的組。本說明書中提及的所有出版物引入本文作為參考。本說明書中包括的文件、行為、材料、裝置、物品等的任何討論僅用于提供本發(fā)明的背景的目的。它不應(yīng)被視為承認(rèn)任何或所有這些內(nèi)容構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或者是在與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域中的公知常識，當(dāng)它在本申請的每項(xiàng)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日期前存在于澳大利亞或其他地方時。為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的本質(zhì)，現(xiàn)在將參考下述非限制性實(shí)施例來描述其優(yōu)選形式。實(shí)施例1狨可變區(qū)與人恒定區(qū)的融合材料和方法基因合成和克隆將M0G特異性狨衍生抗體的VH鏈(登記號AAM54057，SEQIDNO:1)與人恒定區(qū)(人IgGl重鏈CHl，鉸鏈，CH2和CH3結(jié)構(gòu)域)(例如NCBI登記號P01857)(SEQIDNO:2))—起表達(dá)。這通過將氨基酸序列回譯成DNA序列來完成，所述DNA序列通過使用GeneOptimizer技術(shù)對于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化，并通過裝配合成的寡核苷酸(GeneArt，Germany)而從新合成。在DNA序列優(yōu)化過程中，包括入特異性限制酶位點(diǎn)heI和7Y力1111以允許對VH區(qū)進(jìn)行以后的操作。在基因合成后，將包括Kozak序列的完整序列克隆到pEE6.4GS附屬載體(LonzaBiologies)的多克隆位點(diǎn)內(nèi)。將MOG特異性狨衍生抗體的叭鏈(登記號AAM54058，SEQIDN0:3)與人ic輕鏈的恒定區(qū)(例如NCBI登記號AAA58989)(SEQIDNO:4))—起表達(dá)。如上文對于重鏈所描述的，制備編碼輕鏈(V廣k)氨基酸序列的DNA。在DNA序列優(yōu)化和合成過程中，包括入特異性限制酶位點(diǎn)Wl/"rII以允許對Vl區(qū)迸行以后的操作。在基因合成后，將包括Kozak序列的完整序列克隆到pEE12.4GS表達(dá)載體(LonzaBiologies)的多克隆位點(diǎn)內(nèi)。為了穩(wěn)定的表達(dá)，將2個單基因載體(pEE6.—VH-Igd和pEE12.4-Vl-k)組合成雙基因載體。這通過使用#WI和化/sHI從pEE6.4主鏈中消化出重鏈表達(dá)盒(hCMV-MIE啟動子，Kozak序列，狨VH，人恒定區(qū)和SV40polyA位點(diǎn))來完成。使用I和勘/nHI位點(diǎn)將所得到的片段于輕鏈表達(dá)盒(hCMV-MIE啟動子，Kozak序列，狨VL，人k恒定區(qū)和SV40polyA位點(diǎn))的下游亞克隆到pEE12.4-VL-ic栽體中，從而產(chǎn)生表達(dá)AB138的重鏈和輕鏈(SEQIDNO:5和6)的栽體。轉(zhuǎn)染對于每次轉(zhuǎn)染，將175^1Lipofectamine2000加入至6孔平板的一個孔中的5mLOptimemI培養(yǎng)基(Invitrogen目錄號11668-027和31985-062)中。在第2個孔中，將70jjl表達(dá)栽體(70jug)加入至5mLOptimemI培養(yǎng)基中。在5分鐘室溫孵育后，將所述2個孔的內(nèi)容物混合在一起并進(jìn)一步進(jìn)行20分鐘孵育。這該第二次孵育后，將全部轉(zhuǎn)染混合物加入至包含CH0K1SV細(xì)胞的T175組織培養(yǎng)瓶中。將細(xì)胞孵育72-96小時并收獲上清液。使上清液在4,000xg下離心5分鐘以使細(xì)胞碎片形成粒狀沉淀，并通過0.22jlim筒式過濾器進(jìn)行過濾滅菌。使上清液以1mL/分鐘的流速3次流經(jīng)HiTrapA蛋白柱(AmershamBiosciences,目錄號17-0402-01)。然后，用20mM磷酸鈉以lmL/分鐘洗滌柱。用G.1M檸檬酸pH3.5洗脫抗體，收集級分并立即用1MTris-HClpH9.0中和?？贵w樣品隨后在PD-IO柱(AmershamBiosciences,目錄號17-0851-01)上進(jìn)行脫鹽。通過SDS-PAGE和大小排阻HPLC進(jìn)行的抗體分析證實(shí)了正確的分子量、存在經(jīng)裝配的抗體和抗體的濃度。通過蛋白質(zhì)印跡研究了AB138保留與M26，大鼠MOG(髄磷脂-少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白)的抗原結(jié)合的能力。將130mg大鼠脊髓(IMVS，Australia)在1.8mlCelLyticMCellLysisReagent(SIGMA，C2978)中進(jìn)行勻漿，并于4t)孵育30分鐘。經(jīng)由通過27gl/2針幾次抽吸裂解液并隨后在4C和13000g下離心30分鐘來進(jìn)行進(jìn)一步的勻漿。將粒狀沉淀和上清液稀釋到SDS-PAGE樣品緩沖液(125mMTris-HC1pH6.8,5%SDS，0.25。yi溴酚藍(lán)，25%甘油)中。連同這200nl—起，將處于1X1(T存活細(xì)胞/ml的CH0K1SV細(xì)胞在13000xg和4X:下旋轉(zhuǎn)1分鐘，并且重懸浮于200piCelLyticMCellLysisReagent(SIGMA)中。在41C和13000xg下離心30分鐘后，使上清液與合適量的SDS-PAGE樣品緩沖液混合。所有樣品連同分子量標(biāo)記樣品一起于120V在4—20%Novex預(yù)制凝膠(Invitrogen,Australia)上電泳2小時。然后，使用蛋白質(zhì)印跡裝置在具有20%甲醇的1XTris-甘氨酸緩沖液(BioRad，目錄161+-0771)中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF(BioRad，Australia),于4匸和250mA下進(jìn)行2小時。然后，通過與5。/。脫脂奶粉一起在PBS中于室溫孵育1小時來封閉該膜。然后，用1XPBS將該膜洗滌3次，隨后于4t:與10ug/mL在PBS中的AB138一起孵育過夜。洗滌后，將該膜與在1XPBS中1:5000稀釋的山羊抗人IgG(H+L)HRP綴合物(Sigma,Australia)—起于室溫孵育1小時。洗滌后，使用ECLWesternBlottingAnalysisSystem(AmershamBiosciences目錄RPN2109)來檢測結(jié)合的抗體。進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，其中AB138被同種型匹配的無關(guān)特異性陰性對照抗體(抗TNFoc單克隆抗體)替換，以便鑒定任何非特異性的結(jié)合事件。結(jié)果在成功的蛋白質(zhì)表達(dá)和純化后，對AB138進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析以確定它是否保留了對于大鼠MOG的結(jié)合親和力。AB138結(jié)合大鼠脊髓澄清裂解液中存在的大小約25kDa的蛋白質(zhì)，這是CH0K1SV澄清裂解液中不存在的蛋白質(zhì)(圖1)。陰性對照抗體不與在任一裂解液中存在的蛋白質(zhì)結(jié)合，這表明AB138和大小25kDa的蛋白質(zhì)之間的相互作用不是由于與人恒定區(qū)相關(guān)的人造或非特異性結(jié)合事件而引起的(圖2)。這種蛋白質(zhì)與大鼠MOG減去信號序列的預(yù)期大小(24.9kDa)相匹配。這個結(jié)果表明AB138保留了對于在大鼠脊髓裂解液中存在的大鼠M0G的親和力，并且證實(shí)狨人融合抗體可以保留抗原結(jié)合能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，大鼠M0G可以使用重組DNA技術(shù)來產(chǎn)生，并且AB138結(jié)合大鼠M0G的能力可以在結(jié)合測定法例如ELISA或Biacore分析中進(jìn)行測定。實(shí)施例2結(jié)構(gòu)域抗體的CDR2置換標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)可以用于產(chǎn)生經(jīng)局部改造的結(jié)構(gòu)域抗體，通過用來自供體新世界靈長類免疫球蛋白的CDR2置換接納體抗TNFoc結(jié)構(gòu)域抗體的CDR2(Basran等人，W02004/081026;SEQIDNO:7;圖3)。應(yīng)用Kabat的規(guī)貝寸("SequencesofProteinsofImmunologicalInterest",E.Kabat等人，U,S.DepartmentofHealthandHumanServices,1983)，鑒定出在接納體抗TNF-oc結(jié)構(gòu)域抗體上的CDR2(SASELQS)。隨后將結(jié)構(gòu)域抗體接納體序列針對一組新世界靈長類免疫球蛋白序列進(jìn)行比對。這些序列衍生自Ma，s夜猴(秘魯夜猴(Jo&s■c，ae))(SEQIDNO:8-18)和衍生自普通狨(SEQIDNO:19-24)(圖4)?？梢詫⒉煌诮蛹{體CDR2序列那種的新世界靈長類免疫球蛋白的CDR2序列鑒定為SASTLQT、DASSLQP、GASTRAT、KVSNRAS、RVSNRAS、KVSTRGP、AASNRAS、TSSNLQA、KASTLQS、AASTLQS、YASSLQS、YASFLQG)(表l)。對于這些供體新世界靈長類CDR2序列中的每一個進(jìn)行BLAST分析(http:〃麗.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),以去除為人免疫球蛋白序列的精確匹配物的序列。對于新世界靈長類獨(dú)特的序列是KVSNRAS、RVSNRAS、KVSTRGP、AASNRAS、TSSNLQA、DASSLQP、YASFLQG(表l)。表1:新世界靈長類CDR2序列及它們作為供體序列的適合性。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>使用所有等位基因的1%閾值分析，通過MHCII類結(jié)合預(yù)測程序Propred(http://www,imtech.res,in/raghava/propred),就其經(jīng)預(yù)測的在人中的免疫原性來檢查接納體CDR2和潛在的供體CDR2。根據(jù)這種分析，接納體CDR2序列SASELQS構(gòu)成肽LIYSASELQ的一部分，所述肽被預(yù)測結(jié)合由11個等位基因(DRB1—0306、DRBl-0307、DRB1一0308、DRB1—0311、DRB1一0401、DRB1-0426、DRB1—0806、DRB1一0813、DRB1一1501、DRB1-1502、DRB1-1506)編碼的MHCII類。供體CDR2序列KVSNRAS構(gòu)成肽LIYKVSNRAS的一部分，所述肽被預(yù)測結(jié)合由9個等位基因(DRB1_0309、DRB1_0402、DRB1一0802、DRB1一0804、DRB1一0806、DRB1—0813、DRB1-1301、DRB1-1327、DRB1-1328)編碼的MHCII類。供體CDR2序列AASNRAS構(gòu)成肽LIYAASNRA的一部分，所述肽被預(yù)測結(jié)合由6個等位基因(DRB1一0402、DRB1_0404、DRB1一0408、DRB1一0423、DRB1_0813、DRB1-1506)編碼的MHCII類。供體CDR2序列TSSNLQA構(gòu)成肽LIYTSSNLQA的一部分，所述肽被預(yù)測結(jié)合由10個等位基因(DRB1-0401、DRB1_0402、DRB1-0404、DRB1_0410、DRB1一0423、DRB1一0426、DRB1一0813、DRB1-1501、DRB1-1502、DRB1_1506)編碼的MHCII類。供體CDR2序列KVSTRGP構(gòu)成肽LLIYKVSTR的一部分，所述肽被預(yù)測結(jié)合由8個等位基因(DRB1一0309、DRB1-0802、DRB1一0804、DRB1一0806、DRB1-0813、DRB1-1301、DRB1_1327、DRB1—1328)編碼的MHCII類。因此，接納體CDR2可以替換為具有較低的預(yù)測的免疫原性的供體CDR2，包括KVSNRAS、AASNRAS、TSSNLQA和KVSTRGP。使用重組DNA技術(shù)，將接納體CDR2替換為供體CDR2序列，產(chǎn)生經(jīng)局部改造的結(jié)構(gòu)域抗體(SEQIDNo:25-31)。重組DNA技術(shù)的例子包括由Winter等人(US5，225，539)描述的那些，并且包括但不限于，諸如定點(diǎn)誘變和oligo退火的技術(shù)。然后，使用對于表達(dá)來說合適的載體例如pET21d(+)(Novagen，Germany)，或通過本領(lǐng)域已知的其他此類方法例如由Basran等人(W02004/081026)描述的那些，在大腸桿菌BL21(DE3)pLys(Novagen，Germany)中進(jìn)行結(jié)構(gòu)域抗體的蛋白質(zhì)表達(dá)。在細(xì)菌細(xì)胞裂解后，使用蛋白L(Pierce,USA)層析法來純化結(jié)構(gòu)域抗體。純化后，通過本領(lǐng)域已知的方法例如L929中和測定法或TNFoc受體I結(jié)合測定法，就TNFoc結(jié)合能力的保留來分析經(jīng)改造的結(jié)構(gòu)域抗體。為了改善經(jīng)改造的結(jié)構(gòu)域抗體的結(jié)合親和力，可以通過圍繞和穩(wěn)定CDR2的構(gòu)架殘基的氨基酸置換或者通過本領(lǐng)域已知的其他方法來進(jìn)行親和力成熟。(Winter等人(US5,225,539);Griffiths等人(US5,885,793);Rajpal,A.等人(2005)Ageneralmethodforgreatlyimprovingtheaffinityofantibodiesbyusingcombinatoriallibraries,ProcNatlAcadSciUSA.，102(24)8466-71;IrvingR.A.等人(2001)Ribosomedisplayandaffinitymaturation:fromantibodiestosingleV-domainsandstepstowardscancertherapeutics,JournalofImmunologicalMethods,248:31-45)本領(lǐng)域技術(shù)人員將會意識到，可以對如具體實(shí)施方案中所示的本發(fā)明進(jìn)行眾多改變和/或修飾，而不背離如廣泛描述的本發(fā)明的精神或范圍。因此，這些實(shí)施方案在所有方面被視為舉例說明性的而非限制性的。權(quán)利要求1.嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗原結(jié)合部分包含至少2個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和至少3個構(gòu)架區(qū)，其中至少一個CDR是新世界靈長類CDR。2.根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗原結(jié)合部分包含3個CDRs和4個構(gòu)架區(qū)。3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗原結(jié)合部分包含至少一個CDR，其是人CDR。4.根據(jù)權(quán)利要求1一3中任一項(xiàng)的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗原結(jié)合部分包含2個CDRs，其是人CDRs。5.根據(jù)權(quán)利要求1—4中任一項(xiàng)的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中CDR2是新世界靈長類CDR2。6.根據(jù)權(quán)利要求5的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述CDR2序列選自KVSNRAS、RVSNRAS、KVSTRGP、AASNRAS、TSSNLQA、DASSLQP和YASFLQG。7.根據(jù)權(quán)利要求6的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述CDR2序列選自KVSNRAS、AASNRAS、TSSNLQA和KVSTRGP。8.根據(jù)權(quán)利要求1—7中任一項(xiàng)的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述構(gòu)架區(qū)是人序列。9.根據(jù)權(quán)利要求1—8中任一項(xiàng)的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中至少一個構(gòu)架區(qū)被^"飾以增加結(jié)合。10.根據(jù)權(quán)利要求1一9中任一項(xiàng)的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中至少一個構(gòu)架區(qū)被修飾以減少預(yù)測的在人中的免疫原性。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中至少一個CDR序列被修飾以增加結(jié)合，條件是所述至少一個新世界靈長類CDR序列是未經(jīng)修飾的。12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中至少一個CDR序列被修飾以減少預(yù)測的在人中的免疫原性，條件是所述至少一個新世界靈長類CDR序列是未經(jīng)修飾的。13.根據(jù)權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述經(jīng)修飾的至少一個CDR序列不是新世界靈長類CDR,14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗原結(jié)合部分是結(jié)構(gòu)域抗體。15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或抗原結(jié)合部分進(jìn)一步包含人或非人靈長類恒定區(qū)序列。16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所迷新世界靈長類選自狨、糈、松鼠猴、禿猴、狐尾猴、青猴、蜘蛛猴、絨毛猴、懸猴、夜或梟猴和吼猴.17.根據(jù)權(quán)利要求16的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述新世界靈長類是狨。18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體與抗原結(jié)合，所述抗原在性質(zhì)上是肽、蛋白質(zhì)、破水化合物、糖蛋白、脂質(zhì)或糖脂，選自腫瘤相關(guān)抗原，包括癌胚抗原、EpCAM、Lewis-Y、Lewis-Y/b、PMSA、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、CD154、EGF-R、Her-2、TRAIL和VEGF受體，涉及免疫或炎性疾病或病癥的抗原，包括CD3、CD4、CD25、CD40、CD49d、MHCI類、MHCII類、GM-CSF、干擾素-Y、IL-1、IL-12、IL-13、IL-23、TNF-oc和IgE,在宿主細(xì)胞上表達(dá)的抗原，包括糖蛋白nb/IIIa、P-糖蛋白、嘌呤能受體和粘附受體，包括CDlla、CDllb、CDllc、CD18、CD56、CD58、CD62或CD144，包含細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子或其他可溶性生理學(xué)調(diào)節(jié)劑或其受體的抗原，包括嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、IL-6、IL-8、TGF-p、C3a、C5a、VEGF、NGF及其受體，涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或病癥的抗原，包括e-淀粉樣蛋白和感染性蛋白質(zhì)，非人源的抗原例如微生物、納米生物或病毒抗原，或者毒素，包括呼吸道合胞病毒蛋白F、炭疸毒素、響尾蛇毒和地高辛。19.根據(jù)權(quán)利要求18的嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體與TNFoc結(jié)合。20.產(chǎn)生嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分的方法，所述方法包括從包含至少2個CDRs和至少3個構(gòu)架區(qū)的人抗體可變區(qū)中刪除CDR，并將它替換為預(yù)測具有低免疫原性的新世界靈長類CDR，以產(chǎn)生嵌合可變區(qū)。21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括回收所述嵌合可變區(qū)的步驟。22.根據(jù)權(quán)利要求20或權(quán)利要求21的方法，其中所述新世界靈長類CDR是CDR2。23.根據(jù)權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括修飾所述嵌合可變區(qū)的序列以增加結(jié)合的步驟，條件是所述新世界靈長類CDR序列是未經(jīng)修飾的。24.根據(jù)權(quán)利要求20-23中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括修飾所述嵌合可變區(qū)的序列以減少在人中的免疫原性的步驟，條件是所述至少一個新世界靈長類CDR序列是未經(jīng)修飾的。25.根據(jù)權(quán)利要求20-24中任一項(xiàng)的方法，其中所述新世界靈長類選自狨、糈、松鼠猴、青猴、蜘蛛猴、絨毛猴、懸猴、禿猴、狐尾猴、夜或梟猴和吼猴。26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述新世界靈長類是狨。27.根據(jù)權(quán)利要求20-26中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體結(jié)合抗原，所述抗原在性質(zhì)上是肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、糖蛋白、脂質(zhì)或糖脂，選自腫瘤相關(guān)抗原，包括癌胚抗原、EpCAM、Lewis-Y、Lewis-Y/b、PMSA、C亂CD30、CD33、CD38、CD52、CD154、EGF-R、Her-2、TRAIL和VEGF受體，涉及免疫或炎性疾病或病癥的抗原，包括CD3、CD4、CD25、CD40、CD49d、MHCI類、MHCII類、GM-CSF、干擾素-y、IL-1、IL-12、IL13、IL-23、TNF-ot和IgE,在宿主細(xì)胞上表達(dá)的抗原，包括糖蛋白1Ib/IIIa、P-糖蛋白、嘌呤能受體和粘附受體，包括CDlla、CDllb、CDllc、CD18、CD56、CD58、CD62或CD144，包含細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子或其他可溶性生理學(xué)調(diào)節(jié)劑或其受體的抗原，包括嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、IL-6、IL-8、TGF-P、C3a、C5a、VEGF、NGF及其受體，涉及中柩神經(jīng)系統(tǒng)疾病或病癥的抗原，包括P-淀粉樣蛋白和感染性蛋白質(zhì)，非人源的抗原例如微生物、納米生物或病毒抗原，或者毒素，包括呼吸道合胞病毒蛋白F、炭疽毒素、響尾蛇毒和地高辛。28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述抗體與TNFoc結(jié)合.29.嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分，其通過根據(jù)權(quán)利要求20-28中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生。30.試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的嵌合抗體或抗原結(jié)合部分，或其藥物組合物，包裝，和使用說明書。全文摘要本發(fā)明提供了嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分。所述抗原結(jié)合部分包含至少2個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和至少3個構(gòu)架區(qū)，其中至少一個CDR是新世界靈長類CDR。文檔編號C07K16/18GK101287763SQ200680038256公開日2008年10月15日申請日期2006年8月15日優(yōu)先權(quán)日2005年8月15日發(fā)明者A·G·多伊爾,A·W·克拉克,P·A·詹寧斯申請人:阿拉納治療有限公司