本發(fā)明涉及一種用于輔助評(píng)估肺癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。
背景技術(shù)：
肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。近50年來許多國家都報(bào)道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。
基因測序是一種新型基因檢測技術(shù)，能夠從血液或唾液中分析測定基因全序列，預(yù)測罹患多種疾病的可能性，從而實(shí)現(xiàn)提前預(yù)防和治療。
中國專利申請201210021993.1提供了一種檢測小細(xì)胞肺癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測VEGF基因上T-460C，CYP1A1基因上Ile462Val，MTHFR基因上C677T的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測序反應(yīng)組件等。
上述技術(shù)方案的缺陷在于，相關(guān)基因的獨(dú)立性差，存在連鎖不平衡。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于輔助評(píng)估肺癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，以及其檢測結(jié)果的評(píng)估方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種用于輔助評(píng)估肺癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，該試劑盒包括：
針對VTI1A基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7086803(G→A)的引物，以及
針對TERT基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2736100(C→A)的引物。
本發(fā)明的試劑盒通過檢測與肺癌發(fā)生密切相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，來評(píng)估受試者肺癌患病風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并最終根據(jù)每個(gè)受試者的基因檢測結(jié)果，從基因?qū)用嬷笇?dǎo)受試者有針對性地預(yù)防和早期診斷肺癌，降低肺癌的發(fā)病率，進(jìn)行早期治療，提高生存率。
本發(fā)明所選取的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在亞洲人群中具有顯著相關(guān)性，并且彼此獨(dú)立，不存在連鎖不平衡，因此本發(fā)明的位點(diǎn)選擇具有代表性、獨(dú)立性和風(fēng)險(xiǎn)值可積累性。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對HLA基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2395185(G→T)的引物。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，針對單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7086803的引物包括：
rs7086803上游引物：GTGGGTGGAGAGA AATCAAG(SEQ ID NO:13)；
rs7086803下游引物：GATCATGCGGCTAGG TCACT(SEQ ID NO:14)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，針對單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2736100的引物包括：
rs2736100上游引物：GTCTGAAACATT GCTACCCT(SEQ ID NO:15)；
rs2736100下游引物：TCGTGAGTCTCC ACATCTTC(SEQ ID NO:16)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，針對單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2395185的引物包括：
rs2395185上游引物：CACTTCAAATCATTTCCTCC(SEQ ID NO:17)；
rs2395185下游引物：TCTGTCCCTTTATTTCTCAA(SEQ ID NO:18)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對DNAH11基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2285947(G→A)的引物。該針對DNAH11基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2285947的引物，例如，rs2285947上游引物：AGTATGATGAGTTTGGAGCA(SEQ ID NO:1)；rs2285947下游引物：GGAAATAAGCCAAACTGAGA(SEQ ID NO:2)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對LRFN2基因上單核 苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2494938(G→A)的引物。該針對LRFN2基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2494938的引物包括，例如，rs2494938上游引物：ACTAAGCCTCAGTCAAGGTTTG(SEQ ID NO:3)；rs2494938下游引物：TAGCGAGGCATTTGGAACAG(SEQ ID NO:4)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對TP63基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs4488809(T→C)的引物。該針對TP63基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs4488809的引物，例如，rs4488809上游引物：GGGAAGGTAGAATATATGAGT(SEQ ID NO:5)；rs4488809下游引物：AAGCCCTCTCAATATCTG(SEQ ID NO:6)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對DCBLD1基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9387478(C→A)的引物。該針對單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9387478的引物包括，例如，rs9387478上游引物：GGCAGAAAGGAAACAGTTGT(SEQ ID NO:7)；rs9387478下游引物：ATGTTGGGAATTGTTGAGAC(SEQ ID NO:8)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對MIPEP基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs753955(A→G)的引物。該針對單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs753955的引物包括，例如，rs753955上游引物：GCACCACACATTCTTAGGAC(SEQ ID NO:9)；rs753955下游引物：TTATGGAGGCTGGCAAGTC(SEQ ID NO:10)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對MTMR3基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs36600(T→C)的引物。該針對單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs36600的引物包括，例如，rs36600上游引物：GTAGAATTGTTGGATCATAGG(SEQ ID NO:11)；rs36600下游引物：GAGATGCCACTGAATTGTA(SEQ ID NO:12)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒進(jìn)一步包括針對單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs28366298的引物。該針對單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs28366298的引物包括，例如，rs28366298上游引物：AGTCCAAGATTAAGGCAC(SEQ ID NO:19)；rs28366298下游引物：TACATTGTTTAGCCTGAACT(SEQ ID NO:20)。
根據(jù)本發(fā)明另一具體實(shí)施方式，試劑盒的組分和含量包括：PCR反應(yīng)體系、 PCR產(chǎn)物純化體系、測序反應(yīng)體系。其中，前述引物屬于PCR反應(yīng)體系；PCR產(chǎn)物純化體系用于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化；測序反應(yīng)體系用于DNA測序，進(jìn)而確定單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。例如，PCR反應(yīng)體系包括10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5ul；25mM dNTP混合液0.2ul；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul；20uM引物對，每條引物0.25ul；ddH2O 19.175ul。例如，PCR產(chǎn)物純化體系包括：1U/ul SAP酶0.75ul；10U/ul ExoI酶0.375ul；ddH2O 3.875ul。例如，測序反應(yīng)體系包括：25％BigDye mix lul；3.2uM DNA測序引物1ul；125mM EDTA溶液1ul；100％乙醇溶液15ul；70％乙醇溶液30ul；HIDI溶液8ul；ddH20 2ul。值得注意的是，這里的DNA測序引物可為現(xiàn)有技術(shù)已公開或披露的多種引物，在此不再贅述。
另一方面，本發(fā)明提供了上述試劑盒的檢測結(jié)果的評(píng)估方法，其包括如下步驟：
A、將單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7086803、rs2736100、rs2395185的不同基因型進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)度賦值；
B、提取受檢者的DNA；
C、使用以下引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：
(1)rs7086803上游引物：GTGGGTGGAGAGA AATCAAG；
rs7086803下游引物：GATCATGCGGCTAGG TCACT；
(2)rs2736100上游引物：GTCTGAAACATT GCTACCCT；
rs2736100下游引物：TCGTGAGTCTCC ACATCTTC；
(3)rs2395185上游引物：CACTTCAAATCATTTCCTCC；
rs2395185下游引物：TCTGTCCCTTTATTTCTCAA。
D、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化；
E、DNA測序，確定單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7086803、rs2736100、rs2395185的基因型；
F、根據(jù)步驟A，確定步驟E所測得的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7086803、rs2736100、rs2395185的基因型的風(fēng)險(xiǎn)值Risk(rs7086803)、Risk(rs2736100)、Risk(rs2395185)；
G、根據(jù)步驟F得到的三個(gè)風(fēng)險(xiǎn)值Risk(rs7086803)、Risk(rs2736100)、Risk(rs2395185)判斷受檢者的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別。
進(jìn)一步地，步驟G具體包括如下步驟：
G1、計(jì)算三個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的總風(fēng)險(xiǎn)值R，計(jì)算公式為
總風(fēng)險(xiǎn)值R＝Risk(rs7086803)×Risk(rs2736100)×Risk(rs2395185)；
G2、根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)判斷風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別：
總風(fēng)險(xiǎn)值R<0.91 風(fēng)險(xiǎn)較低
0.91≤總風(fēng)險(xiǎn)值R≤1.08 風(fēng)險(xiǎn)一般
總風(fēng)險(xiǎn)值R>1.08 風(fēng)險(xiǎn)較高。
本發(fā)明所采用的方法是口腔粘膜細(xì)胞采樣，無痛、無創(chuàng)、避免交叉感染。檢測方法簡單，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，方法易普及、推廣。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備如下有益效果：
本發(fā)明所選取的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在亞洲人群中具有顯著相關(guān)性，并且彼此獨(dú)立、不存在連鎖不平衡，因此本發(fā)明的位點(diǎn)選擇具有代表性、獨(dú)立性和風(fēng)險(xiǎn)值可積累性。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供了一種用于輔助評(píng)估肺癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，該試劑盒包括：PCR反應(yīng)體系、PCR產(chǎn)物純化體系、測序反應(yīng)體系。
其中，PCR反應(yīng)體系包括如下引物：
(1)針對VTI1A基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7086803(G→A)的引物：
rs7086803上游引物：GTGGGTGGAGAGA AATCAAG(SEQ ID NO:13)；
rs7086803下游引物：GATCATGCGGCTAGG TCACT(SEQ ID NO:14)；
(2)針對TERT基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2736100(C→A)的引物：
rs2736100上游引物：GTCTGAAACATT GCTACCCT(SEQ ID NO:15)；
rs2736100下游引物：TCGTGAGTCTCC ACATCTTC(SEQ ID NO:16)；
(3)針對HLA基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2395185(G→T)的引物：
rs2395185上游引物：CACTTCAAATCATTTCCTCC(SEQ ID NO:17)；
rs2395185下游引物：TCTGTCCCTTTATTTCTCAA(SEQ ID NO:18)。
PCR反應(yīng)體系進(jìn)一步包括10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5ul；25mM dNTP混合液0.2ul；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul；20uM引物對，每條引物0.25ul；ddH2O19.175ul。
PCR產(chǎn)物純化體系用于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化，其包括：1U/ul SAP酶0.75ul；10U/ul ExoI酶0.375ul；ddH2O 3.875ul。
測序反應(yīng)體系用于DNA測序，進(jìn)而確定單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，其包括：25％BigDye mix lul；3.2uM DNA測序引物1ul；125mM EDTA溶液1ul；100％乙醇溶液15ul；70％乙醇溶液30ul；HIDI溶液8ul；ddH20 2ul。
本實(shí)施例試劑盒的檢測結(jié)果的評(píng)估方法包括如下步驟：
A、將單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7086803、rs2736100、rs2395185的不同基因型進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)度賦值；具體風(fēng)險(xiǎn)值如表1所示，
表1
B、提取受檢者的DNA；
C、使用以下引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：
(1)rs7086803上游引物：GTGGGTGGAGAGA AATCAAG；
rs7086803下游引物：GATCATGCGGCTAGG TCACT；
(2)rs2736100上游引物：GTCTGAAACATT GCTACCCT；
rs2736100下游引物：TCGTGAGTCTCC ACATCTTC；
(3)rs2395185上游引物：CACTTCAAATCATTTCCTCC；
rs2395185下游引物：TCTGTCCCTTTATTTCTCAA。
D、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化；
E、DNA測序，確定單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7086803、rs2736100、rs2395185的基因型；
F、根據(jù)步驟A，確定步驟E所測得的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7086803、rs2736100、rs2395185的基因型的風(fēng)險(xiǎn)值Risk(rs7086803)、Risk(rs2736100)、Risk(rs2395185)；
G、根據(jù)步驟F得到的三個(gè)風(fēng)險(xiǎn)值Risk(rs7086803)、Risk(rs2736100)、Risk(rs2395185)判斷受檢者的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別。步驟G具體包括如下步驟：
G1、計(jì)算三個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的總風(fēng)險(xiǎn)值R，計(jì)算公式為
總風(fēng)險(xiǎn)值R＝Risk(rs7086803)×Risk(rs2736100)×Risk(rs2395185)；
G2、根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)判斷風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別：
總風(fēng)險(xiǎn)值R<0.91 風(fēng)險(xiǎn)較低
0.91≤總風(fēng)險(xiǎn)值R≤1.08 風(fēng)險(xiǎn)一般
總風(fēng)險(xiǎn)值R>1.08 風(fēng)險(xiǎn)較高。
按照上述方法采集五個(gè)樣本，每個(gè)樣本各個(gè)位點(diǎn)的基因型及風(fēng)險(xiǎn)值、總風(fēng)險(xiǎn)值、風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別如表2所示，
表2
實(shí)施例2
本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于，PCR反應(yīng)體系包括如下引物，
(1)針對DNAH11基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2285947(G→A)的引物：
rs2285947上游引物：AGTATGATGAGTTTGGAGCA(SEQ ID NO:1)；
rs2285947下游引物：GGAAATAAGCCAAACTGAGA(SEQ ID NO:2)；
(2)針對LRFN2基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2494938(G→A)的引物。
rs2494938上游引物：ACTAAGCCTCAGTCAAGGTTTG(SEQ ID NO:3)；
rs2494938下游引物：TAGCGAGGCATTTGGAACAG(SEQ ID NO:4)；
(3)針對TP63基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs4488809(T→C)的引物：
s4488809上游引物：GGGAAGGTAGAATATATGAGT(SEQ ID NO:5)；
rs4488809下游引物：AAGCCCTCTCAATATCTG(SEQ ID NO:6)；
(4)針對DCBLD1基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9387478(C→A)的引物：
rs9387478上游引物：GGCAGAAAGGAAACAGTTGT(SEQ ID NO:7)；
rs9387478下游引物：ATGTTGGGAATTGTTGAGAC(SEQ ID NO:8)；
(5)針對MIPEP基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs753955(A→G)的引物：
rs753955上游引物：GCACCACACATTCTTAGGAC(SEQ ID NO:9)；
rs753955下游引物：TTATGGAGGCTGGCAAGTC(SEQ ID NO:10)；
(6)針對MTMR3基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs36600(T→C)的引物：
rs36600上游引物：GTAGAATTGTTGGATCATAGG(SEQ ID NO:11)；
rs36600下游引物：GAGATGCCACTGAATTGTA(SEQ ID NO:12)；
(7)針對VTI1A基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7086803(G→A)的引物：
rs7086803上游引物：GTGGGTGGAGAGA AATCAAG(SEQ ID NO:13)；
rs7086803下游引物：GATCATGCGGCTAGG TCACT(SEQ ID NO:14)；
(8)針對TERT基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2736100(C→A)的引物：
rs2736100上游引物：GTCTGAAACATT GCTACCCT(SEQ ID NO:15)；
rs2736100下游引物：TCGTGAGTCTCC ACATCTTC(SEQ ID NO:16)；
(9)針對HLA基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2395185(G→T)的引物：
rs2395185上游引物：CACTTCAAATCATTTCCTCC(SEQ ID NO:17)；
rs2395185下游引物：TCTGTCCCTTTATTTCTCAA(SEQ ID NO:18)。
本實(shí)施例試劑盒的檢測結(jié)果的評(píng)估方法包括如下步驟：
A、將每個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的不同基因型進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)度賦值，具體風(fēng)險(xiǎn)值如表3所示；
表3
B、提取受檢者的DNA；
C、使用以下引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：
(1)rs2285947上游引物：AGTATGATGAGTTTGGAGCA；
rs2285947下游引物：GGAAATAAGCCAAACTGAGA；
(2)rs2494938上游引物：ACTAAGCCTCAGTCAAGGTTTG；
rs2494938下游引物：TAGCGAGGCATTTGGAACAG；
(3)rs4488809上游引物：GGGAAGGTAGAATATATGAGT；
rs4488809下游引物：AAGCCCTCTCAATATCTG；
(4)rs9387478上游引物：GGCAGAAAGGAAACAGTTGT(SEQ ID NO:7)；
rs9387478下游引物：ATGTTGGGAATTGTTGAGAC(SEQ ID NO:8)；
(5)rs753955上游引物：GCACCACACATTCTTAGGAC(SEQ ID NO:9)；
rs753955下游引物：TTATGGAGGCTGGCAAGTC(SEQ ID NO:10)；
(6)rs36600上游引物：GTAGAATTGTTGGATCATAGG(SEQ ID NO:11)；
rs36600下游引物：GAGATGCCACTGAATTGTA(SEQ ID NO:12)；
(7)rs7086803上游引物：GTGGGTGGAGAGA AATCAAG(SEQ ID NO:13)；
rs7086803下游引物：GATCATGCGGCTAGG TCACT(SEQ ID NO:14)；
(8)rs2736100上游引物：GTCTGAAACATT GCTACCCT(SEQ ID NO:15)；
rs2736100下游引物：TCGTGAGTCTCC ACATCTTC(SEQ ID NO:16)；
(9)rs2395185上游引物：CACTTCAAATCATTTCCTCC(SEQ ID NO:17)；
rs2395185下游引物：TCTGTCCCTTTATTTCTCAA(SEQ ID NO:18)。
D、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化；
E、DNA測序，確定九個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型；
F、根據(jù)步驟A，確定步驟E所測得的九個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型的風(fēng)險(xiǎn)值Risk(rs2285947)、Risk(rs2494938)、Risk(rs4488809)、Risk(rs9387478)、Risk(rs753955)、Risk(rs36600)、Risk(rs7086803)、Risk(rs2736100)、Risk(2395185)；
G、根據(jù)步驟F得到的九個(gè)風(fēng)險(xiǎn)值判斷受檢者的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，其具體包括如下步驟：
G1、計(jì)算九個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的總風(fēng)險(xiǎn)值R，計(jì)算公式為
總風(fēng)險(xiǎn)值R＝Risk(rs2285947)×Risk(rs2494938)×Risk(rs4488809)×Risk(rs9387478)×Risk(rs753955)×Risk(rs36600)×Risk(rs7086803)×Risk(rs2736100)×Risk(2395185)；
G2、根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)判斷風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別：
總風(fēng)險(xiǎn)值R<0.83 風(fēng)險(xiǎn)較低
0.83≤總風(fēng)險(xiǎn)值R≤1.21 風(fēng)險(xiǎn)一般
總風(fēng)險(xiǎn)值R>1.21 風(fēng)險(xiǎn)較高。
按照上述方法采集五個(gè)樣本，每個(gè)樣本各個(gè)位點(diǎn)的基因型及風(fēng)險(xiǎn)值、總風(fēng)險(xiǎn)值、風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別如表4所示，
表4
雖然本發(fā)明以較佳實(shí)施例揭露如上，但并非用以限定本發(fā)明實(shí)施的范圍。任何本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的發(fā)明范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許的改進(jìn)，即凡是依照本發(fā)明所做的同等改進(jìn)，應(yīng)為本發(fā)明的范圍所涵蓋。