本發(fā)明涉及DTT在提高CELI家族酶活性中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

CELI酶是一種單鏈、雙鏈都特異識(shí)別的特異性核酸酶，等電點(diǎn)為6.0-6.5，分子量大小為43kDa(Yang et al,1999)；CEL II酶被認(rèn)為是CEL I的降解產(chǎn)物，其分子量大小為39kDa，CEL I酶和CEL II酶均屬于CELI家族酶(Yang et al,1999；Pimkin et al,2006)。傳統(tǒng)理論認(rèn)為該酶的催化活性只需要Mg²⁺和Zn²⁺(Till et al,2004)，它可以識(shí)別八種錯(cuò)配形式的堿基(mismatches)分別為AA、AG、AC、GG、GT、CC、CT和TT(Oleykowski et al,1999；Oleykowski et al,1998)，因此被廣泛應(yīng)用于突變檢測(cè)領(lǐng)域，如植物TILLING技術(shù)平臺(tái)中(Till et al,2006)。該酶可以特異性切割錯(cuò)配堿基(Bing Yang et al,1999)。通過酶切擴(kuò)增的目標(biāo)檢測(cè)片段并經(jīng)瓊脂糖或毛細(xì)管電泳分離檢測(cè)，一般可方便獲得突變位置和大小。因此，它是一種比較方便和經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)未知和已知突變位點(diǎn)的手段(Yeung et al,2005)。

目前CELI酶主要提取途徑是從芹菜中提取，主要提取方法是通過硫酸銨沉淀法，得到粗提酶液(Till et al,2006)。如果需要得到純度更高的酶，需要經(jīng)過刀豆體蛋白A-瓊脂糖柱吸附，用alpha-甘露糖苷洗脫，但是得率較低(Yang et al,1999)。因此，大部分TILLING突變體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)是用粗提酶來檢測(cè)的，該粗提酶的主要成分即為CELI(Yang et al,1999；Till et al,2006)。

傳統(tǒng)的理論認(rèn)為CELI酶的催化活性只需要Mg²⁺和Zn²⁺，有沒有可能存在其他離子可提高CELI酶的活性。到目前為止，Kulinski等人(Kulinski et al,2000)發(fā)現(xiàn)Li⁺、K⁺、Na⁺、Cs⁺對(duì)CELI酶的活性皆沒有提高。

DTT即DL-Dithiothreitol，中文名為二硫蘇糖醇。分子式為C4H10O2S2，分子量為154.25，常用還原劑，有抗氧化作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供DTT在促進(jìn)CELI家族酶活性中的應(yīng)用；或DTT在制備CELI家族酶酶切緩沖液或CELI家族酶酶切緩沖體系中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述CELI家族酶活性為切割錯(cuò)配位點(diǎn)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有DTT的CELI家族酶酶切緩沖液。

本發(fā)明提供的含有DTT的CELI家族酶酶切緩沖液中，所述DTT在所述CELI家族酶酶切緩沖液中的濃度為0.01-10mM。

上述含有DTT的CELI家族酶酶切緩沖液中，所述DTT在所述CELI家族酶酶切 緩沖液中的濃度為0.01-0.5mM、0.5-10mM或0.01-6mM。

上述含有DTT的CELI家族酶酶切緩沖液中，所述CELI家族酶酶切緩沖液為CELI酶切緩沖液，其中，所述DTT在所述CELI酶切緩沖液中的濃度為0.01-0.5mM；

或CELI家族酶酶切緩沖液為CELII酶切緩沖液，其中，所述DTT在所述CELII酶切緩沖液中的濃度為0.5-10mM；更具體為0.5-10mM或0.01-6mM。

上述含有DTT的CELI家族酶酶切緩沖液中，所述含有DTT的CELI家族酶酶切緩沖液由DTT、BSA、Triton X-100、KCl和HEPES緩沖液組成；

或所述含有DTT的CELI家族酶酶切緩沖液由Mutation Detection Kit-S100試劑盒中的緩沖液和DTT組成。

上述含有DTT的CELI家族酶酶切緩沖液中，所述Mutation Detection Kit-S100試劑盒是美國(guó)環(huán)球基因公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為706025。

上述含有DTT的CELI家族酶酶切緩沖液中，所述HEPES緩沖液為濃度為0.1M、pH值為7.5的HEPES緩沖液。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種酶切反應(yīng)體系。

本發(fā)明提供的酶切反應(yīng)體系包括上述含有DTT的CELI家族酶酶切緩沖液和CELI家族酶。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供含有上述酶切緩沖液或上述酶切反應(yīng)體系的試劑盒。

上述酶切緩沖液或上述酶切反應(yīng)體系或上述試劑盒在促進(jìn)CELI家族酶切割含有錯(cuò)配位點(diǎn)DNA中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述酶切緩沖液或上述酶切反應(yīng)體系或上述試劑盒在檢測(cè)待測(cè)DNA分子是否含有錯(cuò)配位點(diǎn)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種用CELI家族酶酶切含有錯(cuò)配位點(diǎn)DNA的方法。

本發(fā)明提供的用CELI家族酶酶切含有錯(cuò)配位點(diǎn)DNA的方法包括如下步驟：將含有錯(cuò)配位點(diǎn)DNA在上述酶切反應(yīng)體系中進(jìn)行酶切反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)酶切。

上述方法中，所述錯(cuò)配位點(diǎn)的錯(cuò)配形式為AA、AG、AC、GG、GT、CC、CT和/或TT。

上述方法中，所述酶切反應(yīng)溫度為45℃；所述酶切反應(yīng)時(shí)間為30min。

上述應(yīng)用或上述酶切緩沖液或上述酶切反應(yīng)體系或上述試劑盒或上述方法中，所述CELI家族酶為CEL I酶或CEL II酶。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了新的催化活性物質(zhì)DTT，通過實(shí)驗(yàn)證明：DTT可以進(jìn)一步提高CELI酶活，特別是對(duì)低豐度突變的檢測(cè)，由于CEL II酶屬于CELI家族酶，為了進(jìn)一步驗(yàn)證DTT可以同時(shí)提高CELI家族酶的酶切活性，本發(fā)明還設(shè)計(jì)了CEL II酶切活性檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣表明DTT也可以提高CEL II酶活。比傳統(tǒng)的酶切方法相比，本發(fā)明的方法更為靈敏：DTT的終濃度在0.01-10mM范圍內(nèi)都可以提高CELI酶和CELII酶的檢測(cè)靈敏度。對(duì)低豐度未知突變體的檢測(cè)，如某癌癥基因都有很好的檢測(cè)效果，特別是TILLING技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)誘變?nèi)后w時(shí)，有明顯優(yōu)勢(shì)，不僅僅簡(jiǎn)化了PCR純化步驟，同時(shí)相應(yīng)地提高了檢測(cè)分辨率。

附圖說明

圖1為DTT對(duì)CELI酶切效果。

圖2為DTT對(duì)CELII酶切效果。

圖3為DTT對(duì)CELII酶切效果。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

Mutation Detection Kit-S100試劑盒是美國(guó)環(huán)球基因公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為706025。

Binding Buffer是美國(guó)zymoresearch公司的產(chǎn)品；DNA Clean&Concentrator^TM-25。

HEPES緩沖液(0.1M、pH值為7.5)是Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為H3375-25G。

實(shí)施例1、DTT在提高CELI家族酶活性中的應(yīng)用

一、待酶切DNA樣品的制備

1、DNA的合成

人工合成序列表中序列1所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子，將其按2:1比例(質(zhì)量比)混合，得到待PCR擴(kuò)增的DNA(濃度為1ng/ul)。

序列2為將序列1的第544位核苷酸由G突變?yōu)锳后得到的DNA分子。

2、PCR擴(kuò)增

以步驟1獲得的待PCR擴(kuò)增的DNA為模板，采用F和R引物對(duì)所述模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增至45個(gè)熱循環(huán)，然后進(jìn)行99℃變性10min，降溫至70℃，每個(gè)循環(huán)降低0.3℃，69個(gè)循環(huán)結(jié)束，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即待酶切DNA樣品。待擴(kuò)增完畢后，用1％瓊脂糖凝膠檢測(cè)，檢測(cè)條帶是否特異，條帶亮度是否達(dá)到要求。若條帶較暗或不特異，需要重新擴(kuò)增。引物序列如下：

F：5’-ATGCACTTAACAGAGGAAATCTTG-3’；

R：5’-TTACTTAATACTTTTCTTGTAGCCTTTA-3’。

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有序列表中序列1所 示的DNA分子和序列表中序列1的第544位核苷酸由G突變?yōu)锳的異源雙鏈DNA分子。

PCR擴(kuò)增體系(10ul)：10倍PCR緩沖液1.0ul、dNTP 0.8ul、Forward primer(10um)0.16ul、Reverse primer(10um)0.16ul、DNA模板1.0ul、聚合酶0.1ul、H₂06.78ul；

PCR擴(kuò)增熱循環(huán)：95℃2min；94℃10s，60℃30s，72℃1-3min；72℃5min，12℃hold。

異源錯(cuò)配雙鏈形成：99℃10min；70℃20s，-0.3℃per cycle，70cycles；12℃10min。

3、PCR產(chǎn)物純化

(1)用在1倍體積的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2倍體積的Binding Buffer，翻轉(zhuǎn)充分混勻(對(duì)小于200bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入5倍體積的Binding Buffer)得到混合液。

(2)將所述混合液加入DNA純化柱內(nèi)(如果溶液體積>700μl，分次轉(zhuǎn)移溶液)；室溫放置1-2min或更長(zhǎng)時(shí)間。

(3)13,000g離心1min，棄廢液(目的DNA長(zhǎng)度≤500bp時(shí)，離心結(jié)束后將收集管中的溶液再次轉(zhuǎn)入DNA純化柱中，離心)。

(4)在DNA純化柱中加入650ul Wash Buffer，13,000g離心30秒，棄廢液，將DNA純化柱放回收集管。

(5)重復(fù)步驟(4)。

(6)13,000g離心3min，以去除柱中殘余乙醇。

(7)將純化柱放入新的離心管中，向柱中加入在60℃預(yù)熱的30-50μl Elution Buffer或ddH₂O，室溫放置1-2min或更長(zhǎng)時(shí)間。

二、CELI酶的制備

1、取10kg芹菜，放入榨汁機(jī)中，緩慢榨汁后，避免溫度過熱，在汁液中加入預(yù)冷勻漿緩沖液(含100mM Tris-HCl(pH均為7.7)和100uM PMSF)，得到混合液。

2、將所述混合液4℃下14000rpm離心10min，棄沉淀，取上清液；向上清液中緩慢加入硫酸銨(每100ml上清液加25g硫酸銨)，分10次加入(每100ml體積加入14.4g硫酸胺)，待完全溶解后，低速攪拌30min；14000rpm離心45min，棄沉淀，取上清液。

3、向上清液中緩慢加入硫酸銨至(每100ml上清液加80g硫酸銨)，分十次加入(每100ml體積加入39.0g固體硫酸銨)。低速攪拌30min后，14000rpm離心3min。棄上清，收集沉淀。

4、用1/10體積的緩沖液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH為7.7)溶解步驟3中得到的沉淀，1000rpm離心20min，棄沉淀，取上清。

5、把透析袋剪成適當(dāng)長(zhǎng)度的小段。用1mmol/L EDTA(pH 8.0)中將透析袋煮沸5min。用超純水清洗透析袋。將透析袋放入10倍蛋白質(zhì)溶液以上體積的緩沖液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH為7.7)中，透析過夜，透析4-5次至透析液無顏色為止。

6、取40ml透析過的酶液經(jīng)ConA-Sapharose-4B柱，用緩沖液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH為7.7)沖洗，經(jīng)alpha-甘露糖苷洗脫后，經(jīng)緩沖液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH為7.7)透析過夜，得到純化后的CELI酶(約50mg)，分裝-80度保存。

三、酶切反應(yīng)及其效果

1、酶切緩沖液的配制

酶切緩沖液配制分成如下4組：

組1：10倍digestion buffer(含有Mg²⁺緩沖液配制)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、100mM MgCl₂；

組2：10倍digestion buffer(不含有Mg²⁺緩沖液配制)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、不同濃度的DTT(0.01mM、0.04mM、0.5mM、2mM、6mM)；

組3：向Mutation Detection Kit-S100試劑盒(含有Mg²⁺)中的緩沖液加入不同量的DTT，得到酶切緩沖液，使DTT的濃度分別為0mM、0.5mM、1.0mM、10mM、2.5mM、7.5mM、10Mm；

組4：10倍digestion buffer(不含Mg²⁺緩沖液配制)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、不同濃度的DTT(0.01mM、0.04mM、0.5mM、2mM、6mM、20mM)。

2、酶切反應(yīng)

取2ul的待酶切DNA樣品作為酶切反應(yīng)底物，用上述各組酶切緩沖液進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到酶切產(chǎn)物。

CELI酶切反應(yīng)體系(6ul)：10倍酶切緩沖液0.6ul、CELI酶(0.3mg/ml)0.2ul、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2.0ul、純水3.2ul。

CELII酶切反應(yīng)體系(6ul)：10倍酶切緩沖液0.6ul、CELII酶0.3mg/ml)0.2ul、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2.0ul、純水3.2ul。

酶切反應(yīng)條件：45℃溫育30min。

若酶切產(chǎn)物含有791bp、544bp和247bp的酶切片段，則待酶切DNA樣品含有錯(cuò)配位點(diǎn)(AC)；若酶切產(chǎn)物僅含有791bp的酶切片段，則待酶切DNA樣品不含有錯(cuò)配位點(diǎn)(AC)。

3、毛細(xì)管電泳

酶切反應(yīng)結(jié)束后立即加入2ul的0.225M的EDTA終止反應(yīng)(15ul體系應(yīng)加入3ul EDTA)，再補(bǔ)入91ul超純水稀釋樣品，可直接上機(jī)(FS 96，美國(guó)AATI公司)進(jìn)行毛細(xì)管電泳，毛細(xì)管電泳條件如表1所示。

表1、毛細(xì)管電泳條件

4、DTT對(duì)CELI酶和CELII酶切效果的影響

(1)DTT對(duì)CELI酶切效果的影響

酶切產(chǎn)物經(jīng)用毛細(xì)管分離的結(jié)果如圖1所示(其中CK為酶切緩沖液為組1；其余泳道的酶切緩沖液為組2；CELI酶切反應(yīng)體系)。從圖1可以看出：酶切產(chǎn)物分離得到791bp、544bp和247bp的酶切片段，與待酶切DNA樣品中錯(cuò)配位點(diǎn)(AC)一致，且濃度范圍在0.01-0.5mM的DTT的酶切效果好于Mg²⁺的酶切效果，說明濃度范圍在0.01-0.5mM的DTT的酶切效果均可提高CELI酶切活性。

(2)DTT對(duì)CELII酶切效果的影響

酶切產(chǎn)物經(jīng)用毛細(xì)管分離的結(jié)果如圖2和圖3所示(其中圖2的酶切緩沖液為組3；圖3的酶切緩沖液為組4；CELII酶切反應(yīng)體系)。從圖2和圖3可以看出：酶切產(chǎn)物均分離得到791bp、544bp和247bp的酶切片段，與待酶切DNA樣品中錯(cuò)配位點(diǎn)(AC)一致，且圖2中濃度范圍在0.5-10mM的DTT的酶切效果好于Mg²⁺的酶切效果，說明濃度范圍在0.5-10mM的DTT的酶切效果均可提高CELII酶切活性。