本發(fā)明涉及用于鑒定桃果實(shí)表皮毛性狀的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)、引物、試劑盒及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
選擇是育種中最重要的環(huán)節(jié)之一，它是指在一個(gè)群體中選擇符合要求的基因型，來進(jìn)行后續(xù)的培育。但在傳統(tǒng)育種中，由于很難獲知后代的基因型，因此選擇的依據(jù)通常是表現(xiàn)型而非基因型，這種選擇方法對(duì)質(zhì)量性狀而言一般是有效的，但對(duì)數(shù)量性狀來說，因?yàn)槠浔憩F(xiàn)型與基因型之間缺乏明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系，因而效率不高。此外，對(duì)于以果實(shí)性狀為目標(biāo)的果樹來說，這些性狀都有其特定的表現(xiàn)時(shí)期，通常需要度過3-5年甚至更長(zhǎng)時(shí)間的童期，因而選擇的時(shí)間較晚。這對(duì)于那些植株高大、占地多、生長(zhǎng)季長(zhǎng)的作物，特別是果樹之類的園藝作物，顯然是非常不利的。
近20年來迅速發(fā)展起來的基于DNA的分子標(biāo)記技術(shù)，即“分子標(biāo)記輔助選擇”(marker-assisted selection，縮寫為MAS)給育種提供了嶄新的途徑。它通過分析與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的基因型來進(jìn)行育種，從而達(dá)到提高育種效率的目的。Dirlewanger(2006)利用181個(gè)包括SSR(Simple Sequence Repeats，簡(jiǎn)單重復(fù)序列)和AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)的分子標(biāo)記，對(duì)207個(gè)后代的雜交群體擴(kuò)增，將果皮毛有/無性狀定位在第5連鎖群的81.4cM，最連鎖的SSR標(biāo)記CPSCT030與其連鎖距離為5.4cM。由于進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇有兩個(gè)重要的前提，首先是必須得到與目標(biāo)性狀緊密連鎖的標(biāo)記，即建立目標(biāo)基因與分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系。其次是檢測(cè)的自動(dòng)化，由于分子標(biāo)記輔助選擇要求對(duì)育種群體進(jìn)行大規(guī)模檢測(cè)，因而要求檢測(cè)的方法要簡(jiǎn)單、快速、成本低、比較準(zhǔn)確，以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過程(包括DNA的提取、分子標(biāo)記的檢測(cè)、數(shù)據(jù)分析等)的自動(dòng)化。但是，可以發(fā)現(xiàn)在過去很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)采用的分子標(biāo)記，如RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性)、RAPD(random amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)、AFLP和SSR等通常需要酶切或PCR后用電泳檢測(cè)分型結(jié)果，很難實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。
SNPs標(biāo)記(single nucleotide polymorphisms，單核苷酸多態(tài)性)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它在基因組上分布廣泛，數(shù)量眾多，因此很容易檢測(cè)到相對(duì)于RFLP、RAPD、AFLP、SSR標(biāo)記更連鎖的標(biāo)記，且在檢測(cè)時(shí)具有高通量、簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，是進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種中最具潛力的標(biāo)記。目前，Vendramin等人利用12個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)桃果皮毛基因區(qū)段進(jìn)行加密，發(fā)現(xiàn)位于Chr5的15897836-15899002bp處的基因ppa026143m上的一個(gè)轉(zhuǎn)座子插入導(dǎo)致了果皮毛性狀的突變，由于轉(zhuǎn)座子變異不能用芯片技術(shù)進(jìn)行快速鑒定，因此，不適合開發(fā)相應(yīng)的標(biāo)記，而與之最連鎖的SNP標(biāo)記位于Chr5(第5染色體)的16488104bp處。之后，Micheletti等人利用數(shù)量不超過9000個(gè)SNPs的芯片對(duì)1580份桃種質(zhì)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，得到了與果皮毛性狀關(guān)聯(lián)的SNPs位于Chr5的16774236bp處。
然而，現(xiàn)有的與桃果實(shí)表皮毛性狀連鎖的SSR標(biāo)記距離目標(biāo)基因定位距離較遠(yuǎn)，在雜交后代的早期鑒定中準(zhǔn)確率較低；而現(xiàn)有的與目標(biāo)性狀連鎖的SNPs標(biāo)記多來自芯片鑒定的結(jié)果，由于芯片位點(diǎn)較少(少于9000個(gè))，因此不能保證鑒定出的SNPs是與目標(biāo)性狀最關(guān)聯(lián)或連鎖的位點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供用于鑒定桃果實(shí)表皮毛性狀的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)、引物、試劑盒及應(yīng)用，該標(biāo)記位點(diǎn)在鑒定桃果實(shí)表皮毛性狀時(shí)具有較高的準(zhǔn)確率。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
用于鑒定桃果實(shí)表皮毛性狀的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，所述的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)是桃基因組第5染色體的第17576893位核苷酸，該核苷酸為A或G。
用于鑒定桃果實(shí)表皮毛性狀的PCR擴(kuò)增引物對(duì)，所述引物對(duì)中的上游引物是根據(jù)桃基因組第5染色體的第17576893位核苷酸及其上游序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，所述引物對(duì)中的下游引物是根據(jù)桃基因組第5染色體的第17576893位核苷酸的下游序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。
所述引物對(duì)由如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的兩條單鏈DNA分子組成。
用于鑒定桃果實(shí)表皮毛性狀的單堿基延伸引物，所述單堿基延伸引物為如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
用于鑒定桃果實(shí)表皮毛性狀的試劑盒，所述的試劑盒包括所述的PCR擴(kuò)增引物對(duì)和所述的單堿基延伸引物。
桃基因組第5染色體的第17576893位核苷酸的單核苷酸多態(tài)性在鑒定或輔助鑒定桃果實(shí)表皮是有毛性狀還是無毛性狀中的應(yīng)用。
一種單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)在桃果實(shí)表皮毛性狀分子標(biāo)記輔助選擇育種方面的應(yīng)用。
所述的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)在鑒定或輔助鑒定桃果實(shí)表皮是有毛性狀還是無毛性狀中的應(yīng)用。
一種試劑盒在桃果實(shí)表皮毛性狀分子標(biāo)記輔助選擇育種方面的應(yīng)用。
一種利用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)鑒定桃果實(shí)表皮毛性狀的方法，包括以下步驟：
(1)PCR擴(kuò)增：以待測(cè)桃的基因組DNA為模板，用PCR擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
(2)SAP反應(yīng)：配制SAP反應(yīng)體系，加入步驟(1)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后的反應(yīng)體系中，除去PCR擴(kuò)增反應(yīng)中未反應(yīng)的dNTP；
(3)單堿基延伸反應(yīng)：配制單堿基延伸反應(yīng)體系，加入步驟(2)SAP反應(yīng)后的反應(yīng)體系中；
(4)基因分型：將完成單堿基延伸反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行樹脂脫鹽處理，點(diǎn)在芯片上，由芯片掃描儀掃描，檢測(cè)分析，根據(jù)不同產(chǎn)物的分子量大小進(jìn)行基因分型。
本發(fā)明篩選得到桃基因組第5染色體的第17576893位核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，能夠用于鑒定或輔助鑒定桃果實(shí)表皮毛性狀，在鑒定桃果實(shí)表皮毛性狀時(shí)具有較高的準(zhǔn)確率。
本發(fā)明針對(duì)桃基因組第5染色體的第17576893位核苷酸多態(tài)性的特性，設(shè)計(jì)了特定的PCR引物擴(kuò)增對(duì)和單堿基延伸引物，將完成單堿基延伸反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行樹脂脫鹽處理，點(diǎn)在芯片上，由芯片掃描儀掃描，進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)，Typer4.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，根據(jù)不同產(chǎn)物的分子量大小獲得其基因分型結(jié)果。
本發(fā)明對(duì)15個(gè)雜交群體共221份待測(cè)桃單株進(jìn)行SNPs準(zhǔn)確率的驗(yàn)證，結(jié)果表明，本發(fā)明對(duì)桃果實(shí)表皮有毛性狀的檢測(cè)準(zhǔn)確率可達(dá)96％以上，對(duì)桃無毛性狀的檢測(cè)準(zhǔn)確率可達(dá)80％以上，具有較高的準(zhǔn)確率。這說明，利用本發(fā)明的單核苷酸標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)具有簡(jiǎn)單、快速、成本低的優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)生產(chǎn)中大規(guī)模的應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
實(shí)施例1 SNPs標(biāo)記位點(diǎn)的獲得
本發(fā)明以從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所桃種質(zhì)資源圃隨機(jī)獲得的129份桃種質(zhì)為樣品，采用常規(guī)CTAB法提取樣品DNA，并通過Illumina HiSeq 2000測(cè)序儀對(duì)129份桃種質(zhì)進(jìn)行重測(cè)序，得到121Gb數(shù)據(jù)，平均覆蓋桃基因組89.28％，平均測(cè)序深度為4.21×左右。根據(jù)測(cè)序得到的50-150bp的reads，與桃參考基因組v.1.0(http://www.rosaceae.org/node/355)進(jìn)行比對(duì)，鑒定出4063377個(gè)SNPs，利用這些SNPs對(duì)129份種質(zhì)的表型性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定出與桃果皮毛有顯著關(guān)聯(lián)的SNPs位于第5染色體的17576893bp處。
實(shí)施例2 利用SNP標(biāo)記鑒定表型性狀的方法
1、DNA提取
采用常規(guī)CTAB法提取待測(cè)桃樣品組織的DNA，去除RNA，DNA樣品總體積不低于15μl。用紫外光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值，計(jì)算DNA含量和OD260/280的比值。DNA樣品純度OD260/280值應(yīng)在1.8-2.0之間，濃度稀釋至10ng/μl。
2、設(shè)計(jì)引物
根據(jù)桃基因組第5染色體的第17576893位處左右各200bp序列(具體的核苷酸序列見表1)，設(shè)計(jì)引物。
表1 SNPs旁側(cè)序列信息
其中，R表示A或G。
引物由生物技術(shù)公司合成后，稀釋PCR擴(kuò)增上下游引物至終濃度均為0.5μM。稀釋單堿基延伸引物至延伸引物1、2、3終濃度分別為8μM、10μM、15μM，備用。引物序列見表2。
表2 引物序列
3、PCR反應(yīng)體系及Mass ARRAY分析
按照SEQUENOM-iPLEX標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行PCR、SAP、單堿基延伸反應(yīng)，主要步驟如下：
(1)PCR擴(kuò)增反應(yīng)
首先，配制PCR擴(kuò)增體系，具體見表3。
表3 Sequenom MassArray系統(tǒng)基因分型擴(kuò)增PCR反應(yīng)組分
其中，Primer Mix為PCR擴(kuò)增上游引物和下游引物各加入0.5μl。
將上述試劑轉(zhuǎn)移到PCR管或板中，
PCR擴(kuò)增程序如下：94℃15min；94℃20s，56℃30s，72℃1min，共45個(gè)循環(huán)；72℃3min；4℃保存。
配置1％瓊脂糖凝膠，對(duì)PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，如果條帶明亮且單一，則進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
(2)SAP(蝦堿性磷酸酶)反應(yīng)
利用該反應(yīng)除去未用盡的dNTP，首先配制反應(yīng)體系，見表4：
表4 SAP酶促反應(yīng)相關(guān)試劑配制組分
將配好的上述溶液2μl加入到完成PCR反應(yīng)的PCR管或板中。按如下程序進(jìn)行SAP反應(yīng)。
SAP反應(yīng)程序：37℃40min；85℃5min；4℃保存。
(3)單堿基延伸反應(yīng)
首先配制單堿基延伸反應(yīng)體系，見表5：
表5 延伸反應(yīng)相關(guān)試劑組分
其中，iPLEX Extend Primer Mix為單堿基延伸引物1、2、3的混合引物，引物1、2、3的加入濃度分別為8μM、10μM、15μM，單堿基延伸引物1、2、3的加入量相同，共0.94μl。
然后將配好的溶液2μl加入到SAP反應(yīng)后的PCR管或板中，進(jìn)行延伸反應(yīng)，程序如下：94℃30s；94℃5s，(52℃5s，80℃5s，5個(gè)循環(huán))，共40個(gè)循環(huán)；72℃3min；4℃保存。
將完成延伸反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行樹脂脫鹽處理，點(diǎn)在芯片上，由芯片掃描儀掃描，進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)，Typer4.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，根據(jù)不同產(chǎn)物的分子量大小獲得其基因分型結(jié)果。當(dāng)完成延伸反應(yīng)的產(chǎn)物分子量為5352.5左右時(shí)，Chr5：17,576,893bp處為純合位點(diǎn)，分型為G/G，對(duì)應(yīng)種質(zhì)的表型為果皮無毛。分子量為5432.4左右時(shí)，Chr5：17,576,893bp處為純合位點(diǎn)，分型為A/A；分子量約為5392.5時(shí)，Chr5：17,576,893bp處為雜合位點(diǎn)，分型為A/G；A/A和A/G這兩種分型對(duì)應(yīng)的種質(zhì)表型為果皮有毛。
實(shí)施例3 15個(gè)雜交群體利用果皮毛關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記進(jìn)行表型性狀的盲測(cè)驗(yàn)證
1、實(shí)驗(yàn)材料的選擇
以鄭州果樹研究所資源圃中種植的常規(guī)桃品種為實(shí)驗(yàn)材料，從中選取調(diào)查過表型性狀的15個(gè)雜交群體共221份單株，具體見表6。
表6 供試雜交群體的名稱及群體大小信息
2、利用果皮毛關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記的鑒定方法
以本發(fā)明桃基因組第5染色體的第17576893位作為核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，對(duì)15個(gè)雜交群體共221份桃單株果皮毛進(jìn)行盲測(cè)鑒定，具體的鑒定方法參照實(shí)施例2的方法。同時(shí)，以現(xiàn)有的國外報(bào)道的桃基因SNPs位點(diǎn)作為對(duì)照，與本發(fā)明的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行比較分析。
3、雜交群體中分型結(jié)果對(duì)表型的預(yù)測(cè)能力比較
從鑒定結(jié)果可以看出，與目前國外報(bào)道的利用約9千個(gè)SNPs進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析(Chr5：16774236bp)或約3千個(gè)SNPs進(jìn)行連鎖分析(Chr5：16488104bp)得到的最連鎖SNPs相比，本發(fā)明SNPs位點(diǎn)的卡方測(cè)驗(yàn)P值最低，即顯著性最高(表7)。
表7 不同果皮毛關(guān)聯(lián)或連鎖SNPs在15個(gè)雜交群體的分型結(jié)果及卡方測(cè)驗(yàn)
綜合比較，其準(zhǔn)確率如表8所示，可以看出本發(fā)明在進(jìn)行雜交群體的表型性狀預(yù)測(cè)時(shí)，準(zhǔn)確率有明顯提升，果皮毛SNPs較最近報(bào)道的其他研究平均準(zhǔn)確率從58.37％提升至90.95％。
表8 本發(fā)明涉及的SNPs在對(duì)15個(gè)雜交群體鑒定后的表型預(yù)測(cè)能力(準(zhǔn)確率)比較
綜上所述，本發(fā)明的SNPs位點(diǎn)能夠幫助實(shí)現(xiàn)利用桃幼苗DNA早期預(yù)測(cè)桃成齡后果皮毛性狀的目的，該方法是利用重測(cè)序得到的400萬以上SNPs中全基因組關(guān)聯(lián)分析得到最關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)從而實(shí)現(xiàn)的，由于原始SNPs數(shù)量龐大，從而保證了得到的關(guān)聯(lián)標(biāo)記關(guān)聯(lián)性高。