本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種特異性表達(dá)人CD46轉(zhuǎn)基因豬的實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)在2015年最新發(fā)布的數(shù)據(jù)，世界范圍內(nèi)共有4.15億成年人患有糖尿病。2015年有500萬人因糖尿病而死亡，超過了瘧疾、肺結(jié)核與HIV的致死人數(shù)總和。糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥的治療費(fèi)用十分巨大，估計(jì)每年超過6700億美元，高于美國全部的軍事費(fèi)用。目前，對糖尿病的治療包括胰島素注射和胰島移植。用于糖尿病治療的多基因修飾豬將為糖尿病的治療提供人胰島素，同時(shí)也將為臨床異種胰島移植治療提供更為理想的供體來源。

由于豬細(xì)胞表面有由α-1,3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶催化產(chǎn)生的Gal抗原表位，因此，當(dāng)豬的器官移植到人體內(nèi)時(shí)，Gal抗原表位被Gal抗體識(shí)別，引發(fā)超急性免疫排斥反應(yīng)，導(dǎo)致移植失敗。敲除α-1,3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因，同時(shí)導(dǎo)入人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白基因hCD46，可有效的阻斷補(bǔ)體激活路徑，克服異種器官移植面臨的超敏排斥反應(yīng)。

目前轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其成分的檢測方法主要有免疫膠體金技術(shù)、普通PCR及DNA探針雜交技術(shù)，但是仍然存在特異性和靈敏性的問題。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)靈敏度高，可靠性好，為全封閉反應(yīng)，但是該技術(shù)需要價(jià)格昂貴的熒光定量PCR儀器，并且要保證高特異性，往往需要熒光標(biāo)記探針，檢測成本高。另外，精密貴重的儀器對質(zhì)量控制、操作環(huán)境和人員的專業(yè)能力要求較高，難以滿足現(xiàn)場快速篩查的要求。因此，迫切需要建立快速、簡便、特異性高的檢測技術(shù)，以滿足現(xiàn)場檢測的需求，建立一種更適合現(xiàn)場快速篩查的檢測方法成為當(dāng)務(wù)之急。

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)是2000年由日本學(xué)者Notomi開發(fā)的一門新興的基因擴(kuò)增技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏性高、等溫高效、操作簡便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。但由于LAMP擴(kuò)增是鏈置換合成，靶序列長度好在300bp以內(nèi)，大于500bp則較難擴(kuò)增，故不能進(jìn)行長鏈DNA的擴(kuò)增。由于靈敏度高，極易受到污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因此特別注意嚴(yán)謹(jǐn)操作，來防范非特異性擴(kuò)增與污染，以及在產(chǎn)物的回收鑒定、克隆、單鏈分離方面均遜色于傳統(tǒng)的PCR方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種基于便攜式ESEQuant TS Tube Scanner(QIAGEN)實(shí)時(shí)熒光檢測儀的特異性表達(dá)人CD46轉(zhuǎn)基因豬的實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測方法及試劑盒。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種特異性表達(dá)人CD46轉(zhuǎn)基因豬的實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測方法，所述方法具體包括以下步驟：

1)提取待檢樣品基因組DNA作為LAMP檢測反應(yīng)的模板；

2)配制反應(yīng)液，構(gòu)建檢測體系；

所述的反應(yīng)液包括：

步驟1)提取的DNA模板；

兩條外引物：F3：GCTGTGTCCGTGGTGAGA；

B3：GAACTCTGCACACAGGCC；

兩條內(nèi)引物：FIP：ACCCTTACCGCGGGTACTGTCTTTGCCCTGTGTTCCCTTG；

BIP：GTCTGCTGTGCCCCATGTGCTTACGCACAGCACGCTC；

兩條環(huán)引物：LF：CCCTAATGAACACCCCACTCA；

LB：CCTGGCCAGGTGTTGCT；

3)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)：將所述反應(yīng)液離心混勻，進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；

4)結(jié)果判斷：若有“S”型擴(kuò)增曲線，則判斷為陽性，即具有hCD46基因；若無“S”型擴(kuò)增曲線，則判為陰性，即不含有hCD46基因。

其中，使用ESEQuant TS tube scanner，按如下方法設(shè)置等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件：

A)Acquisition設(shè)置Test Time[min]：45，Scan Interval：1min，Mix after[s]：0，Temperature[℃]：63，Equil Time[s]：60；B)Evaluation設(shè)置

在FAM通道下，設(shè)置Slope Validation選項(xiàng)，Star[min]：6，End[min]：44，Period[Points]：4，Slope[mV/min]：30，然后把Slope Validation選項(xiàng)前的復(fù)選框標(biāo)記為選定狀態(tài)。

在TAMRA通道下，把Slope Validation選項(xiàng)前的復(fù)選框標(biāo)記為未選定狀態(tài)。

C)Normalization設(shè)置

溫度設(shè)置為63℃，單擊set control on，待儀器升溫并穩(wěn)定到63℃，將反應(yīng)管放入儀器中，點(diǎn)擊開始按鈕開始反應(yīng)。進(jìn)一步地，所述檢測體系為25μL熒光改良LAMP反應(yīng)體系，包括：兩條內(nèi)引物各1.6μM，兩條外引物各0.2μM，兩條環(huán)引物0.8μM，1μLDNA模板。

更進(jìn)一步地，所述檢測體系為25μL熒光改良LAMP反應(yīng)體系，還包括2.5μL 10×Isothermal buffer(包含：20mM Tris-HCl，50mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Tween-20)，0.8M甜菜堿，0.2mM每dNTPs，8U Bst DNA聚合酶，0.5μL SYBR Green I(25×)。

在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，所述檢測體系為25μL熒光改良LAMP反應(yīng)體系如下：

作為優(yōu)選，基于上述特定反應(yīng)體系，本發(fā)明篩選了最佳的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件，具體為63℃反應(yīng)45min。

本發(fā)明還提供了一種特異性表達(dá)人CD46轉(zhuǎn)基因豬的實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測引物組合，所述引物組合包括：

兩條外引物：F3：GCTGTGTCCGTGGTGAGA；

B3：GAACTCTGCACACAGGCC；

兩條內(nèi)引物：FIP:ACCCTTACCGCGGGTACTGTCTTTGCCCTGTGTTCCCTTG；

BIP:GTCTGCTGTGCCCCATGTGCTTACGCACAGCACGCTC；

兩條環(huán)引物：LF:CCCTAATGAACACCCCACTCA；

LB:CCTGGCCAGGTGTTGCT。

本還提供了含有前述引物組合的試劑或試劑盒。

作為優(yōu)選，所述試劑或試劑盒中，兩條內(nèi)引物各1.6μM，兩條外引物各0.2μM，兩條環(huán)引物0.8μM，1μLDNA模板。

更為優(yōu)選，所述試劑或試劑盒還包括2.5μL 10×Isothermal buffer(包含：20mM Tris-HCl，50mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Tween-20)，0.8M甜菜堿，0.2mM每dNTPs，8U Bst DNA聚合酶，0.5μL SYBR Green I(25×)。

本發(fā)明還進(jìn)一步提供了前述引物組合或前述試劑或試劑盒在特異性表達(dá)人CD46轉(zhuǎn)基因豬的實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明基于便攜式ESEQuant TS Tube Scanner(QIAGEN)實(shí)時(shí)熒光檢測儀，建立了用于特異性表達(dá)人CD46轉(zhuǎn)基因豬的實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測方法。該方法適用于現(xiàn)場快速篩查，閉管檢測熒光擴(kuò)增信號(hào)，避免了反應(yīng)后的開蓋操作，降低了氣溶膠污染的風(fēng)險(xiǎn)，大大減少了發(fā)生假陽性的可能。同時(shí)，縮短了反應(yīng)時(shí)間，45min內(nèi)可以得出判定結(jié)果。

本發(fā)明提供的實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測方法特異性高，利用多條引物擴(kuò)增目的基因的特異區(qū)域，確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性；靈敏度高；最低可檢測出6pg/μL的基因，檢測靈敏度是相應(yīng)普通PCR的100倍。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中所述鎂離子濃度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中所述甜菜堿濃度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中所述dNTPs濃度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中所述引物濃度比的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中所述實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測靈敏度試驗(yàn)結(jié)果。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例2中所述普通PCR檢測靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例3中所述實(shí)時(shí)熒光LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例4中所述標(biāo)本檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

參照hCD46陽性質(zhì)粒序列及相關(guān)文獻(xiàn)資料，依據(jù)LAMP引物設(shè)計(jì)原則，使用在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer version 4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/indx.html)進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)，通過DNAMAN對引物進(jìn)行分析，挑選出6條引物：

兩條外引物：F3：GCTGTGTCCGTGGTGAGA；

B3：GAACTCTGCACACAGGCC；

兩條內(nèi)引物：FIP:ACCCTTACCGCGGGTACTGTCTTTGCCCTGTGTTCCCTTG；

BIP:GTCTGCTGTGCCCCATGTGCTTACGCACAGCACGCTC；

兩條環(huán)引物：LF:CCCTAATGAACACCCCACTCA；

LB:CCTGGCCAGGTGTTGCT。

實(shí)施例1 LAMP反應(yīng)體系條件的優(yōu)化

LAMP為25μL反應(yīng)體系，初步確定通用組分及濃度：2.5μL 10×Isothermal buffer(包含：20mM Tris-HCl，50mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO4，0.1％Tween-20)，0.8M甜菜堿，6mM MgSO4，1.4mM每dNTPs，8U Bst DNA聚合酶，0.5μL SYBR Green I(25×)，兩條內(nèi)引物各1.6μM，兩條外引物各0.2μM，兩條環(huán)引物0.8μM，1μLDNA模板。對甜菜堿、鎂離子濃度、dNTPs濃度、引物濃度及配比進(jìn)行優(yōu)化。

(1)鎂離子濃度的優(yōu)化：LAMP反應(yīng)體系中Mg²⁺(MgSO₄)終濃度分別為：2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM，即向反應(yīng)體系中加入25mM的MgSO₄依次為：0μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL。重復(fù)試驗(yàn)，以確定最適濃度(圖1)。

結(jié)果顯示，隨著加入鎂離子濃度的增大，出峰時(shí)間逐步延后，因此反應(yīng)體系中不需額外加入鎂離子，即鎂離子終濃度為2mM，不同于其他文獻(xiàn)中所述的8mM。

(2)甜菜堿濃度的優(yōu)化：使LAMP體系中甜菜堿終濃度分別為：0.2M、0.4M、0.6M、0.8M，即加入5M甜菜堿分別為：1μL、2μL、3μL、4μL，研究甜菜堿對LAMP反應(yīng)的影響，確定最適添加量(圖2)。

結(jié)果顯示，出峰時(shí)間隨著甜菜堿加入量的減少，依次延后，故確定甜菜堿濃度為0.8M。

(3)dNTPs濃度的優(yōu)化：反應(yīng)體系中dNTPs濃度分別為：0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM，即向反應(yīng)體系中加入2.5mM的dNTPs分別為1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL。重復(fù)試驗(yàn)，以確定最合適濃度(圖3)。

結(jié)果顯示，dNTPs濃度為0.2mM時(shí)，出峰時(shí)間最早，最終確定dNTPs濃度為0.2mM，不同于其他文獻(xiàn)中所述的1.4mM。

(4)引物濃度及配比的優(yōu)化：設(shè)定外引物：內(nèi)引物：環(huán)引物分別為1:8:4，1:8:1，1:1:1，1:4:1。重復(fù)試驗(yàn)，以確定最適濃度及比例(圖4)。

結(jié)果顯示，當(dāng)外引物為0.2μM，內(nèi)引物為1.6μM，環(huán)引物為0.8μM時(shí)，即1:8:4的引物比為最適引物濃度比。

實(shí)施例2 靈敏度實(shí)驗(yàn)

將CD46陽性質(zhì)粒進(jìn)行10倍比稀釋，稀釋度為10^-1到10^-7七個(gè)稀釋度，按照實(shí)施例1所優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系用ESEQuant TS tube scanner進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，以確定本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測的最低稀釋度(見圖5)；同時(shí)以F3、B3為引物，研究普通PCR檢測的靈敏度(見圖6)，進(jìn)行比較。

靈敏度分析結(jié)果表明，將CD46的陽性質(zhì)粒稀釋到10^-5稀釋度，濃度為6pg/μL時(shí)，實(shí)時(shí)熒光LAMP法仍可以檢測到擴(kuò)增曲線，即最低檢測濃度為6pg/μL；普通PCR只檢測到10^-3稀釋度，最低檢測濃度為600pg/μL，由此確定實(shí)時(shí)熒光LAMP的檢測靈敏度為常規(guī)PCR的100倍。

實(shí)施例3 特異性實(shí)驗(yàn)

分別以CD46、CD39(胰島素特異性表達(dá)基因)、LEA29Y(高效抑制T細(xì)胞活性的新型融合蛋白基因)陽性質(zhì)粒、以及水作為模版，按照實(shí)施例1所優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系用ESEQuant TS tube scanner進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，以確定所述檢測方法的特異性(圖7)。

結(jié)果顯示，本研究建立的實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測方法只對CD 46基因有特異性擴(kuò)增曲線，CD 39、LEA29Y及水無擴(kuò)增曲線，為陰性反應(yīng)，說明該方法具有很好的特異性。

實(shí)施例4 標(biāo)本檢測

取四份轉(zhuǎn)基因豬的口腔拭子：標(biāo)本1、標(biāo)本2(特異性表達(dá)hTBM+CD6)；標(biāo)本3、標(biāo)本4(特異性表達(dá)CD6)。用傳統(tǒng)方法提取核酸。按照實(shí)施例1所優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系用ESEQuant TS tube scanner進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，以確定所述檢測方法的實(shí)用性(圖8)。

結(jié)果顯示，本研究可以對口腔拭子進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，因此本實(shí)驗(yàn)方法可以施行活體采樣檢測，大大簡化了采樣及檢測步驟。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。