本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL及分子標(biāo)記的獲得方法、分子標(biāo)記和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：大豆是在中國乃至世界范圍當(dāng)中都是重要的經(jīng)濟(jì)作物，其原因就在于大豆是人們?nèi)粘Ｉ钪行枰闹参锏鞍椎闹饕獊碓粗?，同時(shí)大豆又是畜牧養(yǎng)殖業(yè)的重要的飼料作物。因此，大豆子粒當(dāng)中的蛋白質(zhì)含量成為衡量大豆品種的重要指標(biāo)之一。然而，目前我國主要生產(chǎn)的高蛋白品種大豆無法滿足人們?nèi)粘Ｉa(chǎn)生活需要。因此，利用現(xiàn)代化分子育種技術(shù)提高現(xiàn)有大豆品種蛋白質(zhì)含量成為當(dāng)代育種科研人員的主要任務(wù)。大豆蛋白含量屬于多基因控制的數(shù)量性狀遺傳，對這一性狀進(jìn)行QTL分析和定位，可以發(fā)掘有利用價(jià)值的SSR位點(diǎn)，以培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的新品種。國內(nèi)外對于大豆蛋白QTL做過大量分析，但是沒有對高效位點(diǎn)進(jìn)行有效確定，也沒有明確位點(diǎn)的真實(shí)作用，從而無法直接應(yīng)用到實(shí)際育種當(dāng)中，并且可能出現(xiàn)重要位點(diǎn)的丟失。近年來分子標(biāo)記輔助育種已經(jīng)得到了一定的發(fā)展,但是卻有一些不足之處。首先，大豆蛋白質(zhì)是由多基因控制的數(shù)量性狀遺傳，這一遺傳方式是由多基因控制的，因?yàn)閱我晃稽c(diǎn)對性狀的影響很小，必須由多個(gè)基因?qū)ζ洳倏夭判?，再加上環(huán)境因子對于表型的影響也很大，所以單一位點(diǎn)的作用很難被直接評估出來，導(dǎo)致無法應(yīng)用在實(shí)際育種當(dāng)中。對于數(shù)量性狀遺傳的最初步認(rèn)識，是將微效多基因看成一個(gè)整體用生物統(tǒng)計(jì)法來分析。后來又出現(xiàn)了微效多基因假說，認(rèn)為數(shù)量遺傳是有多個(gè)微效基因共同控制。最新的研究成果已經(jīng)證實(shí)這一假設(shè)是有缺陷的。數(shù)量性狀遺傳是有一個(gè)主效基因和多個(gè)微效基因共同調(diào)控，而且基因與環(huán)境互作對表型的影響很大。可以說數(shù)量性狀的表現(xiàn)就是有主效位點(diǎn)、微效位點(diǎn)和環(huán)境因子共同影響下完成的。因此從基因的層面上來講，判斷出各個(gè)位點(diǎn)對蛋白質(zhì)含量的效應(yīng)值就顯得極為重要。另外分層評價(jià)是以卡方檢驗(yàn)和T檢驗(yàn)為手段的一種統(tǒng)計(jì)方法，用于分析一組影響因子對某一效應(yīng)產(chǎn)生的效應(yīng)值。是一種以綜合評判標(biāo)準(zhǔn)分析某一性狀的統(tǒng)計(jì)方法。目前為止分層評價(jià)在生物領(lǐng)域當(dāng)中的應(yīng)用并不多見。目前，國內(nèi)外眾多大豆育種學(xué)者都在研究大豆的數(shù)量遺傳性狀。目前已發(fā)表的有關(guān)MAS和QTL定位的文章多為研究的標(biāo)記和位點(diǎn)的潛在應(yīng)用價(jià)值，很少將其真正應(yīng)用到實(shí)際育種中，更少有人對數(shù)量遺傳基因的效應(yīng)值給出結(jié)論，在大豆子粒蛋白質(zhì)含量這一方面也是一個(gè)空白。眾所周知，大豆子粒蛋白質(zhì)含量是數(shù)量性狀遺傳，由多基因控制。在這些基因中必然有的基因?qū)υ撔誀畹挠绊戄^大，有些則影響較小。在得知各個(gè)基因?qū)Φ鞍踪|(zhì)含量這一性狀的具體影響之前，很難將這些直接應(yīng)用于實(shí)際育種當(dāng)中。采取分層評價(jià)是一個(gè)比較有效的解決手段。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對上述問題，本發(fā)明通過分層評價(jià)等統(tǒng)計(jì)分析方法，提供5種與大豆中大豆蛋白質(zhì)含量密切相關(guān)的QTL，并準(zhǔn)確的驗(yàn)證出各個(gè)大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)QTL的效應(yīng)值以及作用方式，通過變化率的計(jì)算發(fā)現(xiàn)3個(gè)關(guān)鍵QTL能夠增加蛋白質(zhì)含量，2個(gè)關(guān)鍵QTL能夠降低大豆蛋白質(zhì)含量。從而將其直接應(yīng)用于實(shí)際分子育種當(dāng)中。本發(fā)明提供的五個(gè)QTL中，Satt683屬于大豆子粒蛋白質(zhì)含量的主效QTL。Satt409、Satt180、Satt584、Satt181屬于高效QTL。其中包含的等位基因Satt683-3、Satt409-2和Satt584-5對于大豆蛋白含量這個(gè)性狀表現(xiàn)的是正相關(guān)，即其對應(yīng)的等位基因在大豆子粒中的作用是促進(jìn)大豆蛋白質(zhì)含量增加，而Satt181-2和Satt180-5對于大豆蛋白含量這個(gè)性狀表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)，即其對應(yīng)的等位基因在大豆子粒中的作用是抑制大蛋白質(zhì)含量增加。3個(gè)對大豆蛋白質(zhì)性狀相關(guān)的QTL的信息見表1，其中列出的等位基因?yàn)榕c性狀正相關(guān)的等位基因。表13個(gè)對大豆蛋白質(zhì)性狀相關(guān)的QTL2個(gè)對大豆蛋白質(zhì)性狀相關(guān)的QTL的信息件表2，其中列出的等位基因?yàn)榕c性狀負(fù)相關(guān)的等位基因。表22個(gè)對大豆蛋白質(zhì)性狀相關(guān)的QTL可以直接用引物擴(kuò)增，鑒定待測品種是否含有該等位基因，用于分子標(biāo)記輔助選擇。(一)、本發(fā)明提供一個(gè)與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL：位于連鎖群N上，在公共圖譜的基因組位置為27.787cM，由分子標(biāo)記Satt683定位；分子標(biāo)記Satt683的5’-3’引物如SEQIDNO.1所示，3’-5’引物如SEQIDNO.2所示。該QTL包含效應(yīng)值為12％的等位基因Satt683-3，該等位基因與大豆蛋白質(zhì)含量正相關(guān)。本發(fā)明還提供上述與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL的分子標(biāo)記的獲得方法：該分子標(biāo)記的5’-3’引物如SEQIDNO.1所示，3’-5’引物如SEQIDNO.2所示；以大豆品種北豆5號為輪回親本，與天鵝蛋ZDD02114雜交，共經(jīng)過兩次雜交和兩次回交之后獲得的大豆個(gè)體基因組DNA為模板；用上述5’-3’引物和3’-5’引物對上述模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系為10μL，包括1.5ng/μL的DNA模板0.8μL，0.5μmol/L的5’-3’引物、3’-5’各0.5μL，200mmol/L的dNTP0.6μL，5U/μL的Taq酶0.05μL，10XBuffer1μL，陽離子采用MgCl2終濃度1.5-2.0mmol/L，其余用超純水補(bǔ)足；PCR擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性94℃5分鐘；變性94℃40秒、退火47℃40秒、延伸72℃40秒，循環(huán)35次；延伸72℃5分鐘；4℃結(jié)束反應(yīng)。將上述PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物變形程序：94℃5分鐘，電泳分離后，得到的大小為450bp、430bp或410bp的擴(kuò)增片段，即為目標(biāo)分子標(biāo)記。本發(fā)明還提供上述與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL的分子標(biāo)記：該分子標(biāo)記的5’-3’引物如SEQIDNO.1所示，3’-5’引物如SEQIDNO.2所示。本發(fā)明還提供上述的分子標(biāo)記用于大豆分子育種的方法：該分子標(biāo)記的5’-3’引物如SEQIDNO.1所示，3’-5’引物如SEQIDNO.2所示；用其5’-3’引物和3’-5’引對待測大豆品種的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系為10μL，包括1.5ng/μL的DNA模板0.8μL，0.5μmol/L的5’-3’引物、3’-5’各0.5μL，200mmol/L的dNTP0.6μL，5U/μL的Taq酶0.05μL，10XBuffer1μL，陽離子采用MgCl2終濃度1.5-2.0mmol/L，其余用超純水補(bǔ)足；PCR擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性94℃5分鐘；變性94℃40秒、退火47℃40秒、延伸72℃40秒，循環(huán)35次；延伸72℃5分鐘；4℃結(jié)束反應(yīng)。將上述PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物變形程序：94℃5分鐘，電泳分離后，如果擴(kuò)增產(chǎn)物中存在大小為450bp、430bp或410bp的擴(kuò)增片段，則該待測大豆品種具有與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTLSatt683，若擴(kuò)增產(chǎn)物中存在大小為410bp的擴(kuò)增片段，則該待測大豆品種為具有與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTLSatt683中的增加大豆蛋白質(zhì)含量的等位基因Satt683-3的品種，否則，待測品種不具有該QTL或該等位基因。(二)、本發(fā)明提供的另一個(gè)與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL：位于連鎖群A2上，在公共圖譜的基因組位置為145.565cM，由分子標(biāo)記Satt409定位，分子標(biāo)記Satt409的5’-3’引物如SEQIDNO.3所示，3’-5’引物如SEQIDNO.4所示。該QTL包含效應(yīng)值為10％的等位基因Satt409-2，該等位基因與大豆蛋白質(zhì)含量正相關(guān)。本發(fā)明還提供上述與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL的分子標(biāo)記的獲得方法：該分子標(biāo)記的5’-3’引物如SEQIDNO.3所示，3’-5’引物如SEQIDNO.4所示；以大豆品種北豆5號為輪回親本，與天鵝蛋ZDD02114或中黃雜交，共經(jīng)過兩次雜交和兩次回交之后獲得的大豆個(gè)體基因組DNA為模板；用上述5’-3’引物和3’-5’引物對上述模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系和程序同(一)；將上述PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，得到的大小為360bp、330bp或300bp的擴(kuò)增片段，即為目標(biāo)分子標(biāo)記。本發(fā)明還提供上述與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL的分子標(biāo)記：該分子標(biāo)記的5’-3’引物如SEQIDNO.3所示，3’-5’引物如SEQIDNO.4所示。本發(fā)明還提供上述的分子標(biāo)記用于大豆分子育種的方法：該分子標(biāo)記的5’-3’引物如SEQIDNO.3所示，3’-5’引物如SEQIDNO.4所示；用其5’-3’引物和3’-5’引對待測大豆品種的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系和程序同(一)；將上述擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，如果擴(kuò)增產(chǎn)物中存在大小為360bp、330bp或300bp的擴(kuò)增片段，則該待測大豆品種具有與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTLSatt409，若擴(kuò)增產(chǎn)物中存在大小為330bp的擴(kuò)增片段，則該待測大豆品種為具有與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTLSatt409中的增加大豆蛋白質(zhì)含量的等位基因Satt409-2的品種，否則，待測品種不具有該QTL或該等位基因。(三)、本發(fā)明提供的另一個(gè)與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL：位于連鎖群N上，在公共圖譜的基因組位置為29.37cM，由分子標(biāo)記Satt584定位，分子標(biāo)記Satt584的5’-3’引物如SEQIDNO.5所示，3’-5’引物如SEQIDNO.6所示。該QTL包含效應(yīng)值為10％的等位基因Satt584-5，該等位基因與大豆蛋白質(zhì)含量正相關(guān)。本發(fā)明還提供上述與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL的分子標(biāo)記的獲得方法：該分子標(biāo)記的5’-3’引物如SEQIDNO.5所示，3’-5’引物如SEQIDNO.6所示；以大豆品種北豆5號為輪回親本，與天鵝蛋ZDD02114雜交，共經(jīng)過兩次雜交和兩次回交之后獲得的大豆個(gè)體基因組DNA為模板；用上述5’-3’引物和3’-5’引物對上述模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系和程序同(一)；將上述PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，得到的大小為400bp、350bp或300bp的擴(kuò)增片段，即為目標(biāo)分子標(biāo)記。本發(fā)明還提供上述與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL的分子標(biāo)記：該分子標(biāo)記的5’-3’引物如SEQIDNO.5所示，3’-5’引物如SEQIDNO.6所示。本發(fā)明還提供上述的分子標(biāo)記用于大豆分子育種的方法：該分子標(biāo)記的5’-3’引物如SEQIDNO.5所示，3’-5’引物如SEQIDNO.6所示；用其5’-3’引物和3’-5’引對待測大豆品種的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系和程序同(一)；將上述擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，如果擴(kuò)增產(chǎn)物中存在大小為400bp、350bp或300bp的擴(kuò)增片段，則該待測大豆品種具有與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTLSatt584，若擴(kuò)增產(chǎn)物中存在大小為300bp的擴(kuò)增片段，則該待測大豆品種為具有與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTLSatt584中的增加大豆蛋白質(zhì)含量的等位基因Satt584-5的品種，否則，待測品種不具有該QTL或該等位基因。(四)、本發(fā)明提供的另一個(gè)與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL：位于連鎖群C1上，在公共圖譜的基因組位置為105.092cM，由分子標(biāo)記Satt181定位，分子標(biāo)記Satt181的5’-3’引物如SEQIDNO.7所示，3’-5’引物如SEQIDNO.8所示。該QTL包含效應(yīng)值為8％的等位基因Satt181-2，該等位基因與大豆蛋白質(zhì)含量負(fù)相關(guān)。本發(fā)明還提供上述與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL的分子標(biāo)記的獲得方法：該分子標(biāo)記的5’-3’引物如SEQIDNO.7所示，3’-5’引物如SEQIDNO.8所示；以大豆品種北豆5號為輪回親本，與大明白豆子或艾卡166雜交，共經(jīng)過兩次雜交和兩次回交之后獲得的大豆個(gè)體基因組DNA為模板；用上述5’-3’引物和3’-5’引物對上述模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系和程序同(一)；將上述PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，得到的大小為300bp、280bp或180bp的擴(kuò)增片段，即為目標(biāo)分子標(biāo)記。本發(fā)明還提供上述與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL的分子標(biāo)記：該分子標(biāo)記的5’-3’引物如SEQIDNO.7所示，3’-5’引物如SEQIDNO.8所示。本發(fā)明還提供上述的分子標(biāo)記用于大豆分子育種的方法：該分子標(biāo)記的5’-3’引物如SEQIDNO.7所示，3’-5’引物如SEQIDNO.8所示；用其5’-3’引物和3’-5’引對待測大豆品種的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系和程序同(一)；將上述擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，如果擴(kuò)增產(chǎn)物中存在大小為300bp、280bp或180bp的擴(kuò)增片段，則該待測大豆品種具有與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTLSatt181，若擴(kuò)增產(chǎn)物中存在大小為280bp的擴(kuò)增片段，則該待測大豆品種為具有與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTLSatt181中的減少大豆蛋白質(zhì)含量的等位基因Satt181-2的品種，否則，待測品種不具有該QTL或該等位基因。(五)、本發(fā)明提供的另一個(gè)與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL：位于連鎖群H上，在公共圖譜的基因組位置為87.597cM，由分子標(biāo)記Satt180定位，分子標(biāo)記Satt180的5’-3’引物如SEQIDNO.9所示，3’-5’引物如SEQIDNO.10所示。該QTL包含效應(yīng)值為8％的等位基因Satt180-5，該等位基因與大豆蛋白質(zhì)含量負(fù)相關(guān)。本發(fā)明還提供上述與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL的分子標(biāo)記的獲得方法：該分子標(biāo)記的5’-3’引物如SEQIDNO.9所示，3’-5’引物如SEQIDNO.10所示；以大豆品種北豆5號為輪回親本，與Biogedulote或艾卡166或瑞豐2號雜交，共經(jīng)過兩次雜交和兩次回交之后獲得的大豆個(gè)體基因組DNA為模板；用上述5’-3’引物和3’-5’引物對上述模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系和程序同(一)；將上述PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，得到的大小為350bp、340bp或300bp的擴(kuò)增片段，即為目標(biāo)分子標(biāo)記。本發(fā)明還提供上述與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL的分子標(biāo)記：該分子標(biāo)記的5’-3’引物如SEQIDNO.9所示，3’-5’引物如SEQIDNO.10所示。本發(fā)明還提供上述的分子標(biāo)記用于大豆分子育種的方法：該分子標(biāo)記的5’-3’引物如SEQIDNO.9所示，3’-5’引物如SEQIDNO.10所示；用其5’-3’引物和3’-5’引對待測大豆品種的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系和程序同(一)；將上述擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，如果擴(kuò)增產(chǎn)物中存在大小為350bp、340bp或300bp的擴(kuò)增片段，則該待測大豆品種具有與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTLSatt180，若擴(kuò)增產(chǎn)物中存在大小為300bp的擴(kuò)增片段，則該待測大豆品種為具有與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTLSatt180中的減少大豆蛋白質(zhì)含量的等位基因Satt180-5的品種，否則，待測品種不具有該QTL或該等位基因。上述電泳分離，為聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳。了解了蛋白相關(guān)基因的效應(yīng)值，我們就可以通過檢驗(yàn)?zāi)炒蠖蛊贩N當(dāng)中是否有高效位點(diǎn)來判斷該品種的大豆是否是蛋白含量高的優(yōu)質(zhì)大豆，這樣就實(shí)現(xiàn)該基因在分子輔助育種當(dāng)中的實(shí)際應(yīng)用。本發(fā)明在已知的大量大豆蛋白質(zhì)相關(guān)QTL中確定重要的、效應(yīng)大的QTL，并確定各個(gè)基因?qū)Υ蠖沟鞍踪|(zhì)形狀的具體影響：是正相關(guān)還是負(fù)相關(guān)，并利用這些QTL實(shí)現(xiàn)以分子標(biāo)記為手段進(jìn)行育種。附圖說明圖1大豆Satt683在表1所示的250份資源大豆中的編號1-61中的帶型；圖2卡方分析資源等位基因的分層分析；圖3T-測驗(yàn)的資源等位基因的分層分析；圖4等位基因在群體的SSR分析；圖5卡方分析群體等位基因的分層分析；圖6T-測驗(yàn)的群體等位基因的分層分析；圖7各個(gè)等位基因在資源和北豆群體中變化率；圖8Satt683的引物對母本為北豆5號父本為天鵝蛋ZDD02114的群體的基因組DNA擴(kuò)展產(chǎn)物毛細(xì)管電泳圖；圖9Satt409的引物對母本為北豆5號父本為天鵝蛋ZDD02114或中黃的群體的基因組DNA擴(kuò)展產(chǎn)物毛細(xì)管電泳圖；圖10Satt584的引物對母本為北豆5號父本為天鵝蛋ZDD02114的群體的基因組DNA擴(kuò)展產(chǎn)物毛細(xì)管電泳圖；圖11Satt181的引物對母本為北豆5號父本為大明白豆子或艾卡166的群體的基因組DNA擴(kuò)展產(chǎn)物毛細(xì)管電泳圖；圖12Satt180的引物對母本為北豆5號父本為Biogedulote或艾卡166或瑞豐2號的群體的基因組DNA擴(kuò)展產(chǎn)物毛細(xì)管電泳圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例中:大豆蛋白質(zhì)含量測定全部使用FOSSInfratec1241谷物分析儀；毛細(xì)管電泳分析全部使用全自動毛細(xì)管電泳儀，AdvancedAnalyticalTechnologies(美國AATI公司)，型號FragmentAnalyzerTM。實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)材料的種植和蛋白質(zhì)含量檢測：(1)實(shí)驗(yàn)材料的種植和采樣資源材料：選取的是250份中國地區(qū)的主栽大豆品種。表1是250份資源的品種名稱及子粒蛋白質(zhì)含量。種植場所：吉林省農(nóng)科院。種植方法：1m行長，每行21粒種子。管理方法：同大田管理。采樣方法：營養(yǎng)生長階段，取植株頂端最幼嫩處葉片用于提取DNA、PCR反應(yīng)。收獲時(shí)按單株收取大豆子粒用于測定蛋白質(zhì)含量。驗(yàn)證材料：是以黑龍江省主栽大豆品種北豆5號作為輪回親本，與多馬卡·托利薩、坡黃、Harosoy、綠75、中特1號、NOVA、Century、東農(nóng)163、杜納吉卡、Amsoy、中豆27、95-5383、艾卡166、大明白豆子、東山69、瑞豐2號、中黃、Biogedulote和天鵝蛋ZDD02114這19個(gè)品種的大豆分別雜交，總共經(jīng)過兩次雜交和兩次回交之后收獲BC2F2。群體總共330個(gè)個(gè)體。種植場所：黑龍江省農(nóng)墾科研育種中心。種植方法：5m行長，每行100粒種子。管理方法：同大田管理。采樣方法：營養(yǎng)生長階段，取植株頂端最幼嫩處葉片用于提取DNA、PCR反應(yīng)。收獲時(shí)按單株收取大豆子粒用于測定蛋白質(zhì)含量。(2)蛋白質(zhì)含量的測定：分別測定上述資源材料和驗(yàn)證材料中每種大豆的子粒蛋白質(zhì)含量。使用步驟1)打開Infratec1241谷物分析儀的電源。2)當(dāng)儀器進(jìn)行完自檢預(yù)熱好之后，從應(yīng)用模型列表欄中通過上下鍵找到所需的模型。應(yīng)用模型名稱中有附加的“STM”的。3)將大豆子粒倒入樣品槽，之后支架裝入對接單元，注意有齒輪條的一側(cè)在右邊。向下輕輕按支架，以確保齒輪條和齒輪正確嚙合。將樣品槽支架放入對接單元，這時(shí)候要小心，以免損壞內(nèi)部的小齒輪。4)在鍵盤區(qū)按下分析鍵開始分析。FOSSInfratec1241谷物分析儀測出的數(shù)據(jù)是“.crd“格式。需要先轉(zhuǎn)換成EXCEL格式才能打開。導(dǎo)出數(shù)據(jù)步驟：IFT文件夾中包含Disk1,Disk2兩個(gè)目錄和一個(gè)說明文件，運(yùn)行Disk1目錄下的setup.exe。開始→FOSS→IFT；ResultData/CRD→TXT-format(columns)。在Sourcefolder中選擇20071030.crd的路徑，并在文件前選中√。再選擇輸出路徑，如Desktop，點(diǎn)擊Convertselected。為文件起名，保存。退出IFT。得到一個(gè)TXT文件。新建一個(gè)Excel，打開TXT文件，在文本導(dǎo)入向?qū)е羞x擇“分隔符號”點(diǎn)擊下一步，選擇“Tab鍵”和“逗號”，點(diǎn)擊下一步，點(diǎn)擊完成。就可以將FOSSInfratec1241谷物分析儀測得的大豆蛋白質(zhì)含量的數(shù)據(jù)用Excel格式打開。表1250份大豆資源名稱及其子粒蛋白質(zhì)含量實(shí)施例2DNA提取和PCR擴(kuò)增：(1)大豆葉片DNA的提取(250份資源大豆與驗(yàn)證材料330個(gè)個(gè)體均提取，每種大豆分別提取)1)將實(shí)施例1中取得的用于提取DNA、PCR反應(yīng)的新鮮葉片置于1.5ml離心管中，將離心管放在浸于液氮中的離心管架上，用塑料鉆頭低溫鉆磨，直至樣品變?yōu)榘咨?xì)粉末為止。2)打開水浴鍋預(yù)熱至65℃，同時(shí)將CTAB提取液(按照40ml：10μl加入巰基乙醇)加熱至65℃。溫度達(dá)到之后將每個(gè)離心管中加入0.7mlCTAB提取液，充分混勻之后，水浴40分鐘，并且間歇輕搖。3)將水浴之后的離心管中加入等體積氯仿，然后8000(轉(zhuǎn)/分)離心20分鐘。取上清液，再次加入等體積氯仿。離心8000(轉(zhuǎn)/分)20分鐘。4)取上清液加至預(yù)先預(yù)冷的0.7ml異丙醇中，直至DNA析出。5)用無水乙醇沖洗DNA，之后晾干，以80μl超純水溶解。6)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。電壓100V電流100A運(yùn)行20分鐘。注意事項(xiàng)：1)移液器黃色槍頭的尖端部分減去一小部分，防止剪切力破壞DNA結(jié)構(gòu))2)移液以及沖洗DNA的時(shí)候一定要緩慢輕柔，以免損壞DNA結(jié)構(gòu)表2用于提取大豆葉片DNA的CTAB提取液配方藥品名稱用量(200ml)CTAB4gNaCl13.364gEDTA1.48gTris-HCl(pH8.0)20ml超純水定容至200ml(2)PCR反應(yīng)選取分布在大豆DNA13個(gè)連鎖群上的29對引物(見表3)，利用選取的29對SSR引物對250份資源大豆的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過電泳分析：在表4所示體系中，按以下程序分別進(jìn)行擴(kuò)增，引物由上海生工合成。PCR程序：預(yù)變性94℃5分鐘；變性94℃40秒,退火47℃40秒,延伸72℃40秒,循環(huán)35次；延伸72℃5分鐘；4℃結(jié)束反應(yīng)。表3在大豆DNA13個(gè)連鎖群上選取的29對引物位置和序列表4PCR反應(yīng)(10μl體系)選取原則：1)盡量在13個(gè)連鎖群每條上都選取SSR引物2)一條連鎖群上選取的幾個(gè)引物遺傳距離盡量遠(yuǎn)(3)聚丙烯酰胺凝膠電泳：上述步驟(2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，得到表1所示的250個(gè)資源品種大豆和驗(yàn)證資源330個(gè)個(gè)體的DNA的29對引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物帶型，部分帶型見圖1。表5聚丙烯酰胺凝膠電泳藥品聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟將大板用酒精擦干凈，再均勻涂抹親和硅烷(酒精：親和硅烷：冰乙酸＝5ml：50μl：50μl)將耳板放入抽風(fēng)櫥內(nèi)，用酒精擦干凈，再均勻涂抹剝離硅烷。將干凈的邊條放在大板兩側(cè)，再蓋上耳板。兩塊板涂抹硅烷的一面要朝里。用夾子固定。將配置好的6％PA膠內(nèi)加入200μlAPS和50μlTEMED。均勻灌入大板和耳板之間，注意不要出現(xiàn)氣泡。將齒梳平滑一面朝里插入兩板之間5mm左右。調(diào)水平。靜置一小時(shí)左右即可使用上板，夾緊，將電泳槽內(nèi)倒入緩沖液TBE(上槽為1倍TBE，下槽為1/3倍TBE)。點(diǎn)樣槽里滴入少量染色劑，1800V電壓預(yù)電泳10分鐘左右。期間對PCR產(chǎn)物內(nèi)加入染色劑并作變性處理。將齒梳插入點(diǎn)樣槽(齒朝下)，點(diǎn)樣，1800V電壓運(yùn)行90分鐘。下板。取下耳板和邊條。銀染：1500ml蒸餾水中加入1500μl硝酸銀溶液。將大板浸泡在銀染溶液里20～30分鐘。蒸餾水沖洗半分鐘。10)顯影：1500ml蒸餾水，加入1500μl甲醛、3％NaOH和6.25gNa2CO3。將大板浸泡在銀染溶液里20～30分鐘。11)統(tǒng)計(jì)帶型，記錄數(shù)據(jù)，掃描。表6分層中的部分引物擴(kuò)增出的片段大小實(shí)施例3大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)等位基因分層評價(jià)：(1)大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)等位基因分層評價(jià)將實(shí)施例1得到的表1所示的250個(gè)資源品種中每個(gè)品種的蛋白質(zhì)含量的數(shù)據(jù)與實(shí)施例2(3)中得到的其帶型數(shù)據(jù)一一對應(yīng)，選取蛋白質(zhì)含量前40％和后40％利用MATLABR2009a卡方檢驗(yàn)分析等位基因的效應(yīng)值。以alpha＝0.01和0.1作為分層的閾值，將結(jié)果分為3個(gè)層次。其中當(dāng)檢驗(yàn)P值小于0.01時(shí)，我們認(rèn)為該位點(diǎn)為主效位點(diǎn)，而P值大于0.1時(shí)，認(rèn)為是微效位點(diǎn)，參考圖2，P值小于0.01水平(極顯著)的等位基因有Satt683-3、Satt578-4、Satt409-2和Satt079-1。顯著水平在0.1和0.01之間的有Satt181-2、Satt180-5、Satt126-1、Satt578-2、Satt584-5、Satt409-10、Sat_311-2、Sat_242-2、Satt578-6、Satt584-6、Satt713-1、Satt012-5、Sat_216-2、Sat_216-3、Satt584-2、Satt700-2和Satt369-2，其余的等位基因其顯著水平均大于0.1。經(jīng)過Minitab14.12T檢驗(yàn)之后參照圖3，顯著水平小于0.01的共有十個(gè)等位基因，與之前的卡方檢驗(yàn)到的4個(gè)極顯著等位基因?qū)Ρ戎驴梢园l(fā)現(xiàn)共有三個(gè)等位基因在卡方檢驗(yàn)和T檢驗(yàn)檢測下，均表現(xiàn)為極顯著，分別是Satt683-3、Satt578-4和Satt409-2。除了這三個(gè)極顯著水平的等位基因，其余的等位基因要么表現(xiàn)為一般顯著或是不顯著，要么就是在兩種檢驗(yàn)方法中的顯著水平不一致?？梢猿醪絽^(qū)分出主效基因和微效基因。(2)關(guān)鍵等位基因在北豆5號群體中的驗(yàn)證根據(jù)資源分層數(shù)據(jù)，選出極顯著水平的全部引物以及其他顯著水平較高的引物。進(jìn)行卡方檢驗(yàn)和T檢驗(yàn)。同時(shí)為了驗(yàn)證分層效果的成立，再選擇一個(gè)顯著性水平極低的引物。同樣進(jìn)行兩種分析。選取極顯著水平的等位基因Satt683-3、Satt578-4和Satt409-2，選取卡方檢測一般顯著而T檢測極顯著的等位基因Satt180-5、Satt181-2和Satt584-5，選取卡方檢測和T檢測都不顯著的等位基因Sat_174-2共7個(gè)等位基因的引物(表3)，以北豆5號為輪回親本的群體的330個(gè)個(gè)體的基因組DNA為模板，在表4所示體系中，按以下程序分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過電泳分析。引物由上海生工合成。部分電泳圖見圖4。統(tǒng)計(jì)帶型。PCR程序：預(yù)變性94℃5分鐘；變性94℃40秒，退火47℃40秒，延伸72℃40秒，循環(huán)35次；延伸72℃5分鐘；4℃結(jié)束反應(yīng)。與本實(shí)施例(1)對資源的帶型數(shù)據(jù)處理方法相同，對7對引物在北豆5號群體中的帶型數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)和T檢驗(yàn):將北豆5號導(dǎo)入系群體個(gè)體(驗(yàn)證資源330個(gè)個(gè)體)的蛋白質(zhì)含量的數(shù)據(jù)與帶型數(shù)據(jù)一一對應(yīng)以蛋白質(zhì)含量為關(guān)鍵字全排序。選出前40％和后40％利用MATLABR2009a進(jìn)行卡方檢驗(yàn)打開Minitab14.12進(jìn)行T檢驗(yàn)。驗(yàn)證卡方檢驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果如圖5和圖6。從以上兩張圖可以看出，Satt683-3在兩種檢測中依然都是極顯著，說明該等位基因確實(shí)屬于大豆子粒蛋白質(zhì)含量的主效基因。Satt409-2在T檢驗(yàn)中仍是極顯著，盡管卡方檢驗(yàn)結(jié)果有所下降，但是仍然保持在較高的水平。Satt180-5和Satt584-5卻表現(xiàn)出在兩種檢驗(yàn)中都為極顯著，再加上同上一輪分層評價(jià)表現(xiàn)一致的Satt181-2，可以判斷出這四種等位基因應(yīng)該屬于高效基因，只是其作用效果不如Satt683-3明顯。而Sat_174-2則與上一輪的結(jié)果完全一致，都為不顯著，說明該基因確實(shí)在增加蛋白質(zhì)含量這方面效應(yīng)值很低。意外的是在資源中顯著水平極高的引物Satt578的各等位基因在北豆群體中顯著水平極低，甚至未發(fā)現(xiàn)等位基因Satt578-4。這個(gè)極個(gè)別現(xiàn)象產(chǎn)生原因可能是北豆5號導(dǎo)入系群體的20個(gè)親本的基因組當(dāng)中沒有該基因，另外測量儀器不夠準(zhǔn)確等原因產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差也可能造成這種極個(gè)別現(xiàn)象發(fā)生。因此，雖然兩個(gè)群體中的分層評價(jià)略有出入，但差異并不大，總體上的層次還是比較明顯，那就是在資源中顯著水平較高的，在北豆5號群體中依然較高，不同引物的等位基因在兩個(gè)群體中的作用是一致的。這樣就可以認(rèn)為，對于這29個(gè)引物的等位基因分層評價(jià)其結(jié)論是準(zhǔn)確的。實(shí)施例4利用表型變化率驗(yàn)證分析等位基因加性效應(yīng)：本發(fā)明通過變化率來表示是否含有該等位基因的變化，這種變化率是基于資源或群體中個(gè)體成熟期后表型值差異，若某個(gè)等位基因?qū)Υ蠖棺恿５鞍踪|(zhì)含量有正方向的加性效應(yīng)，那么含有該等位基因的資源或群體個(gè)體的表型數(shù)據(jù)要比不含有該等位基因的資源或個(gè)體的要高，但是不排除標(biāo)記之間的互作和等位基因間的互作的影響。上述變化率的計(jì)算方法為：Rateofchange=ValueA-ValueBValueB×100%.]]>其中Rateofchange是變化率，ValueA代表含有A等位基因的個(gè)體或資源的蛋白質(zhì)含量表型值的平均值，ValueB代表含有B等位基因或不含有A等位基因的個(gè)體或資源的蛋白質(zhì)含量表型值的平均值。利用表型變化率進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)鍵等位基因加性效應(yīng)從理論上講，存在某等位基因的大豆品種其蛋白質(zhì)含量如果高于不存在該等位基因的大豆品種，那么則說明該等位基因?qū)τ诘鞍踪|(zhì)含量這一數(shù)量性狀表現(xiàn)為正向調(diào)控的正相關(guān)基因。反之，該等位基因則是負(fù)相關(guān)的基因。本發(fā)明選擇了經(jīng)過兩次分層評價(jià)篩選得到的5條極顯著等位基因，選出含有這5條等位基因的北豆5號小群體(表7)。通過重要引物等位基因在資源和北豆5號群體中對蛋白質(zhì)含量產(chǎn)生的變化率來進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如圖7。篩選之后得到幾個(gè)引物及等位基因相應(yīng)的驗(yàn)證群體。群體的母本是北斗5號，父本見表7。表7篩選得到群體用于關(guān)鍵等位基因從表中可以明確看出這5個(gè)等位基因?qū)Y源和群體中大豆子粒蛋白質(zhì)含量的影響效果是一致的。Satt683-3、Satt409-2和Satt584-5這三條等位基因在兩個(gè)群體中的變化率都是正的，說明他們對于大豆蛋白含量這個(gè)性狀表現(xiàn)的是正相關(guān)，即該等位基因在大豆子粒中的作用是促進(jìn)大豆蛋白質(zhì)含量增加。而Satt181-2和Satt180-5在兩個(gè)群體中的變化率都是負(fù)的，證明這兩個(gè)等位基因?qū)τ诖蠖沟鞍缀窟@個(gè)性狀表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)，即該等位基因在大豆子粒中的作用是抑制大蛋白質(zhì)含量增加。實(shí)施例5等位基因位點(diǎn)在分子標(biāo)記育種中的應(yīng)用QTL位點(diǎn)Satt683的引物(SEQIDNO.1、SEQIDNO.2)、QTL位點(diǎn)Satt409的引物(SEQIDNO.3、SEQIDNO.4)、QTL位點(diǎn)Satt584的引物(SEQIDNO.5、SEQIDNO.6)、QTL位點(diǎn)Satt181的引物(SEQIDNO.7、SEQIDNO.8)、QTL位點(diǎn)Satt180的引物(SEQIDNO.9、SEQIDNO.10)，以北豆5號為輪回親本的群體的330個(gè)個(gè)體的基因組DNA為模板，在表4所示體系中，按以下程序分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過毛細(xì)管電泳分析(步驟和參數(shù)參照儀器說明)。引物由上海生工合成。PCR程序：預(yù)變性94℃5分鐘；變性94℃40秒,退火47℃40秒,延伸72℃40秒,循環(huán)35次；延伸72℃5分鐘；4℃結(jié)束反應(yīng)。毛細(xì)管電泳分析結(jié)果表明，Satt683的引物對母本為北豆5號父本為天鵝蛋ZDD02114的群體的基因組DNA擴(kuò)展出了大小為410bp的分子標(biāo)記片段(圖8)，說明該群體基因組DNA中含有提高大豆蛋白含量的Satt683-3等位基因；Satt409的引物對母本為北豆5號父本為天鵝蛋ZDD02114或中黃的群體的基因組DNA擴(kuò)展出了大小為330bp的分子標(biāo)記片段(圖9)，說明該群體基因組DNA中含有提高大豆蛋白含量的Satt409-2等位基因；Satt584的引物對母本為北豆5號父本為天鵝蛋ZDD02114的群體的基因組DNA擴(kuò)展出了大小為300bp的分子標(biāo)記片段(圖10)，說明該群體基因組DNA中含有提高大豆蛋白含量的Satt584-5等位基因；Satt181的引物對母本為北豆5號父本為大明白豆子或艾卡166的群體的基因組DNA擴(kuò)展出了大小為280bp的分子標(biāo)記片段(圖11)，說明該群體基因組DNA中含有降低大豆蛋白含量的Satt181-2等位基因；Satt180的引物對母本為北豆5號父本為Biogedulote或艾卡166或瑞豐2號的群體的基因組DNA擴(kuò)展出了大小為300bp的分子標(biāo)記片段(圖12)，說明該群體基因組DNA中含有降低大豆蛋白含量的Satt180-5等位基因。當(dāng)前第1頁1 2 3