本發(fā)明屬于藥物化合物領域，具體涉及一種源于真菌的具有抗菌活性新的苯并吡喃酮化合物及其制備方法，以及它在制備抗菌藥物中的應用。
背景技術：
自上世紀80年代中期第一個由海洋真菌產(chǎn)生命名為Leptosphaerin的抗生素被報道以來，越來越多結構新穎，活性良好的化合物從海洋微生物中分離出來，為人類對抗疾病，提高生活質量提供了可靠地保障。在藥物開發(fā)中海洋天然產(chǎn)物占據(jù)了重要位置。在海洋微生物、無脊椎動物和海藻這三大海洋天然產(chǎn)物的來源中，海洋微生物是最具有潛力和發(fā)展前景的，越來越多的科研專家將目光投向了遼闊的海洋，以期待發(fā)現(xiàn)人類所迫切需要的藥源化合物。
紅樹林因其不同于陸地植物的生活環(huán)境，其內源微生物也從根本上有別于陸地微生物，生長在紅樹林環(huán)境中的微生物一般都耐酸、耐鹽、能適應強還原性的環(huán)境，他們的這些特點是非常具有特色的，他們之所以與眾不同，一定有著其獨特的生理代謝方式，這就會帶給我們各種各樣新穎獨特的代謝產(chǎn)物。紅樹林內生真菌次級代謝產(chǎn)物的研究也因此成為熱點，一批骨架新穎獨特，生物活性顯著的化合物已得到了分離和鑒定。
本發(fā)明所用的紅樹林真菌青霉Penicillium sp.9EB于2016年03月30日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所內的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO：3.15553。
技術實現(xiàn)要素：
為了解決上述現(xiàn)有技術中存在的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種苯并吡喃酮化合物，該化合物來源于海洋紅樹林內生真菌。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述苯并吡喃酮化合物的制備方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述苯并吡喃酮化合物在制備抗菌藥物中的應用。
本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：
一種苯并吡喃酮化合物，該化合物具有如式(Ⅰ)所示的結構：
命名為：(S)-7,8-dihydroxy-2-(2-hydroxypropyl)-5-methyl-4H-chromen-4-one
上述苯并吡喃酮化合物的制備方法，包括以下步驟：
(1)紅樹林真菌青霉Penicillium sp.9EB的種子培養(yǎng)：
將種子培養(yǎng)基制成試管斜面，挑取紅樹林真菌青霉Penicillium sp.9EB菌株接入斜面，在28～35℃條件下種子培養(yǎng)7～10天；
所述種子培養(yǎng)基由以下按重量份數(shù)計的組分組成：馬鈴薯15～25份，葡萄糖1.5～3份，瓊脂1.5～2.5份，海鹽0.3～3份，水100份；
所述紅樹林真菌青霉Penicillium sp.9EB于2016年03月30日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所內的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO：3.15553；
(2)紅樹林真菌青霉Penicillium sp.9EB的發(fā)酵培養(yǎng)：
將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25～35℃靜置1～2個月；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基是采用大米發(fā)酵培養(yǎng)基，大米發(fā)酵培養(yǎng)基由重量比為1：1～1.5的大米和海水組成；
(3)將發(fā)酵培養(yǎng)好的菌體用甲醇或乙酸乙酯或丙酮萃取多次，濃縮萃取液，將獲得的浸膏利用硅膠柱中進行色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇為洗脫劑梯度洗脫；
(4)收集體積比為2∶8～6∶4的乙酸乙酯-石油醚洗脫液，經(jīng)過硅膠正相色譜，采用體積比4：6的乙酸乙酯-石油醚洗脫液進行洗脫分離，再采用凝膠柱層析分離，制備型高效液相純化，即得到苯并吡喃酮化合物。
步驟(2)所述海水中的海鹽質量含量為3％。
上述苯并吡喃酮化合物在制備抗菌藥物中的應用。所述抗菌藥物是抗沙門氏菌或蠟狀芽孢桿菌的藥物。
本發(fā)明相對現(xiàn)有技術，具有如下的優(yōu)點及有益效果：本發(fā)明苯并吡喃酮化合物來源于海洋真菌，海洋真菌種類繁多、數(shù)量龐大，從真菌提取的方法簡單，新的苯并吡喃酮化合物來源豐富、制備成本低廉；苯并吡喃酮化合物具有抗沙門氏菌、蠟狀芽孢桿菌活性，應用前景廣闊。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例1苯并吡喃酮化合物的制備方法
(1)紅樹林真菌青霉Penicillium sp.9EB的種子培養(yǎng)：
將種子培養(yǎng)基制成試管斜面，挑取紅樹林真菌青霉Penicillium sp.9EB菌株接入斜面，在30℃條件下種子培養(yǎng)10天；
所述種子培養(yǎng)基由以下按重量份數(shù)計的組分組成：馬鈴薯15～25份，葡萄糖1.5～3份，瓊脂1.5～2.5份，海鹽0.3～3份，水100份；
(2)紅樹林真菌青霉Penicillium sp.9EB的發(fā)酵培養(yǎng)：
將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫35℃靜置1個月；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基是采用大米發(fā)酵培養(yǎng)基，大米發(fā)酵培養(yǎng)基由重量比為1：1～1.5的大米和海水(海鹽質量含量3％)組成；
(3)將發(fā)酵培養(yǎng)好的菌體用甲醇或乙酸乙酯或丙酮萃取多次，濃縮萃取液，將獲得的浸膏利用硅膠柱中進行色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇為洗脫劑梯度洗脫；
(4)收集體積比為2∶8～6∶4的乙酸乙酯-石油醚洗脫液，經(jīng)過硅膠正相色譜，采用體積比4：6的乙酸乙酯-石油醚洗脫液進行洗脫分離，以CHCl3-MeOH(1/1)凝膠柱層析分離，島津制備型高效液相純化，所用的色譜柱為Shim-pack PREP-ODS(H)KIT(250mm×20mm,5μm)，流動相為甲醇-水(65∶35)，流速為10mL·min-1，即得到棕色固體化合物I。
化合物I試驗數(shù)據(jù)：
化合物I:C13H14O5，外觀為棕色固體，易溶于甲醇，難溶于氯仿，HRESI-MS：251.09109(M+H)+(計算值251.09140),UVλmax(MeOH)nm(logε):205(2.10),237(1.84),259(2.00),299(1.50)；IRν/cm-1(KBr):3330,1642.
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ10.08(brs,OH),8.98(brs,OH),6.61(s,1H),5.95(s,1H),4.80(brs,OH),4.10(m,1H),2.61(dd,J＝6.4,3.3Hz,1H),2.57(s,2H),1.15(m,3H).
13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ179.29,165.18,149.10,148.54,131.36,129.64,116.13,115.19,111.52,64.47,43.40,23.92,22.13.
試驗數(shù)據(jù)分析所得化合物具有如式(Ⅰ)所示的結構：
實施例2 96孔板法檢測苯并吡喃酮化合物抗菌活性試驗
1.材料：
1.1供試菌種:蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)、藤黃八疊球菌(Sarcina luteus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙門氏菌(salmonella)
1.2主要儀器:上海博迅生化培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z型)、雷勃Labsystms酶標儀(MK3)、蘇凈集團超凈工作臺(SW-CJ-2FD)。
1.3 LB培養(yǎng)基制備
a.液態(tài)培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、pH＝7.0。
b.固態(tài)培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂粉10g～15g/L、pH＝7.0。
1.4樣品溶液的制備
根據(jù)化合物分子量的大小,稱取適量的樣品,用DMSO溶解配置20μmol/mL的樣品溶液1mL
1.5麥氏比濁法標準液的制備及菌懸液的制備
稱取1.1756g氯化鋇，蒸餾水定容置100ml，配制成0.048mol/L氯化鋇溶液，再量取1ml98％濃硫酸，加入99ml蒸餾水配成0.18mol/L硫酸溶液，0.048mol/L氯化鋇0.5ml加0.18mol/L硫酸溶液99.5混均勻后，該濁度為0.5麥氏比濁標準，相當1.5×108CFU/mL。
將供試菌其接種至LB固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12～18h后，挑取數(shù)個菌落置于無菌水中，用二倍稀釋法配制一系列不同濃度的菌液，用酶標儀測定一系列不同濃度菌液與0.5麥氏比標準液的吸光度，選取與0.5麥氏比標準液吸光度接近的菌液，再用LB液體培養(yǎng)基稀釋100倍，含菌量達106的工作濃度。
2.試驗方法
抑菌活性篩選用96孔板法。將96孔板留出一列分別做空白對照2孔、陽性對照3孔、陰性對照3孔，其中空白對照孔中加入200μL LB液態(tài)培養(yǎng)基，陰性對照孔加入198μL細菌菌懸液和2μL DMSO，陽性對照孔加入198μL細菌菌懸液和2μL DMSO配置的鹽酸環(huán)丙沙星溶液，其余樣品實驗孔各加入198μL細菌菌懸液和2μL樣品溶液。每個樣品設三個平行孔，重復三次，震蕩混勻，38℃靜止培養(yǎng)10-20h，用酶標儀測定其在630nm處的吸光度。
抑制率計算公式：抑菌率(％)＝(1–樣品的吸光度平均值/陰性對照)×100。計算得各化合物的抑制率。
最小抑菌濃度(MIC)實驗采用96孔板法。用二倍稀釋法，使最終樣品濃度為0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.0062、0.0031、0.0016μmol/mL。操作同抑菌活性的篩選實驗。
3.試驗結果
3.1化合物對細菌抑制作用的初篩
在96孔板法試驗中,2μL樣品溶液加入198μL細菌菌懸液中,樣品濃度稀釋100倍,終濃度為0.2μmol/mL。抑菌結果如表1。
表1化合物(濃度為0.2μmol/mL)對細菌的抑制率(％)
注：“-”表示沒有抑制作用
篩選結果表明:用96孔板對化合物I進行抑菌活性測試，陽性對照為鹽酸環(huán)丙沙星，在最高濃度0.2μmol/mL下，化合物I對沙門氏菌、蠟狀芽孢桿菌有較強抑制作用，對藤黃微球菌有中等強度的抑制作用，對白色葡萄球菌、大腸桿菌有較弱的抑制作用；對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌幾乎沒有抑制作用。3.2化合物I對細菌的最小抑菌濃度(MIC)的測定
選取化合物I幾乎有完全抑制作用的沙門氏菌做最小抑菌濃度測定。試驗結果顯示：化合物I對沙門氏菌最小抑菌濃度(MIC)為0.2μmol/mL。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。