本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及戊糖乳桿菌SS6在產(chǎn)γ-氨基丁酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

γ-氨基丁酸（GABA）有許多重要的生理功能，如抗焦慮、降血壓、降血糖、改善睡眠、修復(fù)皮膚（抑制炎癥，刺激表皮細(xì)胞再生）、調(diào)節(jié)激素等?，F(xiàn)階段隨著對(duì)GABA生理和藥理功能的不斷研究和開發(fā)，已經(jīng)作為一種新型的功能性因子應(yīng)用于食品和藥品等行業(yè)中。

在早期，富集生產(chǎn)γ-氨基丁酸主要以化學(xué)合成、植物富集和通過(guò)大腸桿菌發(fā)酵為主，但存在著安全性差，成本高，環(huán)境污染嚴(yán)重，富集含量低和食用安全性等問(wèn)題，所以尋找可利用的食用級(jí)安全性菌株在微生物法富集γ-氨基丁酸方面具有潛在的意義和價(jià)值。

現(xiàn)有技術(shù)分離得到的產(chǎn)γ-氨基丁酸的微生物多為真菌，真菌生長(zhǎng)較為緩慢，不能滿足生產(chǎn)需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供現(xiàn)有技術(shù)分離得到的產(chǎn)γ-氨基丁酸的微生物多為真菌，真菌生長(zhǎng)較為緩慢，不能滿足生產(chǎn)需要。

本發(fā)明的目的是提供戊糖乳桿菌SS6在產(chǎn)γ-氨基丁酸中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

戊糖乳桿菌SS6在產(chǎn)γ-氨基丁酸中的應(yīng)用，所述戊糖乳桿菌SS6保藏在廣東省微生物菌種保藏中心，保藏地址是廣東省微生物研究所，保藏日期為2016年10月13日，保藏編號(hào)為GDMCC No：60086。

本發(fā)明通過(guò)篩選獲得一株可產(chǎn)γ-氨基丁酸的戊糖乳桿菌SS6，本發(fā)明戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）SS6的16s rDNA的序列如SEQ ID NO：1所示，通過(guò)16S rDNA序列比對(duì)分析，與序列號(hào)為JN415155.1的戊糖乳桿菌PIS23菌株的16S rDNA序列的同源性最高，相似性為99%，通過(guò)結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長(zhǎng)條件、生理生化鑒定結(jié)果確定戊糖乳桿菌SS6屬于乳桿菌屬（Lactobacillus），為戊糖乳桿菌亞種（Lactobacillus pentosus）。

所述戊糖乳桿菌SS6為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀，無(wú)鞭毛，無(wú)菌膜，無(wú)莢膜；長(zhǎng)1.5～3.0μm，寬0.7～0.8μm，菌落呈圓形，顏色為乳白色，表面光滑不透明，邊緣整齊。

戊糖乳桿菌SS6為厭氧菌，接觸酶試驗(yàn)呈陰性，氧化酶試驗(yàn)呈陰性，明膠液化試驗(yàn)呈陰性，硫化氫試驗(yàn)呈陰性，吲哚試驗(yàn)呈陰性，酪素水解試驗(yàn)呈陰性，精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn)呈陰性，脲酶試驗(yàn)呈陰性，七葉苷水解試驗(yàn)呈陽(yáng)性。

γ-氨基丁酸作為新型功能因子，具有降低血壓的作用，因此可將該戊糖乳桿菌SS6擴(kuò)大培養(yǎng)用于發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸。

具體地，所述的戊糖乳桿菌SS6在產(chǎn)γ-氨基丁酸中的應(yīng)用，是將戊糖乳桿菌SS6接種于液體培養(yǎng)基中30～37℃下培養(yǎng)36～48h。

更優(yōu)選地，所述液體培養(yǎng)基的組成為每升培養(yǎng)基中含有5g酵母提取物、5g胰蛋白胨、10g葡萄糖、5g丁二酸鈉、20mg L-Glu，余量為蒸餾水。

最優(yōu)選地，戊糖乳桿菌SS6接種于液體培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)36h，pH值為5.8，所述戊糖乳桿菌SS6的接種量為2%。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了戊糖乳桿菌SS6在產(chǎn)γ-氨基丁酸中的應(yīng)用，所述戊糖乳桿菌SS6保藏在廣東省微生物菌種保藏中心，保藏地址是廣東省微生物研究所，保藏日期為2016年10月13日，保藏編號(hào)為GDMCC No：60086，利用該菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA，含量可達(dá)3.09mg/mL，GABA具有降血壓、促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌和降低膽固醇等多種有益的保健功能，為開發(fā)新的富含γ-氨基丁酸的保健食品提供依據(jù)，將所述戊糖乳桿菌SS6應(yīng)用于富含GABA的食品、保健品的開發(fā)，具有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）SS6和相近菌株的16s rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡(jiǎn)單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

乳酸菌分離培養(yǎng)基（1000mL）由10g酵母膏、10g牛肉膏、10g蛋白胨、5g葡萄糖、1ml吐溫-80、20g碳酸鈣、200g西紅柿汁、0.1g溴甲酚綠、15g瓊脂粉和余量的蒸餾水組成，調(diào)節(jié)pH至5.8～6.5，于121℃高壓滅菌30min。

MRS培養(yǎng)基（1000mL）由10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、2g檸檬酸氫二銨[(NH₄)₂HC₆H₅O₇]、20g葡萄糖、1mL吐溫-80、5g乙酸鈉（CH₃COONa-3H₂O）、2g磷酸氫二鉀（K₂HPO₄·3H₂O）、0.58g硫酸鎂（MgSO₄.7H₂O）、0.25g硫酸鎂（MnSO₄·H₂O）、15g瓊脂粉和余量的蒸餾水組成，調(diào)節(jié)pH至5.8～6.5，于121℃高壓滅菌30min。

MRS液體培養(yǎng)基（1000mL）由10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、2g檸檬酸氫二銨[(NH₄)₂HC₆H₅O₇]、20g葡萄糖、1mL吐溫-80、5g乙酸鈉（CH₃COONa-3H₂O）、2g磷酸氫二鉀（K₂HPO₄·3H₂O）、0.58g硫酸鎂（MgSO₄.7H₂O）、0.25g硫酸鎂（MnSO₄·H₂O）和余量的蒸餾水組成，調(diào)節(jié)pH至5.8～6.5，于121℃高壓滅菌30min。

發(fā)酵培養(yǎng)基TYG（1000mL）由5g酵母提取物、5g胰蛋白胨、10g葡萄糖、5g丁二酸鈉、20mg L-Glu和余量的蒸餾水組成，調(diào)節(jié)pH至5.8～6.5，于121℃高壓滅菌30min。

實(shí)施例1 菌株的分離、篩選與鑒定

菌株分離：選取健康生長(zhǎng)桑樹上的成熟桑葚果實(shí)，于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌水沖洗3次后用無(wú)菌濾紙吸干水分，切成1cm小片段置于研砵研磨出汁，吸取100μL果汁于MRS液體培養(yǎng)基中，于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d，待液體培養(yǎng)基變得渾濁按梯度稀釋法稀釋菌液，吸取稀釋度為10^-5和10^-6的菌體稀釋液100μL于乳酸菌分離培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3d，待乳酸菌分離培養(yǎng)基中長(zhǎng)出菌落（出現(xiàn)圓形乳白或黃色菌落），周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步確定為菌株SS6，挑取變色圈最大的菌落于MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)。

對(duì)篩選得到的菌株SS6進(jìn)行分子鑒定，委托生工生物工程(上海)股份有限公司對(duì)篩選得到的SS6的16S rDNA進(jìn)行測(cè)序。

菌株SS6的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1472bp，其序列如SEQ ID NO：1所示，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，然后用軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（如圖1所示），以確定菌株的種屬關(guān)系。同源性分析結(jié)果表明，該序列與序列號(hào)為JN415155.1的戊糖乳桿菌PIS23菌株的16S rDNA序列的同源性最高，相似性為99%，通過(guò)委托廣東省微生物分析檢測(cè)中心結(jié)合菌體形態(tài)、生長(zhǎng)條件、生理生化鑒定結(jié)果確定菌株SS6屬于乳桿菌屬（Lactobacillus），戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）亞種，因此稱為戊糖乳桿菌SS6。

菌株菌落形態(tài)鑒定：戊糖乳桿菌SS6為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀，無(wú)鞭毛，無(wú)莢膜；在MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈圓形，顏色為乳白色，表面光滑不透明，邊緣整齊。

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第九版和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠主編 科學(xué)出版社）對(duì)戊糖乳桿菌SS6進(jìn)行生理生化鑒定：戊糖乳桿菌SS6為厭氧菌，接觸酶試驗(yàn)呈陰性，氧化酶試驗(yàn)呈陰性，明膠液化試驗(yàn)呈陰性，硫化氫試驗(yàn)呈陰性，吲哚試驗(yàn)呈陰性，酪素水解試驗(yàn)呈陰性，精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn)呈陰性，脲酶試驗(yàn)呈陰性，七葉苷水解試驗(yàn)呈陽(yáng)性，結(jié)果見表1。

以幼齡斜面培養(yǎng)物穿刺接種于休和利夫森二氏（半固體）培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)72h后觀察。如指示劑變黃，表示產(chǎn)酸，為陽(yáng)性；不變或變藍(lán)（紫）則為陰性，結(jié)果如表2。

戊糖乳桿菌SS6可在MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)溫度為35℃，最適生長(zhǎng)環(huán)境的pH值為5.8～6.5。

戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）SS6，保藏在廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），保藏地址是廣東省微生物研究所，廣州市先烈中路中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓，保藏日期為2016年10月13日，保藏編號(hào)為GDMCC No：60086。

實(shí)施例2 菌株的培養(yǎng)

1、戊糖乳桿菌SS6的活化：在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作，用接種環(huán)挑取戊糖乳桿菌SS6，在平板培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基）上用接種環(huán)劃線，在30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2d。

2、戊糖乳桿菌SS6發(fā)酵樣品的制備：將分離得到的戊糖乳桿菌SS6接種于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基TYG中，30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2d，將發(fā)酵混合物沸水浴10min，以10000r/min離心10min，取上層液體即得發(fā)酵液。

3、γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取1.0mL蒸餾水、濃度為1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL的γ-氨基丁酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，加入120μL 1mol/L LaCL₃溶液，混勻震蕩反應(yīng)15min，12 000 r/min離心5 min，取上清0.5 mL于1.5mL離心管中，加入300 μL 1mol/L的KOH，振蕩反應(yīng)5 min，12 000 r/min離心5 min。分別取上清液600 μL置于15mL具塞試管中，加pH 10.0的碳酸鹽緩沖液400 μL，60%的重蒸酚200 μL，混勻后再加入1mL 7.5% NaClO溶液，充分混勻。靜置3 min，于沸水浴中加熱10 min，后置冰浴中10 min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后，加入4.0 mL 60%乙醇溶液，以0號(hào)管為對(duì)照，于645 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，GABA濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4、取1mL待測(cè)戊糖乳桿菌SS6的發(fā)酵液，按上述步驟加入試劑后測(cè)定波長(zhǎng)645nm處的吸光值，作3個(gè)重復(fù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品γ-氨基丁酸的含量。

試驗(yàn)結(jié)果表明：戊糖乳桿菌SS6發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸的產(chǎn)量達(dá)3.09mg/mL，具有較高的產(chǎn)γ-氨基丁酸的能力，為開發(fā)新型的富含γ氨基丁酸的食品提供了依據(jù)。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 戊糖乳桿菌SS6在產(chǎn)γ-氨基丁酸中的應(yīng)用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1472

<212> DNA

<213> 戊糖乳桿菌SS6的16S rDNA序列

<400> 1

cccgtggcgg gctgccctat acatgcaagt cgaacgaact ctggtattga ttggtgcttg 60

catcatgatt tacatttgag tgagtggcga actggtgagt aacacgtggg aaacctgccc 120

agaagcgggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg cataacaact tggaccgcat 180

ggtccgagtt tgaaagatgg cttcggctat cacttttgga tggtcccgcg gcgtattagc 240

tagatggtgg ggtaacggct caccatggca atgatacgta gccgacctga gagggtaatc 300

ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 360

ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggg tttcggctcg 420

taaaactctg ttgttaaaga agaacatatc tgagagtaac tgttcaggta ttgacggtat 480

ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 540

cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa 600

agccttcggc tcaaccgaag aagtgcatcg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga 660

cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga 720

aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gtatgggtag caaacaggat 780

tagataccct ggtagtccat accgtaaacg atgaatgcta agtgttggag ggtttccgcc 840

cttcagtgct gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga 900

aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 960

tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat actatgcaaa tctaagagat tagacgttcc 1020

cttcggggac atggatacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080

ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttatcagttg ccagcattaa gttgggcact 1140

ctggtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1200

ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta caacgagttg cgaactcgcg 1260

agagtaagct aatctcttaa agccattctc agttcggatt gtaggctgca actcgcctac 1320

atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc 1380

cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca cccaaagtcg gtggggtaac 1440

cttttaggaa ccagccgcta agtgacagat gg 1472