本發(fā)明屬于生物礦物界面粘附材料領(lǐng)域，特別涉及多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物(PAMAM)是目前研究最為廣泛和深入的樹枝狀大分子之一，目前有使用羧酸根、阿侖膦酸、磷酸根來(lái)修飾聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物并驗(yàn)證了修飾后的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物對(duì)羥基磷灰石具有吸附作用。例如，CN 102166160 B公開了羧基改性聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物作為牙本質(zhì)再礦化誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，CN 103342819 B公開了端基為磷酸根的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物、其制備方法以及作為制備牙本質(zhì)和牙釉質(zhì)原位再礦化誘導(dǎo)劑的應(yīng)用。但是，經(jīng)過(guò)上述改性的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物僅被證實(shí)了對(duì)羥基磷灰石具有吸附作用，功能較為單一，因此，若能開發(fā)出功能更為豐富的改性聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，例如能夠應(yīng)用于生物礦化領(lǐng)域、蛋白質(zhì)結(jié)晶領(lǐng)域以及組織工程支架材料等多個(gè)領(lǐng)域的改性聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，對(duì)于拓展聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)a(chǎn)生積極的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物及其制備方法，并證明所述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物可作為生物礦物界面粘附材料的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，其結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)所示：

式(Ⅰ)中，n是所述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的代數(shù)，n＝1、2、3、4、5、6、7、8或9。

本發(fā)明所述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的制備方法，步驟如下：

(1)端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第一種溶液

將端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物溶解于無(wú)水二甲基亞砜中形成第一種溶液，所述端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物為1、2、3、4、5、6、7、8或9代端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，所述第一種溶液中端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的濃度為1～2g/mL；

②配制第二種溶液

將三乙胺溶解于第一種溶液中形成第二種溶液，所述三乙胺與第一種溶液中的端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的氨基的摩爾比為(1～2):1；

③合成

在氬氣保護(hù)條件下于-5～5℃將丙烯酰氯加入到第二種溶液中，在室溫反應(yīng)至少24h，然后經(jīng)透析、冷凍干燥，即得端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物；所述丙烯酰氯與第二種溶液中的端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的氨基的摩爾比為(1～2):1；

(2)帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第三種溶液

以步驟(1)制備的端基為丙烯酰基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，將所述溶質(zhì)溶解于去離子水中形成第三種溶液，所述去離子水的量以溶質(zhì)能在去離子水中完全溶解為限；

②配制第四種溶液

以結(jié)構(gòu)式如式(Ⅱ)所示的多肽為溶質(zhì)，將所述溶質(zhì)溶解于去離子水中形成第四種溶液，所述去離子水的量以溶質(zhì)能在去離子水中完全溶解為限；

③合成

將二甲基苯基磷加入第三種溶液中并混合均勻，然后加入第四種溶液并混合均勻，在密封條件下于室溫反應(yīng)至少24h，經(jīng)透析、冷凍干燥，即得帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物；

所述第四種溶液的加入量應(yīng)使第四種溶液中的巰基與第三種溶液中的碳碳雙鍵的摩爾比為(1～2):1，所述二甲基苯基磷與第四種溶液中的巰基的摩爾比為(0.000001～0.00001):1；

(3)多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第五種溶液

將氨水、二氧六環(huán)、濃度為2～6mol/L的氫氧化鈉水溶液混合均勻得到第五種溶液，第五種溶液中，氨水、二氧六環(huán)、氫氧化鈉的摩爾比為(15～25):(4～14):(1～6)；

②合成

以步驟(2)制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，將所述溶質(zhì)溶解于第五種溶液中，在密封條件下于室溫反應(yīng)至少24h，然后經(jīng)透析、冷凍干燥，即得多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物；所述第五種溶液的量以溶質(zhì)能在第五種溶液中完全溶解為限。

上述方法中，所述1、2、3、4、5、6、7、9代端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物是以乙二胺為起始核心，反復(fù)與丙烯酸甲酯通過(guò)Michael加成反應(yīng)后再與乙二胺通過(guò)酰胺化反應(yīng)制備而成的。

本發(fā)明還提供了上述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物作為生物礦物界面粘附材料的應(yīng)用。應(yīng)用時(shí)，將所述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物配制成水溶液使用，所述水溶液中，多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的濃度優(yōu)選為0.5～5.5mg/mL。實(shí)驗(yàn)表明：本發(fā)明所述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物對(duì)羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣等生物礦物具有牢固的吸附作用，并能在羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣表面吸附成膜；被本發(fā)明所述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物包裹的羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣表面經(jīng)過(guò)進(jìn)一步接枝全氟酰氯、膠原等功能基團(tuán)后，可形成新型的表面功能涂層材料，適用于涂覆在生物礦物材料表面使用。本發(fā)明所述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物能夠有效地將生物與礦物粘結(jié)在一起，可應(yīng)用于生物礦化領(lǐng)域、蛋白質(zhì)結(jié)晶領(lǐng)域、表面圖章/自清潔/抗污/抗菌材料領(lǐng)域以及組織工程支架材料領(lǐng)域。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1.本發(fā)明提供了一類新型結(jié)構(gòu)的改性聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物—多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，增加了改性聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的種類。

2.實(shí)驗(yàn)表明：本發(fā)明所述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物對(duì)羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣等生物礦物具有牢固的吸附作用，并能在羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣表面吸附成膜，可應(yīng)用于生物礦化領(lǐng)域(見實(shí)施例10～12)；被本發(fā)明所述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物包裹的羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣表面經(jīng)過(guò)進(jìn)一步地接枝全氟酰氯、膠原等功能基團(tuán)后，可形成作為用于生物礦物材料的新型表面功能涂層材料，從而應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)晶領(lǐng)域和組織工程支架材料領(lǐng)域(見實(shí)施例13～14)。與現(xiàn)有的改性聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物相比，本發(fā)明 所述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的功能更加豐富，可作為生物礦物界面的粘附材料應(yīng)用。

3.本發(fā)明還提供了上述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的制備方法，該方法采用常規(guī)原料及設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明所述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成過(guò)程示意圖；

圖2是實(shí)施例1制備的端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物的核磁氫譜；

圖3是實(shí)施例1制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的核磁氫譜；

圖4是實(shí)施例1制備的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物(SAP-G4)的結(jié)構(gòu)式；

圖5是實(shí)施例10中不同濃度的SAP-G4在磷酸鈣、羥基磷灰石、碳酸鈣粉末上的吸附量匯總圖；

圖6是實(shí)施例11中異硫氰酸熒光素標(biāo)記的SAP-G4在羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片上吸附后、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的SAP-G4在羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片上吸附后使用二甲基亞砜清洗后以及空白羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片的激光共聚焦顯微鏡照片，其中，圖6A、6D、6G是異硫氰酸熒光素標(biāo)記的SAP-G4在羥基磷灰石片、磷酸鈣片以及碳酸鈣片上的吸附后的激光共聚焦顯微鏡照片，圖6B、6E、6H是異硫氰酸熒光素標(biāo)記的SAP-G4在羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片上吸附后使用二甲基亞砜清洗后的激光共聚焦顯微鏡照片，圖6C、6F、6I是空白羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片的激光共聚焦顯微鏡照片；

圖7是實(shí)施例12中SAP-G4在羥基磷灰石片上吸附成膜后以及空白羥基磷灰石片的掃描電鏡照片，其中，圖7A～7C是SAP-G4在羥基磷灰石片上聚集成膜后不同放大倍數(shù)的掃描電鏡照片，圖7D～7F是不同放大倍數(shù)的羥基磷灰石片的掃面電鏡照片；

圖8是實(shí)施例12中SAP-G4在磷酸鈣片上吸附成膜后以及空白磷酸鈣片的掃描電鏡照片，其中，圖8A～8C是SAP-G4在磷酸鈣片上聚集成膜后不同放大倍數(shù)的掃描電鏡照片，圖8D～8F是不同放大倍數(shù)的磷酸鈣片的掃面電鏡照片；；

圖9是實(shí)施例12中SAP-G4在碳酸鈣片表面吸附成膜后以及空白碳酸鈣片的掃描電鏡照片，其中，圖9A～9C是SAP-G4在碳酸鈣片上聚集成膜后不同放大倍數(shù)的掃描電鏡照片，圖9D～9F是不同放大倍數(shù)的碳酸鈣片的掃面電鏡照片；

圖10是實(shí)施例13中全氟酰氯改性的SAP-G4包裹的羥基磷灰石片、磷酸鈣片以及碳酸鈣片，SAP-G4包裹的羥基磷灰石片、磷酸鈣片以及碳酸鈣片，以及空白空白羥基磷灰石片、 磷酸鈣片以及碳酸鈣片表面的水接觸角測(cè)試結(jié)果，其中，圖10A、10D、10G分別為空白羥基磷灰石片、磷酸鈣片以及碳酸鈣片表面水接觸角測(cè)試結(jié)果，圖10B、10E、10H分別為SAP-G4包裹的羥基磷灰石片、磷酸鈣片以及碳酸鈣片表面的水接觸角測(cè)試結(jié)果，圖10C、10F、10I分別為全氟酰氯改性的SAP-G4包裹的羥基磷灰石片、磷酸鈣片以及碳酸鈣片表面水接觸角測(cè)試結(jié)果；

圖11是實(shí)施例13中溶菌酶在全氟酰氯改性的SAP-G4包裹的羥基磷灰石片上結(jié)晶后的掃描電鏡照片；

圖12是實(shí)施例14中MG63細(xì)胞在膠原修飾的SAP-G4包裹的羥基磷灰石片上的粘附生長(zhǎng)后的共聚焦激光顯微鏡照片。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明所述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物及其制備方法與應(yīng)用作進(jìn)一步說(shuō)明。

下述實(shí)施例1～9中，步驟(2)中使用的多肽購(gòu)買自上海波泰生物科技有限公司，其結(jié)構(gòu)式如式(Ⅱ)所示：

下述實(shí)施例1～9中，所采用的1、2、3、4、5、6、7、9代端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物是以乙二胺為起始核心，反復(fù)與丙烯酸甲酯通過(guò)Michael加成反應(yīng)后再與乙二胺通過(guò)酰胺化反應(yīng)制備而成的。

實(shí)施例1

本實(shí)施例中，提供多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的制備方法，其合成路線如圖1所示，步驟如下：

(1)端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第一種溶液

在室溫、常壓條件下將6.9g 4代端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物(G4PAMAM)溶解于4mL無(wú)水二甲基亞砜中形成第一種溶液；所述第一種溶液中G4PAMAM的濃度為1.725g/mL；

②配制第二種溶液

在室溫、常壓條件下將三乙胺(TEA)溶解于第一種溶液中形成第二種溶液；所述三乙胺與第一種溶液中的G4PAMAM的氨基的摩爾比為1.1:1；

③合成

在0～5℃的冰水浴及氬氣保護(hù)條件下將丙烯酰氯(Acryloyl chloride)滴加到第二種溶液中，在室溫室溫、常壓條件下反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為7000道爾頓的透析袋透析1天，再冷凍干燥，即得端基為丙烯酰基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物約14.7g；所述丙烯酰氯與第二種溶液中的G4PAMAM的氨基的摩爾比為1.1:1；該步驟制備的端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物的核磁氫譜如圖2所示，圖2中化學(xué)位移5.5～6.2ppm處的峰說(shuō)明引入了雙鍵。

(2)帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第三種溶液

以步驟(1)制備的0.86g端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在常壓、室溫條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第三種溶液；

②配制第四種溶液

以4.57g結(jié)構(gòu)式如式(Ⅱ)所示的多肽為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第四種溶液；

③合成

將二甲基苯基磷(Dimethylphenylphosphine)加入第三種溶液中，在室溫、常壓攪拌0.5h即混合均勻，然后加入第四種溶液并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為2000道爾頓的透析袋透析1天，冷凍干燥，即得帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物；所述第四種溶液的加入量應(yīng)使第四種溶液中的巰基與第三種溶液中的碳碳雙鍵的摩爾比為1.1:1，所述二甲基苯基磷與第四種溶液中的巰基的摩爾比為0.000004:1；該步驟制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的核磁氫譜如圖3所示，圖3中化學(xué)位移7.5～8ppm處的峰說(shuō)明引入了多肽上面的Fmoc基團(tuán)。

(3)多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第五種溶液

在室溫、常壓條件下將氨水、二氧六環(huán)、濃度為4mol/L的氫氧化鈉水溶液混合均勻得到第五種溶液，第五種溶液中，氨水、二氧六環(huán)、氫氧化鈉的摩爾比為20:9:1；

②合成

以5g步驟(2)制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL第五種溶液中并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為3000道爾頓的透析袋透析72h，冷凍干燥，即得多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，記作SAP-G4，其結(jié)構(gòu)式如圖4所示。

實(shí)施例2

本實(shí)施例中，提供多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的制備方法，其合成路線如圖1所示，步驟如下：

(1)端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第一種溶液

在室溫、常壓條件下將5.17g 1代端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物(G1PAMAM)溶解于5.17mL無(wú)水二甲基亞砜中形成第一種溶液；所述第一種溶液中G1PAMAM的濃度為1g/mL；

②配制第二種溶液

在室溫、常壓條件下將三乙胺溶解于第一種溶液中形成第二種溶液；所述三乙胺與第一種溶液中的G1PAMAM的氨基的摩爾比為1.1:1；

③合成

在0～5℃的冰水浴及氬氣保護(hù)條件下將丙烯酰氯滴加到第二種溶液中，在室溫、常壓條件下反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為1000道爾頓的透析袋透析1天，再冷凍干燥，即得端基為丙烯酰基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物約5.9g；所述丙烯酰氯與第二種溶液中的G1PAMAM的氨基的摩爾比為1.1:1；

(2)帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第三種溶液

以步驟(1)制備的0.59g端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在常壓、室溫條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第三種溶液；

②配制第四種溶液

以結(jié)構(gòu)式如式(Ⅱ)所示的多肽為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第四種溶液，所述去離子水的量以溶質(zhì)能在去離子水中完全溶解為限；

③合成

將二甲基苯基磷加入第三種溶液中，在室溫、常壓攪拌0.5h即混合均勻，然后加入第四種溶液并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量 為2000道爾頓的透析袋透析1天，冷凍干燥，即得帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物；所述第四種溶液的加入量應(yīng)使第四種溶液中的巰基與第三種溶液中的碳碳雙鍵的摩爾比為1.1:1，所述二甲基苯基磷與第四種溶液中的巰基的摩爾比為0.000004:1；

(3)多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第五種溶液

在室溫、常壓條件下將氨水、二氧六環(huán)、濃度為4mol/L的氫氧化鈉水溶液混合均勻得到第五種溶液，第五種溶液中，氨水、二氧六環(huán)、氫氧化鈉的摩爾比為20:9:1；

②合成

以5g步驟(2)制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL第五種溶液中并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為3000道爾頓的透析袋透析72h，冷凍干燥，即得多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，記作SAP-G1。

實(shí)施例3

本實(shí)施例中，提供多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的制備方法，其合成路線如圖1所示，步驟如下：

(1)端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第一種溶液

在室溫、常壓條件下將1.4g 2代端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物(G2PAMAM)溶解于1.4mL無(wú)水二甲基亞砜中形成第一種溶液；所述第一種溶液中G2PAMAM的濃度為1g/mL；

②配制第二種溶液

在室溫、常壓條件下將三乙胺溶解于第一種溶液中形成第二種溶液；所述三乙胺與第一種溶液中的G2PAMAM的氨基的摩爾比為1:1；

③合成

在0～5℃的冰水浴及氬氣保護(hù)條件下將丙烯酰氯滴加到第二種溶液中，在室溫、常壓條件下反應(yīng)28h，然后在去離子水中用截留分子量為2000道爾頓的透析袋透析1天，再冷凍干燥，即得端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物約1.9g；所述丙烯酰氯與第二種溶液中的G2PAMAM的氨基的摩爾比為1:1；

(2)帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第三種溶液

以步驟(1)制備的1.2g端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在常壓、室溫條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第三種溶液；

②配制第四種溶液

以1.07g結(jié)構(gòu)式如式(Ⅱ)所示的多肽為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第四種溶液；

③合成

將二甲基苯基磷加入第三種溶液中，在室溫、常壓攪拌0.5h即混合均勻，然后加入第四種溶液并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)28h，然后在去離子水中用截留分子量為2000道爾頓的透析袋透析1天，冷凍干燥，即得帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物；所述第四種溶液的加入量應(yīng)使第四種溶液中的巰基與第三種溶液中的碳碳雙鍵的摩爾比為1:1，所述二甲基苯基磷與第四種溶液中的巰基的摩爾比為0.000001:1；

(3)多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第五種溶液

在室溫、常壓條件下將氨水、二氧六環(huán)、濃度為2mol/L的氫氧化鈉水溶液混合均勻得到第五種溶液，第五種溶液中，氨水、二氧六環(huán)、氫氧化鈉的摩爾比為15:4:3；

②合成

以5g步驟(2)制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL第五種溶液中并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)28h，然后在去離子水中用截留分子量為3000道爾頓的透析袋透析72h，冷凍干燥，即得多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，記作SAP-G2。

實(shí)施例4

本實(shí)施例中，提供多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的制備方法，其合成路線如圖1所示，步驟如下：

(1)端基為丙烯酰基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第一種溶液

在室溫、常壓條件下將3.2g 3代端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物(G3PAMAM)溶解于3.2mL無(wú)水二甲基亞砜中形成第一種溶液；所述第一種溶液中G3PAMAM的濃度為1g/mL；

②配制第二種溶液

在室溫、常壓條件下將三乙胺溶解于第一種溶液中形成第二種溶液；所述三乙胺與第一 種溶液中的G3PAMAM的氨基的摩爾比為2:1；

③合成

在0～5℃的冰水浴及氬氣保護(hù)條件下將丙烯酰氯滴加到第二種溶液中，在室溫、常壓條件下反應(yīng)30h，然后在去離子水中用截留分子量為4000道爾頓的透析袋透析1天，再冷凍干燥，即得端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物約7.1g；所述丙烯酰氯與第二種溶液中的G3PAMAM的氨基的摩爾比為2:1；

(2)帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第三種溶液

以步驟(1)制備的0.59g端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在常壓、室溫條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第三種溶液；

②配制第四種溶液

以0.57g結(jié)構(gòu)式如式(Ⅱ)所示的多肽為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第四種溶液；

③合成

將二甲基苯基磷加入第三種溶液中，在室溫、常壓攪拌0.5h即混合均勻，然后加入第四種溶液并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)30h，然后在去離子水中用截留分子量為2000道爾頓的透析袋透析1天，冷凍干燥，即得帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物；所述第四種溶液的加入量應(yīng)使第四種溶液中的巰基與第三種溶液中的碳碳雙鍵的摩爾比為2:1，所述二甲基苯基磷與第四種溶液中的巰基的摩爾比為0.00001:1；

(3)多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第五種溶液

在室溫、常壓條件下將氨水、二氧六環(huán)、濃度為6mol/L的氫氧化鈉水溶液混合均勻得到第五種溶液，第五種溶液中，氨水、二氧六環(huán)、氫氧化鈉的摩爾比為25:14:6；

②合成

以5g步驟(2)制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL第五種溶液中并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)30h，然后在去離子水中用截留分子量為3000道爾頓的透析袋透析72h，冷凍干燥，即得多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，記作SAP-G3。

實(shí)施例5

本實(shí)施例中，提供多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的制備方法，其合成路線如圖1 所示，步驟如下：

(1)端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第一種溶液

在室溫、常壓條件下將14.2g 5代端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物(G5PAMAM)溶解于7.1mL無(wú)水二甲基亞砜中形成第一種溶液；所述第一種溶液中G5PAMAM的濃度為2g/mL；

②配制第二種溶液

在室溫、常壓條件下將三乙胺溶解于第一種溶液中形成第二種溶液；所述三乙胺與第一種溶液中的G5PAMAM的氨基的摩爾比為1.1:1；

③合成

在0～5℃的冰水浴及氬氣保護(hù)條件下將丙烯酰氯滴加到第二種溶液中，在室溫、常壓條件下反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為2000道爾頓的透析袋透析1天，再冷凍干燥，即得端基為丙烯酰基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物約14.7g；所述丙烯酰氯與第二種溶液中的G5PAMAM的氨基的摩爾比為1.1:1；

(2)帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第三種溶液

以步驟(1)制備的1.8g端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在常壓、室溫條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第三種溶液；

②配制第四種溶液

以8.3g結(jié)構(gòu)式如式(Ⅱ)所示的多肽為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第四種溶液；

③合成

將二甲基苯基磷加入第三種溶液中，在室溫、常壓攪拌0.5h即混合均勻，然后加入第四種溶液并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為2000道爾頓的透析袋透析1天，冷凍干燥，即得帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物；所述第四種溶液的加入量應(yīng)使第四種溶液中的巰基與第三種溶液中的碳碳雙鍵的摩爾比為1.1:1，所述二甲基苯基磷與第四種溶液中的巰基的摩爾比為0.000004:1；

(3)多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第五種溶液

在室溫、常壓條件下將氨水、二氧六環(huán)、濃度為4mol/L的氫氧化鈉水溶液混合均勻得到 第五種溶液，第五種溶液中，氨水、二氧六環(huán)、氫氧化鈉的摩爾比為20:9:1；

②合成

以5g步驟(2)制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL第五種溶液中并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為3000道爾頓的透析袋透析72h，冷凍干燥，即得多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，記作SAP-G5。

實(shí)施例6

本實(shí)施例中，提供多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的制備方法，其合成路線如圖1所示，步驟如下：

(1)端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第一種溶液

在室溫、常壓條件下將28.8g 6代端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物(G6PAMAM)溶解于28.8mL無(wú)水二甲基亞砜中形成第一種溶液；所述第一種溶液中G6PAMAM的濃度為1g/mL；

②配制第二種溶液

在室溫、常壓條件下將三乙胺溶解于第一種溶液中形成第二種溶液；所述三乙胺與第一種溶液中的G6PAMAM的氨基的摩爾比為1.1:1；

③合成

在0～5℃的冰水浴及氬氣保護(hù)條件下將丙烯酰氯滴加到第二種溶液中，在室溫、常壓條件下反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為30000道爾頓的透析袋透析1天，再冷凍干燥，即得端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物約20.2g；所述丙烯酰氯與第二種溶液中的G6PAMAM的氨基的摩爾比為1.1:1；

(2)帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第三種溶液

以步驟(1)制備的2g端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在常壓、室溫條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第三種溶液；

②配制第四種溶液

以1.8g結(jié)構(gòu)式如式(Ⅱ)所示的多肽為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第四種溶液；

③合成

將二甲基苯基磷加入第三種溶液中，在室溫、常壓攪拌0.5h即混合均勻，然后加入第四種溶液并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為2000道爾頓的透析袋透析1天，冷凍干燥，即得帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物；所述第四種溶液的加入量應(yīng)使第四種溶液中的巰基與第三種溶液中的碳碳雙鍵的摩爾比為1.1:1，所述二甲基苯基磷與第四種溶液中的巰基的摩爾比為0.000004:1；

(3)多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第五種溶液

在室溫、常壓條件下將氨水、二氧六環(huán)、濃度為4mol/L的氫氧化鈉水溶液混合均勻得到第五種溶液，第五種溶液中，氨水、二氧六環(huán)、氫氧化鈉的摩爾比為20:9:1；

②合成

以5g步驟(2)制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL第五種溶液中并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后經(jīng)然后在去離子水中用截留分子量為3000道爾頓的透析袋透析72h，冷凍干燥，即得多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，記作SAP-G6。

實(shí)施例7

本實(shí)施例中，提供多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的制備方法，其合成路線如圖1所示，步驟如下：

(1)端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第一種溶液

在室溫、常壓條件下將5.8g 7代端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物(G7PAMAM)溶解于5.8mL無(wú)水二甲基亞砜中形成第一種溶液；所述第一種溶液中G7PAMAM的濃度為1g/mL；

②配制第二種溶液

在室溫、常壓條件下將三乙胺溶解于第一種溶液中形成第二種溶液；所述三乙胺與第一種溶液中的G7PAMAM的氨基的摩爾比為1.1:1；

③合成

在0～5℃的冰水浴及氬氣保護(hù)條件下將丙烯酰氯滴加到第二種溶液中，在室溫、常壓條件下反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為60000道爾頓的透析袋透析1天，再冷凍干燥，即得端基為丙烯酰基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物約7.2g；所述丙烯酰氯與第二種溶液中的G7PAMAM的氨基的摩爾比為1.1:1；

(2)帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第三種溶液

以步驟(1)制備的4g端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在常壓、室溫條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第三種溶液；

②配制第四種溶液

以3.6g結(jié)構(gòu)式如式(Ⅱ)所示的多肽為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第四種溶液；

③合成

將二甲基苯基磷加入第三種溶液中，在室溫、常壓攪拌0.5h即混合均勻，然后加入第四種溶液并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為2000道爾頓的透析袋透析1天，冷凍干燥，即得帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物；所述第四種溶液的加入量應(yīng)使第四種溶液中的巰基與第三種溶液中的碳碳雙鍵的摩爾比為1.1:1，所述二甲基苯基磷與第四種溶液中的巰基的摩爾比為0.000004:1；

(3)多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第五種溶液

在室溫、常壓條件下將氨水、二氧六環(huán)、濃度為4mol/L的氫氧化鈉水溶液混合均勻得到第五種溶液，第五種溶液中，氨水、二氧六環(huán)、氫氧化鈉的摩爾比為20:9:1；

②合成

以5g步驟(2)制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL第五種溶液中并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為3000道爾頓的透析袋透析72h，冷凍干燥，即得多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，記作SAP-G7。

實(shí)施例8

本實(shí)施例中，提供多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的制備方法，其合成路線如圖1所示，步驟如下：

(1)端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第一種溶液

在室溫、常壓條件下將11.6g 8代端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物(G8PAMAM)溶解于11.6mL無(wú)水二甲基亞砜中形成第一種溶液；所述第一種溶液中G8PAMAM的濃度為1g/mL；

②配制第二種溶液

在室溫、常壓條件下將三乙胺溶解于第一種溶液中形成第二種溶液；所述三乙胺與第一種溶液中的G8PAMAM的氨基的摩爾比為1.1:1；

③合成

在0～5℃的冰水浴及氬氣保護(hù)條件下將丙烯酰氯滴加到第二種溶液中，在室溫、常壓條件下反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為120000道爾頓的透析袋透析1天，再冷凍干燥，即得端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物約14.4g；所述丙烯酰氯與第二種溶液中的G8PAMAM的氨基的摩爾比為1.1:1；

(2)帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第三種溶液

以步驟(1)制備的8g端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在常壓、室溫條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第三種溶液；

②配制第四種溶液

以7.2g結(jié)構(gòu)式如式(Ⅱ)所示的多肽為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第四種溶液；

③合成

將二甲基苯基磷加入第三種溶液中，在室溫、常壓攪拌0.5h即混合均勻，然后加入第四種溶液并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為2000道爾頓的透析袋透析1天，冷凍干燥，即得帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物；所述第四種溶液的加入量應(yīng)使第四種溶液中的巰基與第三種溶液中的碳碳雙鍵的摩爾比為1.1:1，所述二甲基苯基磷與第四種溶液中的巰基的摩爾比為0.000004:1；

(3)多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第五種溶液

在室溫、常壓條件下將氨水、二氧六環(huán)、濃度為4mol/L的氫氧化鈉水溶液混合均勻得到第五種溶液，第五種溶液中，氨水、二氧六環(huán)、氫氧化鈉的摩爾比為20:9:1；

②合成

以5g步驟(2)制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL第五種溶液中并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為3000道爾頓的透析袋透析72h，冷凍干燥，即得多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，記作SAP-G8。

實(shí)施例9

本實(shí)施例中，提供多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的制備方法，其合成路線如圖1所示，步驟如下：

(1)端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第一種溶液

在室溫、常壓條件下將2.3g 9代端基為氨基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物(G9PAMAM)溶解于2.3mL無(wú)水二甲基亞砜中形成第一種溶液；所述第一種溶液中G9PAMAM的濃度為1g/mL；

②配制第二種溶液

在室溫、常壓條件下將三乙胺溶解于第一種溶液中形成第二種溶液；所述三乙胺與第一種溶液中的G9PAMAM的氨基的摩爾比為1.1:1；

③合成

在0～5℃的冰水浴及氬氣保護(hù)條件下將丙烯酰氯滴加到第二種溶液中，在室溫、常壓條件下反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為250000道爾頓的透析袋透析1天，再冷凍干燥，即得端基為丙烯?；木埘０?胺型樹枝狀聚合物約2.8g；所述丙烯酰氯與第二種溶液中的G9PAMAM的氨基的摩爾比為1.1:1；

(2)帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第三種溶液

以步驟(1)制備的1.6g端基為丙烯酰基的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在常壓、室溫條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第三種溶液；

②配制第四種溶液

以1.4g結(jié)構(gòu)式如式(Ⅱ)所示的多肽為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL去離子水中形成第四種溶液；

③合成

將二甲基苯基磷加入第三種溶液中，在室溫、常壓攪拌0.5h即混合均勻，然后加入第四種溶液并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為2000道爾頓的透析袋透析1天，冷凍干燥，即得帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物；所述第四種溶液的加入量應(yīng)使第四種溶液中的巰基與第三種溶液中的碳碳雙鍵的摩爾比為1.1:1，所述二甲基苯基磷與第四種溶液中的巰基的摩爾比為0.000004:1；

(3)多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物的合成

①配制第五種溶液

在室溫、常壓條件下將氨水、二氧六環(huán)、濃度為4mol/L的氫氧化鈉水溶液混合均勻得到第五種溶液，第五種溶液中，氨水、二氧六環(huán)、氫氧化鈉的摩爾比為20:9:1；

②合成

以5g步驟(2)制備的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物為溶質(zhì)，在室溫、常壓條件下將所述溶質(zhì)溶解于300mL第五種溶液中并混合均勻，在密封條件下于室溫、常壓反應(yīng)24h，然后在去離子水中用截留分子量為3000道爾頓的透析袋透析72h，冷凍干燥，即得多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，記作SAP-G9。

實(shí)施例10

本實(shí)施例中，測(cè)定實(shí)施例1制備的SAP-G4在羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣粉末上的吸附情況，所述羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣粉末的規(guī)格為HA/M30，其含水量低于0.1％。

將SAP-G4溶解在去離子水中，配制成SAP-G4濃度分別為0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL及1mg/mL的SAP-G4水溶液，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量前述5個(gè)濃度的SAP-G4水溶液在波長(zhǎng)為282nm處的吸光度值，得到SAP-G4濃度與吸光度值之間的線性關(guān)系，即標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將SAP-G4溶解在去離子水中，配制成SAP-G4濃度分別為0.25mg/mL、0.75mg/mL、1.25mg/mL、1.75mg/mL、2.25mg/mL及2.75mg/mL的SAP-G4水溶液，分別記作1～6#溶液。取量程為4mL的離心PE管12支，分別向其中加入50mg羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣粉末，然后取1～6#溶液各1mL加入離心PE管中，每個(gè)濃度的SAP-G4水溶液設(shè)置2支離心PE管，在37℃振蕩攪拌12h，然后對(duì)各離心PE管中的混合液以10000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心4分鐘，取離心所得上清液用紫外分光光度計(jì)測(cè)量上清液中SAP-G4的濃度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出吸附在羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣粉末上的SAP-G4的量。結(jié)果如圖5所示，SAP-G4在羥基磷灰石粉末(50mg)上的飽和吸附量為2.2mg(在濃度為2.25mg/mL時(shí)達(dá)吸附飽和)，在磷酸鈣粉末(50mg)上的飽和吸附量為1.8mg(在濃度為2.25mg/mL時(shí)達(dá)吸附飽和)，在碳酸鈣粉末(50mg)上的飽和吸附量為0.6mg(在濃度為1.25mg/mL時(shí)達(dá)吸附飽和)。

實(shí)施例11

本實(shí)施例中，測(cè)定實(shí)施例1制備的SAP-G4在羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片上的吸附情況，所述羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片的尺寸為8mm*2mm且含水量低于0.1％。

采用使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光標(biāo)記了的SAP-G4在羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳 酸鈣片表面的吸附狀況。熒光標(biāo)記物質(zhì)選擇異硫氰酸熒光素(FITC)，標(biāo)記方法參照VenugantiV V,Sahdev P,Hildreth M,et al.Structure-skin permeability relationship of dendrimers[J].Pharmaceutical research,2011,28(9):2246-2260。向SAP-G4的水溶液中加入等摩爾的FITC乙醇溶液，再加入1mol/L的NaOH溶液和等摩爾的EDC，攪拌3天，過(guò)濾后再透析3天，冷凍干燥后得到FITC標(biāo)記的SAP-G4。用去離子水將FITC標(biāo)記的SAP-G4配制成濃度為2.25mg/mL的溶液，用移液槍量取1mL FITC標(biāo)記的SAP-G4溶液浸泡羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片，浸泡1天后用PBS緩沖液沖洗3次，樣品烘干后用激光共聚焦顯微鏡觀察其表面的熒光分布情況，結(jié)果如圖6所示。

圖6A～C、圖6D～F、圖6G～I(xiàn)分別為羥基磷灰石片、磷酸鈣片以及碳酸鈣片的激光共聚焦顯微鏡照片，其中圖6A、6D、6G是FITC標(biāo)記的SAP-G4在上述三種片材上吸附后的激光共聚焦顯微鏡照片，圖6B、6E、6H是FITC標(biāo)記的SAP-G4在上述三種片材上吸附后使用二甲基亞砜清洗后的激光共聚焦顯微鏡照片，圖6A、6D、6G和圖6B、6E、6H中的樣品具有明顯的綠色熒光，且6A與6B、圖6D與6E、圖6G和6H的熒光強(qiáng)度相當(dāng)，圖6C、6F、6I是空白的上述三種片材的激光共聚焦顯微鏡照片，空白的上述片材沒有檢測(cè)到熒光。說(shuō)明本發(fā)明所述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物在羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片上具有良好的吸附性能。

實(shí)施例12

本實(shí)施例中，測(cè)定實(shí)施例1制備的SAP-G4在羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片上聚集成膜的情況，所述羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片的尺寸為8mm*2mm且含水量低于0.1％。

采用掃描電鏡觀察SAP-G4在羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片表面的聚集成膜情況。將SAP-G4溶解在去離子水中，配制成SAP-G4濃度為2.25mg/mL的SAP-G4水溶液，用移液槍量取1mLSAP-G4水溶液浸泡羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片，浸泡1天后用PBS緩沖液沖洗3次，然后烘干后用掃描觀察SAP-G4在羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片表面的聚集成膜情況。

圖7為SAP-G4在羥基磷灰石片上吸附成膜后以及空白羥基磷灰石片的掃描電鏡照片，圖7A～7C是SAP-G4在羥基磷灰石片上聚集成膜后不同放大倍數(shù)的掃描電鏡照片，圖7D～7F是不同放大倍數(shù)的羥基磷灰石片的掃面電鏡照片；圖8為SAP-G4在磷酸鈣片上吸附成膜后以及空白磷酸鈣片的掃描電鏡照片，圖8A～8C是SAP-G4在磷酸鈣片上聚集成膜后不同放大倍數(shù)的掃描電鏡照片，圖8D～8F是不同放大倍數(shù)的磷酸鈣片的掃面電鏡照片；圖9為SAP-G4 在碳酸鈣片表面吸附成膜后以及空白碳酸鈣片的掃描電鏡照片，圖9A～9C是SAP-G4在碳酸鈣片上聚集成膜后不同放大倍數(shù)的掃描電鏡照片，圖9D～9F是不同放大倍數(shù)的碳酸鈣片的掃面電鏡照片。由圖7～9可知，本發(fā)明所述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物在羥基磷灰石片、磷酸鈣片和碳酸鈣片上具有良好的聚集成膜性能。

實(shí)施例10～12說(shuō)明本發(fā)明所述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物可在生物礦化領(lǐng)域應(yīng)用。

實(shí)施例13

本實(shí)施例中，測(cè)定全氟酰氯改性的SAP-G4包裹羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片表面的情況，所述羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片的尺寸為8mm*2mm且含水量低于0.1％。

采用水接觸角來(lái)直觀地反應(yīng)全氟酰氯改性的SAP-G4包裹羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片表面的情況。將SAP-G4溶解在去離子水中，配制成SAP-G4濃度為2.25mg/mL的SAP-G4水溶液，用移液槍量取1mLSAP-G4水溶液浸泡羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片，浸泡1天后用PBS緩沖液沖洗3次，然后烘干，將所得SAP-G4包裹的羥基磷灰石片、磷酸鈣片、碳酸鈣片在全氟酰氯與三乙胺的乙醚溶液中浸泡4小時(shí)(將3mg全氟酰氯溶于3mL乙醚中，然后加入全氟酰氯10倍當(dāng)量的三乙胺得到)，然后在真空干燥箱中干燥1小時(shí)，用乙醚沖洗3此后用氮?dú)夂娓?，進(jìn)行水接觸角測(cè)試，結(jié)果如圖10所示。

圖10A、10D、10G分別為空白羥基磷灰石片、磷酸鈣片以及碳酸鈣片表面水接觸角測(cè)試結(jié)果，圖10B、10E、10H分別為SAP-G4包裹的羥基磷灰石片、磷酸鈣片以及碳酸鈣片表面的水接觸角測(cè)試結(jié)果，圖10C、10F、10I分別為全氟酰氯改性的SAP-G4包裹的羥基磷灰石片、磷酸鈣片以及碳酸鈣片表面水接觸角測(cè)試結(jié)果。圖中的ca.表示水接觸角(contact angle)，由10A、10D、10G、10G、10E、10H可知，空白的以及SAP-G4包裹的羥基磷灰石片、磷酸鈣片以及碳酸鈣片的水接觸角均＜90°，說(shuō)明這些表面是親水性的，而由圖10C、10F、10I可知，全氟酰氯改性的SAP-G4包裹的羥基磷灰石片、磷酸鈣片以及碳酸鈣片的水接觸角均＞90°，說(shuō)明這些表面是疏水性的。

超疏水表面有利于蛋白質(zhì)結(jié)晶(Gao A,Wu Q,Wang D,et al..Advanced Materials,2016,28(3):579-587.)，這說(shuō)明本實(shí)施例制備的全氟酰氯改性的SAP-G4包裹的三種疏水表面有利于蛋白質(zhì)結(jié)晶。以下通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)：

將100mg溶菌酶溶于1mL醋酸-醋酸鹽緩沖液(0.1mol/L，pH＝4.5)中得到溶菌酶溶液，取10微升該溶菌酶溶液滴加實(shí)施例13制備的全氟酰氯改性的SAP-G4包裹的羥基磷灰石片上，在封閉的充滿醋酸的濕潤(rùn)環(huán)境中于4℃反應(yīng)4小時(shí)，然后在室溫自然干燥并使用掃描電 鏡觀察溶菌酶在全氟酰氯改性的SAP-G4包裹的羥基磷灰石片上的結(jié)晶情況，結(jié)果如圖11所示，由圖10可知，全氟酰氯改性的SAP-G4包裹的羥基磷灰石片能誘導(dǎo)蛋白質(zhì)晶體生成，說(shuō)明，本發(fā)明所述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物經(jīng)全氟酰氯改性后，可用于蛋白質(zhì)結(jié)晶領(lǐng)域。

實(shí)施例14

將SAP-G4溶解在去離子水中，配制成SAP-G4濃度為2.25mg/mL的SAP-G4水溶液，用移液槍量取1mLSAP-G4水溶液浸泡羥基磷灰石片，浸泡1天后用PBS緩沖液沖洗3次，然后烘干，得到SAP-G4包裹的羥基磷灰石片。將所得SAP-G4包裹的羥基磷灰石片在膠原、羥基丁二酰亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的磷酸緩沖液中浸泡4小時(shí)，然后分別用磷酸緩沖液和去離子水沖洗3次，再用氮?dú)獯蹈?，得到膠原-SAP-G4包裹的羥基磷灰石片。將MG63細(xì)胞接種在膠原-SAP-G4包裹的羥基磷灰石片的表面，接種濃度大概為5000細(xì)胞/片，然后孵育1小時(shí)，用PBS緩沖液沖洗去除未貼壁的細(xì)胞，接著用4％的多聚甲醛固定30分鐘，用PBS緩沖液沖洗，細(xì)胞用鬼筆環(huán)肽染色30分鐘，然后用PBS和去離子水沖洗，最后采用共聚焦激光顯微鏡觀察，結(jié)果如圖12所示。

由圖12可知，在膠原-SAP-G4包裹的羥基磷灰石片出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞粘附生長(zhǎng)，說(shuō)明本發(fā)明所述多肽修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物在組織工程支架材料領(lǐng)域也具有應(yīng)用前景。